O estudo objetivou realizar um levantamento de doenças transmitidas por carrapatos em amostras de humanos e animais domésticos oriundos do Estado do Espírito Santo. Foram estudadas as Riquétsioses, Erliquiose, Babesiose, Borreliose, e especificamente em cães a Hepatozoonose canina. Três expedições científicas foram realizadas, onde foram coletadas amostras de sangue de humanos (n=201), cães (n=92) e eqüídeos (n=27). As amostras foram testadas utilizando-se os ensaios de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e ELISA Indireto, dependendo do antígeno de eleição. A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) foi realizada utilizando primers específicos para os gêneros dos agentes pesquisados. Foi possível concluir que os municípios estudados podem ser considerados endêmicos para as zoonoses pesquisadas / This study aimed to perform a survey on tick-borne diseases in blood samples from humans and domestic animals from the State of Espírito Santo. The following diseases were studied: Rickettsiosis, Ehrlichiosis, Babesiosis, Borreliosis, and specifically in dogs, Canine Hepatozoonosis. Three scientific expeditions were performed, where blood samples from humans (n=201), dogs (n=92) and equids (n=27) were collected. Samples were tested using Indirect Immunofluorescence Assays (IFA) and Indirect ELISA, depending on the antigen. Polymerase Chain Reactions (PCR) were performed using specific primers to the genera of the surveyed agents. We concluded that the studied municipalities can be considered endemic areas to the surveyed zoonosis

O estudo objetivou realizar um levantamento de doenças transmitidas por carrapatos em amostras de humanos e animais domésticos oriundos do Estado do Espírito Santo. Foram estudadas as Riquétsioses, Erliquiose, Babesiose, Borreliose, e especificamente em cães a Hepatozoonose canina. Três expedições científicas foram realizadas, onde foram coletadas amostras de sangue de humanos (n=201), cães (n=92) e eqüídeos (n=27). As amostras foram testadas utilizando-se os ensaios de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e ELISA Indireto, dependendo do antígeno de eleição. A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) foi realizada utilizando primers específicos para os gêneros dos agentes pesquisados. Foi possível concluir que os municípios estudados podem ser considerados endêmicos para as zoonoses pesquisadas / This study aimed to perform a survey on tick-borne diseases in blood samples from humans and domestic animals from the State of Espírito Santo. The following diseases were studied: Rickettsiosis, Ehrlichiosis, Babesiosis, Borreliosis, and specifically in dogs, Canine Hepatozoonosis. Three scientific expeditions were performed, where blood samples from humans (n=201), dogs (n=92) and equids (n=27) were collected. Samples were tested using Indirect Immunofluorescence Assays (IFA) and Indirect ELISA, depending on the antigen. Polymerase Chain Reactions (PCR) were performed using specific primers to the genera of the surveyed agents. We concluded that the studied municipalities can be considered endemic areas to the surveyed zoonosis

A Doença de Lyme-símile brasileira ou Síndrome Baggio-Yoshinari (SBY) é uma zoonose emergente, transmitida por carrapatos e até o momento, de descrição restrita ao território brasileiro. O agente etiológico da SBY era desconhecido até o presente trabalho. O objetivo principal do estudo foi identificar a etiologia da SBY. Foi selecionado 2 grupos de pacientes: grupo A (n=68) composto por pacientes com suspeita diagnóstica de SBY, a maioria na fase latente da doença; grupo B (n=10), composto por pacientes com diagnóstico de SBY, que apresentaram obrigatoriamente eritema migratório e que encontravam-se sintomáticos no momento da coleta. Foi utilizado também um grupo controle composto por indivíduos saudáveis e com epidemiologia negativa (n=50). Amostras de sangue foram coletadas para a realização de sorologias, culturas, análises microscópicas (óptica e eletrônica) e reação de cadeia da polimerase (PCR) para diferentes micro-organismos (Mycoplasma spp, Chlamydia spp e Borrelia spp). Além disso, foi realizado um estudo preliminar, através da PCR para Borrelia spp em 47 amostras de carrapatos oriundos de áreas de risco do Espírito Santo (sendo 17 Rhipicephalus microplus e 30 Rhipicephalus sanguineus), e amostras de sangue total de 27 bovinos e 26 equinos, animais estes oriundos da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Os resultados mostraram que a SBY não se trata de uma zoonose causada por um conjunto de micro-organismos como pensado inicialmente e sim pela Borrelia burgdorferi sensu lato. Descoberta essa que foi possível empregando-se novos primers amplificadores do principal gene envolvido na síntese do gancho flagelar da Borrelia, chamado flgE. A positividade para flgE foi confirmada em 6 pacientes do grupo B, 2 carrapatos, 1 bovino e 1 equino, os quais apresentaram homologia de 99% com o gene da proteína do gancho flagelar da Borrelia burgdorferi (flgE) depositado no GenBank (L43849). Esta importante descoberta, associada às pesquisas anteriores, permitiu definir a SBY como zoonose emergente e própria do país, causada pela bactéria B. burgdorferi na apresentação morfológica atípica, transmitida por carrapatos não pertencentes ao complexo Ixodes ricinus, responsável por manifestações clínicas semelhantes à Doença de Lyme, exceto pela grande frequência de sintomas recorrentes / Brazilian Lyme disease-like illness (BLDL) or Baggio-Yoshinari Syndrome (BYS) is an emerging zoonosis, transmitted by ticks and so far, restricted to the description of the Brazilian territory. The causative agent of BYS was unknown until now. The main objective of this study was to identify the etiology of BYS. We have selected two groups of patients: group A (n = 68) consisting of patients suspected of BYS, mostly in the latent stage of disease; group B (n = 10), composed of patients diagnosed with BYS, who had compulsorily erythema migrans and that were symptomatic at the time of blood collection. We also used a control group composed of healthy individuals with negative epidemiology (n = 50). Blood samples were collected, in which we performed serology, cultures, microscopic analysis (optical and electron) and polymerase chain reaction (PCR) for different microorganisms (Mycoplasma spp, Chlamydia spp and Borrelia spp). In addition, a preliminary study was conducted by PCR for Borrelia spp in 47 samples of ticks from risk areas at Espirito Santo State (being 17 Rhipicephalus microplus and 30 Rhipicephalus sanguineus), 27 cattle and 26 horses, being these animals from the Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. The results showed that BYS is not a zoonosis caused by a set of microorganisms as initially thought, but by Borrelia burgdorferi sensu lato. These findings were possible after employing new primers that are able to amplify portions of the main genes involved in the synthesis of the Borrelia flagellar hook protein, called flgE. We confirmed positivity for the flgE in 6 patients from group B, 2 ticks, a cow, and a horse, which showed 99% homology with the gene of Borrelia burgdorferi flagellar hook protein (flgE) deposited in GenBank (L43849). This important discovery, coupled with previous research, helped to define BYS as an emerging zoonosis particular from Brazil, caused by B. burgdorferi of atypical morphologic presentation, transmitted by ticks outside the Ixodes ricinus complex, responsible for clinical signs similar to Lyme disease, except for the high frequency of relapsing symptoms

A Doença de Lyme-símile brasileira ou Síndrome Baggio-Yoshinari (SBY) é uma zoonose emergente, transmitida por carrapatos e até o momento, de descrição restrita ao território brasileiro. O agente etiológico da SBY era desconhecido até o presente trabalho. O objetivo principal do estudo foi identificar a etiologia da SBY. Foi selecionado 2 grupos de pacientes: grupo A (n=68) composto por pacientes com suspeita diagnóstica de SBY, a maioria na fase latente da doença; grupo B (n=10), composto por pacientes com diagnóstico de SBY, que apresentaram obrigatoriamente eritema migratório e que encontravam-se sintomáticos no momento da coleta. Foi utilizado também um grupo controle composto por indivíduos saudáveis e com epidemiologia negativa (n=50). Amostras de sangue foram coletadas para a realização de sorologias, culturas, análises microscópicas (óptica e eletrônica) e reação de cadeia da polimerase (PCR) para diferentes micro-organismos (Mycoplasma spp, Chlamydia spp e Borrelia spp). Além disso, foi realizado um estudo preliminar, através da PCR para Borrelia spp em 47 amostras de carrapatos oriundos de áreas de risco do Espírito Santo (sendo 17 Rhipicephalus microplus e 30 Rhipicephalus sanguineus), e amostras de sangue total de 27 bovinos e 26 equinos, animais estes oriundos da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Os resultados mostraram que a SBY não se trata de uma zoonose causada por um conjunto de micro-organismos como pensado inicialmente e sim pela Borrelia burgdorferi sensu lato. Descoberta essa que foi possível empregando-se novos primers amplificadores do principal gene envolvido na síntese do gancho flagelar da Borrelia, chamado flgE. A positividade para flgE foi confirmada em 6 pacientes do grupo B, 2 carrapatos, 1 bovino e 1 equino, os quais apresentaram homologia de 99% com o gene da proteína do gancho flagelar da Borrelia burgdorferi (flgE) depositado no GenBank (L43849). Esta importante descoberta, associada às pesquisas anteriores, permitiu definir a SBY como zoonose emergente e própria do país, causada pela bactéria B. burgdorferi na apresentação morfológica atípica, transmitida por carrapatos não pertencentes ao complexo Ixodes ricinus, responsável por manifestações clínicas semelhantes à Doença de Lyme, exceto pela grande frequência de sintomas recorrentes / Brazilian Lyme disease-like illness (BLDL) or Baggio-Yoshinari Syndrome (BYS) is an emerging zoonosis, transmitted by ticks and so far, restricted to the description of the Brazilian territory. The causative agent of BYS was unknown until now. The main objective of this study was to identify the etiology of BYS. We have selected two groups of patients: group A (n = 68) consisting of patients suspected of BYS, mostly in the latent stage of disease; group B (n = 10), composed of patients diagnosed with BYS, who had compulsorily erythema migrans and that were symptomatic at the time of blood collection. We also used a control group composed of healthy individuals with negative epidemiology (n = 50). Blood samples were collected, in which we performed serology, cultures, microscopic analysis (optical and electron) and polymerase chain reaction (PCR) for different microorganisms (Mycoplasma spp, Chlamydia spp and Borrelia spp). In addition, a preliminary study was conducted by PCR for Borrelia spp in 47 samples of ticks from risk areas at Espirito Santo State (being 17 Rhipicephalus microplus and 30 Rhipicephalus sanguineus), 27 cattle and 26 horses, being these animals from the Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. The results showed that BYS is not a zoonosis caused by a set of microorganisms as initially thought, but by Borrelia burgdorferi sensu lato. These findings were possible after employing new primers that are able to amplify portions of the main genes involved in the synthesis of the Borrelia flagellar hook protein, called flgE. We confirmed positivity for the flgE in 6 patients from group B, 2 ticks, a cow, and a horse, which showed 99% homology with the gene of Borrelia burgdorferi flagellar hook protein (flgE) deposited in GenBank (L43849). This important discovery, coupled with previous research, helped to define BYS as an emerging zoonosis particular from Brazil, caused by B. burgdorferi of atypical morphologic presentation, transmitted by ticks outside the Ixodes ricinus complex, responsible for clinical signs similar to Lyme disease, except for the high frequency of relapsing symptoms

A doença de Lyme é uma doença causada pelas bactérias do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato que são transmitidas por carrapatos do complexo Ixodes ricinus. A distribuição geográfica dessas bactérias é confirmada no Hemisfério Norte (America do Norte, Europa e Ásia). Suspeita-se que uma enfermidade, compatível com doença de Lyme no Brasil, esteja provavelmente relacionada a uma espécie de Borrelia diferente das espécies causadoras de doença de Lyme no hemisfério Norte e que o vetor sejam carrapatos do gênero Amblyomma. Por estas razões, a doença brasileira passou a ser chamada de Doença de Lyme-Símile (DLS). A borreliose aviária é causada pela Borrelia anserina, que apresenta distribuição cosmopolita. É transmitida por carrapatos argasideos do gênero Argas. O presente trabalho foi dividido em dois capítulos: o primeiro investigou a presença de Borrelia spp em áreas onde foram relatados casos humanos de DLS no Estado de São Paulo. No segundo capítulo, é relatado o primeiro isolamento em meio BSK e a caracterização molecular de uma cepa de espiroqueta aviária presumidamente identificada como B. anserina, no Brasil. Para o primeiro capítulo, foram processados um total de 349 carrapatos Amblyomm cajennense adultos coletados em áreas com suspeita de DLS, nove amostras de sangue ou tecidos de pacientes humanos com diagnóstico clínico e sorológico de DLS, duas amostras de caldas de meio BSK previamente inoculado com tecidos ou sangue de pacientes com suspeita de DLS, e três amostras de caldas de meio BSK previamente inoculado com carrapatos coletados de áreas com suspeita de DLS. Essas amostras tiveram seu DNA extraído e testado pela nested-PCR com primers específicos para porções do gene flagelina B (flaB), aptos a amplificar porções deste gene de qualquer espécie de Borrelia. Todas as amostras foram negativas pela nested-PCR, não evidenciando a presença de Borrelia sp nas amostras avaliadas. Para o segundo capítulo, foi utilizada uma amostra de espiroqueta aviária originária de carrapatos Argas miniatus, colhidos em um galinheiro no Município de Pedro Leopoldo, MG. O isolamento in vitro e caracterização molecular da espiroqueta aviária foi feito a partir da inoculação de soro infectado, contendo espiroquetas viáveis, em meio BSK. O soro, baço, fígado e o próprio cultivo foram utilizado para amplificação na PCR para os genes rrs e flaB, seguido de seqüenciamento dos mesmos. O isolamento da espiroqueta foi obtido com sucesso, com várias passagens realizadas. A análise genética das seqüências do isolado mostrou 99.8% (483 de 484-bp) e 98.7% (754 de 764-bp) de similaridade às seqüências correspondentes dos genes rrs e flaB de B. anserina, respectivamente, disponíveis no GenBank. Pela análise filogenética inferida pela seqüência parcial do gene flaB, a cepa Brasileira agrupou-se com a seqüência de B. anserina dos EUA. Os resultados indicam a cepa brasileira estudada, designada de cepa PL, pertence à espécie B.anserina. / Lyme disease is caused by bacteria belonging to the complex Borrelia burgdorferi sensu lato, which are transmitted by ticks of the Ixodes ricinus complex. The distribution of these bacteria are restricted to the northern hemisphere (North America, Europe, and Asia). Lyme disease-like cases have been reported in Brazil, but it is possible that another Borrelia species is involved in these cases, and ticks of the genus Amblyomma have been implicated as vectors. Due to these reasons, the disease in Brazil has been referred as Lyme Disease-Simile (LDS). Borrelia anserina, the agent of avian spirochetosis, has a wordwide distribution, where it is transmitted primarily by ticks of the genus Argas. The present study was divided in two chapters: the first one evaluated the presence of Borrelia spp in areas of the state of São Paulo where LDS have been reported. The second chapter reports the first in vitro isolation in BSK medium and molecular characterization of a spirochete strain from Brazil, presumably identified as B. anserina. For the first chapter, a total of 349 adult ticks (Amblyomma cajennense) collected in areas where LDS cases have been reported were processed. In addition, nine human blood or tissue samples from patients with clinical and serological diagnostic of LDS, two samples from BSK medium previously inoculated with samples of skin or blood of LDS patients, and three samples of BSK medium previously inoculated with tick samples were also processed. All these samples were processed for DNA extraction and then tested by nested-PCR employing primers targeting a portion of the flagelin B gene (flaB),which amplify a flaB fragment in all known Borrelia species. All samples were negative by this nested-PCR, showing no evidence of Borrelia sp in the tested samples. The second chapter evaluated an avian spirochete strain originated from Argas miniatus ticks from Pedro Leopoldo municipality, state of Minas Gerais. DNA fragments of the rrs (16S rRNA) and flab genes were amplified by PCR and sequenced to determine phylogenetic similarities. The resulting sequences were 99.8% (483 of 484) and 98.7% (754 of 764) similar to GenBank corresponding sequences of B. anserina rrs and flaB genes, respectively. By neighbor-joining phylogenetic analysis, the flaB sequence of the Brazilian strain clustered in a monophyletic group with the sequence of B. anserina under 100% bootstrap support. The isolate was successfully isolated in BSK medium, with seven passages performed. The spirochete crude antigen, fixed in glass slides, showed strong immunfluorescence reactivity with sera from chickens previously inoculated with the isolate. The spirochete strain isolated in the present study was genetically identified as B. anserina, labeled as strain PL.

A doença de Lyme é uma doença causada pelas bactérias do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato que são transmitidas por carrapatos do complexo Ixodes ricinus. A distribuição geográfica dessas bactérias é confirmada no Hemisfério Norte (America do Norte, Europa e Ásia). Suspeita-se que uma enfermidade, compatível com doença de Lyme no Brasil, esteja provavelmente relacionada a uma espécie de Borrelia diferente das espécies causadoras de doença de Lyme no hemisfério Norte e que o vetor sejam carrapatos do gênero Amblyomma. Por estas razões, a doença brasileira passou a ser chamada de Doença de Lyme-Símile (DLS). A borreliose aviária é causada pela Borrelia anserina, que apresenta distribuição cosmopolita. É transmitida por carrapatos argasideos do gênero Argas. O presente trabalho foi dividido em dois capítulos: o primeiro investigou a presença de Borrelia spp em áreas onde foram relatados casos humanos de DLS no Estado de São Paulo. No segundo capítulo, é relatado o primeiro isolamento em meio BSK e a caracterização molecular de uma cepa de espiroqueta aviária presumidamente identificada como B. anserina, no Brasil. Para o primeiro capítulo, foram processados um total de 349 carrapatos Amblyomm cajennense adultos coletados em áreas com suspeita de DLS, nove amostras de sangue ou tecidos de pacientes humanos com diagnóstico clínico e sorológico de DLS, duas amostras de caldas de meio BSK previamente inoculado com tecidos ou sangue de pacientes com suspeita de DLS, e três amostras de caldas de meio BSK previamente inoculado com carrapatos coletados de áreas com suspeita de DLS. Essas amostras tiveram seu DNA extraído e testado pela nested-PCR com primers específicos para porções do gene flagelina B (flaB), aptos a amplificar porções deste gene de qualquer espécie de Borrelia. Todas as amostras foram negativas pela nested-PCR, não evidenciando a presença de Borrelia sp nas amostras avaliadas. Para o segundo capítulo, foi utilizada uma amostra de espiroqueta aviária originária de carrapatos Argas miniatus, colhidos em um galinheiro no Município de Pedro Leopoldo, MG. O isolamento in vitro e caracterização molecular da espiroqueta aviária foi feito a partir da inoculação de soro infectado, contendo espiroquetas viáveis, em meio BSK. O soro, baço, fígado e o próprio cultivo foram utilizado para amplificação na PCR para os genes rrs e flaB, seguido de seqüenciamento dos mesmos. O isolamento da espiroqueta foi obtido com sucesso, com várias passagens realizadas. A análise genética das seqüências do isolado mostrou 99.8% (483 de 484-bp) e 98.7% (754 de 764-bp) de similaridade às seqüências correspondentes dos genes rrs e flaB de B. anserina, respectivamente, disponíveis no GenBank. Pela análise filogenética inferida pela seqüência parcial do gene flaB, a cepa Brasileira agrupou-se com a seqüência de B. anserina dos EUA. Os resultados indicam a cepa brasileira estudada, designada de cepa PL, pertence à espécie B.anserina. / Lyme disease is caused by bacteria belonging to the complex Borrelia burgdorferi sensu lato, which are transmitted by ticks of the Ixodes ricinus complex. The distribution of these bacteria are restricted to the northern hemisphere (North America, Europe, and Asia). Lyme disease-like cases have been reported in Brazil, but it is possible that another Borrelia species is involved in these cases, and ticks of the genus Amblyomma have been implicated as vectors. Due to these reasons, the disease in Brazil has been referred as Lyme Disease-Simile (LDS). Borrelia anserina, the agent of avian spirochetosis, has a wordwide distribution, where it is transmitted primarily by ticks of the genus Argas. The present study was divided in two chapters: the first one evaluated the presence of Borrelia spp in areas of the state of São Paulo where LDS have been reported. The second chapter reports the first in vitro isolation in BSK medium and molecular characterization of a spirochete strain from Brazil, presumably identified as B. anserina. For the first chapter, a total of 349 adult ticks (Amblyomma cajennense) collected in areas where LDS cases have been reported were processed. In addition, nine human blood or tissue samples from patients with clinical and serological diagnostic of LDS, two samples from BSK medium previously inoculated with samples of skin or blood of LDS patients, and three samples of BSK medium previously inoculated with tick samples were also processed. All these samples were processed for DNA extraction and then tested by nested-PCR employing primers targeting a portion of the flagelin B gene (flaB),which amplify a flaB fragment in all known Borrelia species. All samples were negative by this nested-PCR, showing no evidence of Borrelia sp in the tested samples. The second chapter evaluated an avian spirochete strain originated from Argas miniatus ticks from Pedro Leopoldo municipality, state of Minas Gerais. DNA fragments of the rrs (16S rRNA) and flab genes were amplified by PCR and sequenced to determine phylogenetic similarities. The resulting sequences were 99.8% (483 of 484) and 98.7% (754 of 764) similar to GenBank corresponding sequences of B. anserina rrs and flaB genes, respectively. By neighbor-joining phylogenetic analysis, the flaB sequence of the Brazilian strain clustered in a monophyletic group with the sequence of B. anserina under 100% bootstrap support. The isolate was successfully isolated in BSK medium, with seven passages performed. The spirochete crude antigen, fixed in glass slides, showed strong immunfluorescence reactivity with sera from chickens previously inoculated with the isolate. The spirochete strain isolated in the present study was genetically identified as B. anserina, labeled as strain PL.