Universiẗat, Diss., 2003--Osnabrück.

University, Diss., 2004--Konstanz. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2003.

Universiẗat, Diss., 2004--Düsseldorf.

Proefschrift Maastricht. / Lit.opg.

Proefschrift Universiteit Maastricht. / Met bibliogr., lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Thesis (Ph. D.)--University of Texas at Austin, 2008. / Vita. Includes bibliographical references.

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O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, que tem, como hospedeiros definitivos, os canídeos, e, como hospedeiros intermediários mais comuns, ungulados domésticos e o homem. Este parasito é o agente etiológico da hidatidose cística, zoonose hiperendêmica no Cone Sul da América do Sul, incluindo o sul do Brasil. Para o estabelecimento e manutenção do cisto hidático por longos períodos de tempo (infecção crônica), o parasito secreta e expõe ao seu hospedeiro numerosas proteínas, que podem apresentar tanto atividade imunomoduladora, como estar relacionadas a atividades fisiológicas do parasito. As proteínas 14-3-3 constituem uma família altamente conservada de moléculas reguladoras eucarióticas, que são capazes de interagir com diferentes proteínas ligantes em diversos contextos celulares, regulando funções biológicas complexas. Em E. granulosus, foram identificadas cinco proteínas 14-3-3, sendo três isoformas ζ e duas isoformas ε. Essas proteínas podem estar envolvidas em interações parasito-hospedeiro que propiciam o estabelecimento e o desenvolvimento da forma larval patogênica (metacestódeo). Para a futura caracterização funcional da proteína 14-3-3e1 de E. granulousus (Eg14-3-3ε1), já detectada em componentes do metacestódeo, a sua sequência codificadora foi expressada em Escherichia coli. A clonagem foi realizada em dois vetores plasmidiais distintos (pGEX-TEV e pET-26b), para permitir a expressão em E. coli da proteína Eg14-3-3ε1 recombinante no citoplasma, em fusão com a GST, e no espaço periplásmatico, com cauda de histidina, respectivamente. A solubilização da Eg14-3-3ε1 em fusão com a GST foi obtida com 0,5% de sarcosil, mas no entanto não foi possível a sua purificação. A proteína Eg14-3-3ε1 com cauda de histidina foi obtida por extração da fração periplasmática seguida da purificação por cromatografia de afinidade, tendo sido obtido um rendimento final de 0,5 mg/l de cultura. A proteína Eg14-3-3ε1 recombinante purificada será futuramente utilizada em ensaios funcionais, buscando inicialmente a identificação de seus ligantes proteicos dentre o repertório de proteínas do parasito e do hospedeiro, no contexto da infecção crônica. / Echinococcus granulosus is a parasitc platyhelminth of the Cestoda class, wich has, canids as definitive hosts, domestic ungulates and humans as intermediate hosts. This parasite is the causative agent of cystic hydatid disease, a hyperendemic zoonosis in the Southern Cone of South America, including Southern Brazil. In order to the establishment and maintenance of hydatid cyst for a long period of time, the parasite secrets and exposes to its host numerous proteins, which may have immunomodulatory activity as well to be related to physiological activities of the parasite. The 14-3-3 proteins are a family of highly conserved eukaryotic regulatory molecules that are able to interact with different partner proteins in different cellular contexts, regulating complex biological functions. In E. granulosus five 14-3-3 proteins have been identified, three ζ isoform and two ε isoform. These proteins may be involved in host-parasite interactions that favor the establishment and growth of the pathogenic larval form (metacestode). For future functional characterization of the 14-3-3ε1 protein from E. granulousus (Eg14-3-3ε1) previously detected in metacestode components, its coding sequence was expressed in Escherichia coli. The cloning was done into two different plasmid vectors (pGEX-TEV and pET-26b), to produce recombinant Eg14-3-3ε1 protein in E. coli, in the cytoplasm, in fusion with GST, and periplasmatic with histidine tail, respectively. Solubilization of Eg14-3-3ε1 fused with GST was achieved with 0.5% sarcosil, yet it was not possible to purify it. The Eg14-3-3ε1 protein with histidine tail was obtained by extracting the periplasmic fraction from E. coli cultures, followed of purification by affinity chromatography, yielding 0.5 mg/l. The recombinant Eg14-3-3ε1 protein will be used in functional assays, initially aiming at the identification of protein ligands from the repertoire of proteins from the parasite and from host in the context of chronic infection.

Antibacterial agents are composed of a diverse group and many such agents have entered common usage through experience with little information on their mechanism of action. Study of the mechanism of action of an antimicrobial agent provides an insight into resistance mechanisms, toxicological problems and the design and development of new agents or combinations. The primary target of most antimicrobial agents (excluding antibiotics) is the cytoplasmic membrane and associated enzymes. Membrane-active agents can cause a change in the fluidity and/or permeability of the cytoplasmic membrane. Such changes can be determined by the leakage of cellular constituents such as potassium ions, nucleotides and their constituents and amino acids. The effect of an anti bacterial agent on the cytoplasmic membrane can also be determined by elucidating the effect of the antibacterial agent on the activity of membrane-bound enzymes and substrate uptake.

As plantas possuem um arsenal de substâncias utilizadas como defesa contra patógenos e predadores. A possibilidade de utilizar tais substâncias como biopesticidas revolucionou o estudo das proteínas tóxicas. Proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) e as ureases estão entre as proteínas que são abundantes em plantas. RIPs tipo 2 como a ricina, são muito tóxicas, e podem despurinar ribossomos de várias espécies e induzir lesão em DNA, levando à interrupção da síntese protéica e morte de células. Menos tóxicas que a ricina, a maior parte das RIPs conhecidas são do tipo 1 com apenas uma cadeia polipeptídica de 25 - 32 kDa. As ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de níquel, que catalisam a hidrólise da uréia para formar amônia e dióxido de carbono. A semente do feijão-de-porco, Canavalia ensiformis, é fonte rica de isoformas de urease, entre elas, a canatoxina (CNTX). A proteína CNTX apresenta atividade inseticida contra diferentes espécies de insetos, e sua toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10kDa (pepcanatox), que ocorre por ação das catepsinas do sistema digestivo dos insetos suscetíveis. Um peptídeo equivalente ao pepcanatox foi obtido por expressão heteróloga em Escherichia coli - Jaburetox-2Ec, o qual apresentou atividade tóxica contra Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus e Blatella germanica. Nesse trabalho demonstramos a atividade inseticida de cinco RIPs tipo 1 (PAP-S, gelonina, momordina, saporina-S6 e licnina) em Spodoptera frugiperda e Anticarsia gemmatalis. As RIPs mostraram um efeito entomotóxico espécie-específico para as lagartas, sendo que momordina foi a menos tóxica nos bioensaios. Perda de peso mais pronunciada foi observada em S. frugiperda no 4° dia após o início dos ensaios e para a A. gemmatalis, no 10° dia. A indução da mortalidade (larval e/ou pupal) foi de 57,13% para os tratamentos em A. gemmatalis e 29,45% para S. frugiperda. Para investigar o efeito deterrente de RIPs tipo 1 em insetos, verificou-se, através do teste cometa, o nível de danos ao DNA em tecidos de S. frugiperda e A. gemmatalis que ingeriram um total de 40 μg de RIPs. Os insetos tratados com RIPs mostraram um valor 2 a 3 vezes maior de células com sinais de dano de DNA do que o controle. O dano de DNA poderia ser conseqüência do estresse oxidativo, assim analisou-se atividade de enzimas antioxidantes CAT e SOD e níveis de peroxidação lipídica (TBARS) nos extratos celulares dos insetos, mas não houve uma correlação entre dano de DNA e marcadores de estresse oxidativo. O peptídeo recombinante derivado de urease, jaburetox-2Ec, induziu uma mortalidade de 100% de S. frugiperda após ingestão de 47μg do peptídeo. Em contraste com os dados obtidos com as RIPs, o jaburetox-2Ec não causou lesões no DNA ou alterações em marcadores do balanço redox em S. frugiperda evidenciando um mecanismo de ação distinto. Em linhagens de células de insetos em cultura (Tn5B e UFL-AG-286), a análise citomorfológica sugeriu a ocorrência de citotoxicidade e lise celular com exposição a 80 e 10 μg do jaburetox-2Ec, após 4 e 7 dias de incubação, respectivamente. Para compreender a ação do peptídeo entomotóxico em células de insetos, realizou-se testes de citotoxicidade utilizando o kit CyTotox-GloP TM P incubando-se células UFL-AG-286 e Sf21 com jaburetox-2Ec. Os resultados com esse kit não foram conclusivos, sugerindo que o peptídeo recombinante seria capaz de inibir as proteases intracelulares liberadas na lise celular. Nossos resultados mostraram que RIPs tipo 1 e o jaburetox-2Ec têm efeito inseticida em lepidópteros por mecanismos distintos, sendo que as RIPs tipo 1 induzem lesão de DNA em A. gemmatalis e S. frugiperda, enquanto que jaburetox-2Ec induz alterações ainda não identificadas, que resultam em morte do inseto. / The plants have an arsenal of substances used as a defense against pathogens and predators. The possibility of using these substances as biopesticides revolutionized the study of toxic proteins. Ribosomes-inactivating proteins (RIPs) and ureases are among the proteins that are abundant in plants. Type 2 RIPS, such as ricin, are highly toxic and depurinate ribosomes of different species and induce DNA damage, arresting protein synthesis and leading to cell death. Less toxic, most of the known RIPs are type 1, composed of a single polypeptide chain of 25-32 kDa. Ureases (EC 3.5.1.5) are nickel dependent metalloenzymes that catalyze the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide. The seed of jackbean (Canavalia ensiformis) is a rich source of ureases isoforms, one of which is canatoxin (CNTX). The protein CNTX presents insecticidal activity and its toxicity relies on an internal ~10 kDa peptide (pepcanatox) released upon hydrolysis of CNTX by digestive cathepsins of susceptible insects. A peptide equivalent to pepcanatox obtained by heterologous expression in Escherichia coli - Jaburetox-2EC, showed insecticidal activity against Dysdercus peruvianus, Rhodnius prolixus and Blatella germanica. In this study we demonstrated the insecticidal activity of five type 1 RIPs (PAP-S, gelonin, momordin, saporin-S6 and lychnin) in Spodoptera frugiperda and Anticarsia gemmatalis. The entomotoxic effect of RIPs was species-specific and momordin was shown to be the less toxic in the bioassays. S. frugiperda had a more pronounced weight loss on the 4th day of treatment and A. gemmatalis on the 10th day. Mortality (larval and/or pupal) rate reached 57.13% for A. gemmatalis and 29.45% for S. frugiperda. To investigate the deterrent effect of type 1 RIPs in insects, the levels of DNA damage were evaluated using the comet test in tissues homogenates of S. frugiperda and A. gemmatalis fed a total of 40μg of RIPs. The RIPs-treated insects showed 2 to 3 times more cells with DNA damage, as compared to controls. To test whether DNA damage could be consequent to oxidative stress, the activity of the antioxidant enzymes SOD and CAT and levels of lipid peroxidation (TBARS) were assayed in cellular extracts of S. frugiperda and A. gemmatalis fed 40 μg RIPs, but no correlations were found between DNA damage and stress markers. The urease-derived recombinant peptide, jaburetox-2Ec, induced 100% mortality of S. frugiperda fed 47 μg peptide. In contrast to the results observed for type 1 RIPs, treatment of S. frugiperda with jaburetox-2Ec did not cause damage in DNA nor modifications in redox balance markers, indicating a distinct mechanism of action. Microscopic analysis of lepidopteran insect cells in culture (lines Tn5B and UFL-AG-286) suggested cytotoxicity and cell lysis induced by incubation with 80 and 10 μg jaburetox- 2Ec, after 4 and 7 days, respectively. Aiming to understand the mode of action of the entomotoxic peptide in insects cells, the CyTotox-GloP TM Pkit was used to detect cytotoxicity in UFL-AG-286 and Sf21 cells incubated with jaburetox-2Ec. Unexpectedly, the results were not conclusive since it appears that the recombinant peptide is able to inhibit the intracellular proteases released upon cell lysis, preventing the hydrolysis of fluorogenic substrate used in the kit. In conclusion, our results demonstrated that type 1 RIPs and jaburetox-2Ec are insecticidal to lepidopterans acting through distinct mechanisms. Thus type 1 RIPs induce DNA damage in A. gemmatalis and S. frugiperda, while jaburetox-2Ec induce yet to be identified physiological changes that lead to insect death.