O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, que tem, como hospedeiros definitivos, os canídeos, e, como hospedeiros intermediários mais comuns, ungulados domésticos e o homem. Este parasito é o agente etiológico da hidatidose cística, zoonose hiperendêmica no Cone Sul da América do Sul, incluindo o sul do Brasil. Para o estabelecimento e manutenção do cisto hidático por longos períodos de tempo (infecção crônica), o parasito secreta e expõe ao seu hospedeiro numerosas proteínas, que podem apresentar tanto atividade imunomoduladora, como estar relacionadas a atividades fisiológicas do parasito. As proteínas 14-3-3 constituem uma família altamente conservada de moléculas reguladoras eucarióticas, que são capazes de interagir com diferentes proteínas ligantes em diversos contextos celulares, regulando funções biológicas complexas. Em E. granulosus, foram identificadas cinco proteínas 14-3-3, sendo três isoformas ζ e duas isoformas ε. Essas proteínas podem estar envolvidas em interações parasito-hospedeiro que propiciam o estabelecimento e o desenvolvimento da forma larval patogênica (metacestódeo). Para a futura caracterização funcional da proteína 14-3-3e1 de E. granulousus (Eg14-3-3ε1), já detectada em componentes do metacestódeo, a sua sequência codificadora foi expressada em Escherichia coli. A clonagem foi realizada em dois vetores plasmidiais distintos (pGEX-TEV e pET-26b), para permitir a expressão em E. coli da proteína Eg14-3-3ε1 recombinante no citoplasma, em fusão com a GST, e no espaço periplásmatico, com cauda de histidina, respectivamente. A solubilização da Eg14-3-3ε1 em fusão com a GST foi obtida com 0,5% de sarcosil, mas no entanto não foi possível a sua purificação. A proteína Eg14-3-3ε1 com cauda de histidina foi obtida por extração da fração periplasmática seguida da purificação por cromatografia de afinidade, tendo sido obtido um rendimento final de 0,5 mg/l de cultura. A proteína Eg14-3-3ε1 recombinante purificada será futuramente utilizada em ensaios funcionais, buscando inicialmente a identificação de seus ligantes proteicos dentre o repertório de proteínas do parasito e do hospedeiro, no contexto da infecção crônica. / Echinococcus granulosus is a parasitc platyhelminth of the Cestoda class, wich has, canids as definitive hosts, domestic ungulates and humans as intermediate hosts. This parasite is the causative agent of cystic hydatid disease, a hyperendemic zoonosis in the Southern Cone of South America, including Southern Brazil. In order to the establishment and maintenance of hydatid cyst for a long period of time, the parasite secrets and exposes to its host numerous proteins, which may have immunomodulatory activity as well to be related to physiological activities of the parasite. The 14-3-3 proteins are a family of highly conserved eukaryotic regulatory molecules that are able to interact with different partner proteins in different cellular contexts, regulating complex biological functions. In E. granulosus five 14-3-3 proteins have been identified, three ζ isoform and two ε isoform. These proteins may be involved in host-parasite interactions that favor the establishment and growth of the pathogenic larval form (metacestode). For future functional characterization of the 14-3-3ε1 protein from E. granulousus (Eg14-3-3ε1) previously detected in metacestode components, its coding sequence was expressed in Escherichia coli. The cloning was done into two different plasmid vectors (pGEX-TEV and pET-26b), to produce recombinant Eg14-3-3ε1 protein in E. coli, in the cytoplasm, in fusion with GST, and periplasmatic with histidine tail, respectively. Solubilization of Eg14-3-3ε1 fused with GST was achieved with 0.5% sarcosil, yet it was not possible to purify it. The Eg14-3-3ε1 protein with histidine tail was obtained by extracting the periplasmic fraction from E. coli cultures, followed of purification by affinity chromatography, yielding 0.5 mg/l. The recombinant Eg14-3-3ε1 protein will be used in functional assays, initially aiming at the identification of protein ligands from the repertoire of proteins from the parasite and from host in the context of chronic infection.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-08-10T16:09:44Z No. of bitstreams: 1 2016_AndersonJoaquimPereiradosSantos.pdf: 1027712 bytes, checksum: 89b5dab1c01fe6b1b259e438601722cc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-02T14:56:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AndersonJoaquimPereiradosSantos.pdf: 1027712 bytes, checksum: 89b5dab1c01fe6b1b259e438601722cc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T14:56:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AndersonJoaquimPereiradosSantos.pdf: 1027712 bytes, checksum: 89b5dab1c01fe6b1b259e438601722cc (MD5) / Com o objetivo de verificar o efeito do período de maturação sobre o desenvolvimento de micro-organismos foram realizados dois estudos, sendo o primeiro a partir da produção de queijos com leite cru (n=7) para avaliação das contagens de micro-organismos aeróbios mesófilos, coliformes totais e Escherichia coli, e o segundo com queijos fabricados com leite laboratorialmente esterilizado (n=7), para avaliação das contagens de Listeria monocytogenes inoculada. Em ambos os estudos, os queijos foram maturados em condições de temperatura (7,5 ± 1,5 °C) e umidade (45 ± 5 %) controladas, durante 60 dias. Foram realizadas análises da matéria prima (leite cru e leite esterilizado), da massa imediatamente após a produção, dos queijos no primeiro dia (dia 01) e a cada dez dias (dias 10, 20, 30, 40, 50 e 60); também foram determinados os teores de umidade desses queijos. Aeróbios mesófilos apresentaram contagens de 5,77 log UFC/mL no leite, 6,67 log UFC/g na massa, 8,92 log UFC/g com vinte dias de maturação, quando alcançou sua contagem máxima e 7,24 log UFC/g aos sessenta dias de maturação. As contagens de coliformes totais foram: 5,47 log UFC/mL no leite, 6,33 log UFC/g na massa, 7,73 log UFC/g aos dez dias de maturação, quando alcançou sua contagem máxima e 5,18 log UFC/g aos sessenta dias. E. coli apresentou contagens de 2,52 log UFC/mL no leite, 3,48 log UFC/g na massa, 5,19 log UFC/g com vinte dias, quando alcançou sua contagem máxima e 2,30 log UFC/g aos sessenta dias de maturação. As contagens de L. monocytogenes foram de 6,50 log UFC/g na massa, 8,09 log UFC/g no trigésimo dia, quando alcançou sua contagem máxima e 7,66 log UFC/g aos sessenta dias de maturação. Com os resultados obtidos foi possível concluir que o período de maturação de 60 dias não foi suficiente para garantir a higiene e a inocuidade dos queijos considerando o comportamento dos micro-organismos estudados sob as condições e os tempos analisados. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In order to verify the effect of the maturation period on the development of micro-organisms two studies were conducted, in which the first one was developed with cheeses produced with raw milk (n = 7) for evaluation of aerobic microorganisms mesophilic counts, total coliforms and Escherichia coli, and the second one with cheeses produced with laboratorial sterilized milk (n = 7) for the assessment of the counts of Listeria monocytogenes inoculated. In both studies, the cheeses were matured under controlled conditions of temperature (7.5 ± 1.5 ° C) and humidity (45 ± 5%), for 60 days. Analysis of the prime materials (raw milk and sterilized milk), the curd immediately after production, the cheeses on the first day (Day 01) and every ten days (days 10, 20, 30, 40, 50 and 60) were carried out; Also, the cheeses’ moisture were estimated. Mesophilic aerobic counts were 5.77 CFU/mL log in milk sample, 6.67 log CFU/g in curd sample, 8.92 log CFU/g in cheese sample within twenty days of ripening, when it reached its maximum count and 7.24 log CFU/g at the sixtieth day of ripening. Total coliform counts were: 5.47 log CFU/mL in milk sample, 6.33 log CFU/g in curd sample, 7.73 log CFU/g on the tenth day of ripening, when it reached its maximum count and 5.18 log CFU/g at the sixtieth day. E. coli showed counts of 2.52 log CFU/mL in milk sample, 3.48 log CFU/g in curd sample, 5.19 log CFU/g with twenty days of ripening when reached its maximum count and 2.30 log CFU/g at the sixtieth day of ripening. L. monocytogenes counts were 6.50 log CFU/g in curd sample, 8.09 log CFU/g on the thirtieth day, when it reached its maximum count and 7.66 log CFU/g within sixty days of ripening. With the results it was concluded that the 60-day maturation period was not enough to ensure the hygiene and safety of cheeses considering the behavior of micro-organisms studied under the circumstances analyzed.

Tesis de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La búsqueda de nuevos métodos de síntesis de quantum dots que permitan generar nanopartículas con nuevas o mejores propiedades o métodos de síntesis mas eficientes a los utilizados actualmente, representa un desafío en materia de investigación. En los últimos años, la síntesis de este tipo de nanopartículas a través del uso de microorganismos ha tomado gran fuerza, lo que se debe principalmente a su alta escalabilidad, a sus bajos costos de producción y a la obtención de nanoparticulas con novedosas propiedades. Uno de los modelos más estudiados, es la síntesis de quantum dots de CdS utilizando Escherichia coli. No obstante, poco se sabe respecto a los procesos metabólicos implicados en la generación de estos nanocristales. Uno de los aspectos claves en estudio, es el rol del metabolismo del azufre en la generación de compuestos sulfurados como componentes de las nanopartículas, siendo la cisteína y el Na2S las fuentes de S más estudiadas. Basados en esto, el uso de fuentes de azufre alternativas abre la puerta a procesos metabólicos distintos, lo que supone la generación de compuestos sulfurados diferentes o una generación más eficiente de los mismos compuestos generados a partir de cisteína o Na2S durante la síntesis de quantum dots. Finalmente, en los últimos años, se ha relacionado el uso de taurina, una fuente no convencional de S, con la respuesta al estrés por cadmio en cultivos de E. coli (Helbig y cols. 2008). En este contexto, la presente Tesis se centró en el estudio del papel del metabolismo de la taurina en la tolerancia de E. coli a Cd2+ y en la biosíntesis de nanopartículas fluorescentes de CdS. Para ello, se evaluó la capacidad de E. coli de sintetizar quantum dots al ser expuesta a una sal de cadmio y utilizando taurina como única fuente de S. Bajo estas condiciones, se analizó la respuesta de la bacteria ante el metal mediante curvas de crecimiento y distribución de flujos metabólicos. Se identificó la generación de compuestos sulfurados (H2S y distintos COSVs) y finalmente se purificó y caracterizó las nanopartículas. Los resultados permitieron concluir que E. coli es capaz de sintetizar nanopartículas fluorescentes, las que en tamaño y características espectroscópicas se relacionan con quantum dots de CdS. La síntesis aparentemente, al utilizar taurina, no depende de H2S, otorgándole un rol no descrito en literatura a los COSVs, específicamente al MeSH, durante la síntesis de quantum dots de CdS y en la respuesta de E. coli a cadmio / The search for novel or more efficientes methods for quantum dots synthesis allowing the generation of nanoparticles with new or better properties, represent a great challange in nanotechnology research. In the last years, the synthesis of quantum dots by microorganisms has generated big expectations, mainly due of the high scalability, low production costs and the generation of nanoparticles with novel properties. The biosynthesis of CdS quantum dots using Escherichia coli is one of the most studied models. Nevertheless, little is known about the metabolic process implicated in nanocrystals generation. A relevant aspect which is currently under study, is the role of S metabolism in the generation of sulfured compounds as key components of nanoparticles structure, being cysteine and Na2S the most studied S sources. Based on this, the use of non-conventional S sources leads to unknown metabolic processes, which implicates the generation of different sulfured compounds or more efficient process for the generation of the same quantum dots production using cysteine or Na2S. Helbig et al. 2008 related a non-conventional S source such as taurine with the response of E. coli to cadmium stress. In this context, the present thesis focuses on the role of taurine metabolism in the tolerance of E. coli to Cd2+ and the role of taurine metabolism in the biosynthesis of fluorescent CdS nanoparticles. In order to achive this, the synthesis of quantum dots by E. coli cultures exposed to a cadmium salt and using taurine as the main sulfur source was evaluated. Under the same conditions, the bacterial reponse to the metal measured through growth curves and metabolic flux distributions was analyzed. Finally, the identification of sulfur compounds (H2S and different COSVs) and the purification with the respective characterization of produced nanoparticles was carried out. The results obtained allow to conclude that E. coli is able to synthesize fluorescent nanoparticles, related in size and spectroscopic characteristic to CdS quantum dots. Apparently, the synthesis using taurine, does not depends on H2S generation by a non-described role of COSVs, specifically MeSH, in the synthesis of CdS quantum dots and also in the E. coli response to cadmium / Fondecyt; Anillo Act 1107

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:04:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Submitted by TIAGO CASELLA null (tiago_casella@yahoo.com.br) on 2016-11-23T17:21:44Z No. of bitstreams: 1 Tese - biblioteca.pdf: 2980158 bytes, checksum: 5d23fec311f66bb459c291f4a63a4749 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-11-29T11:28:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 casella_t_dr_sjrp.pdf: 2980158 bytes, checksum: 5d23fec311f66bb459c291f4a63a4749 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-29T11:28:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 casella_t_dr_sjrp.pdf: 2980158 bytes, checksum: 5d23fec311f66bb459c291f4a63a4749 (MD5) Previous issue date: 2016-11-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A resistência a cefalosporinas de espectro estendido (ESC) mediada pela produção de β-lactamases de espectro estendido (ESBL) por Enterobacteriaceae é um problema de saúde pública global. Neste contexto, o aumento da resistência a ESC entre Escherichia coli isoladas de animais de produção é uma questão importante, uma vez que bactérias comensais de animais de produção podem contaminar os produtos alimentícios e chegar ao intestino humano via cadeia alimentar. O Brasil é um importante produtor e o maior exportador de carne de frango no mundo. Assim, é de extrema importância monitorar a presença dessas bactérias neste setor alimentar. No presente estudo, foi realizada uma comparação do genótipo de resistência a ESC em E. coli isoladas a partir de carnes de frango no Brasil e na França, considerando que não há relação comercial de carne de frango entre esses dois países. Esta abordagem pode ser útil para compreender as dinâmicas dos fatores de resistência na cadeia de produção de frangos. Além disso, linhagens isoladas do trato gastrointestinal de frangos no Brasil foram também estudadas. Para isso, amostras de carnes de frango de diferentes pontos do varejo e swabs de cloaca de frangos de três diferentes fazendas foram coletadas no Estado de São Paulo, Brasil. Também, amostras de carnes de frango de diferentes pontos do varejo de Lyon, França, foram amostradas. As amostras de carne e os swabs de cloaca de frangos foram inoculados em ágar MacConkey acrescido com ESC. As colônias foram identificadas por sistema automatizado, e a suscetibilidade aos antimicrobianos foi testada por disco-difusão. PCR para detecção de genes blaESBL e blapAmpC e para a determinação dos grupos filogenéticos de E. coli foram realizadas. Os genes bla foram sequenciados e os plasmídeos foram caracterizados pelo esquema PBRT e por southern blot/hibridação de géis de PFGE-S1. Quase todas as carnes de frango apresentaram, ao menos, uma linhagem de E. coli resistente a ESC, e 53,8% dos frangos analisados também estavam colonizados por E. coli resistente a ESC. Resistência a aminoglicosídeos, fenicóis, quinolonas, sulfonamidas, tetraciclina e trimetoprim também foi detectada. Um total de 60 linhagens isoladas de amostras do Brasil foram estudadas, e o gene blaCTX-M-2 foi o principal responsável pela resistência a ESC, mas blaCTX-M-55, blaCMY-2, blaCTX-M-15 e blaCTX-M-8 também foram detectados. De 77 linhagens isoladas de amostras de carne de frango da França, o gene blaCTX-M-1 foi o principal responsável pela resistência a ESC, mas blaTEM-52, blaCMY-2 e blaSHV-12 também foram detectados. A maioria dos blaCTX-M-2 estão associados à ISCR1 e a integrons complexos de classe 1, e blaCTX-M-1, blaCTX-M-15, blaCTX-M-55, e os oito blaCMY-2 do Brasil estão precedidos pela ISEcp1. O gene blaCTX-M-8 está associado à IS10. Nas amostras do Brasil, um gene blaCTX-M-2 é carreado por um plasmídeo IncHI2/P, blaCTX-M-8 por um plasmídeo IncI1, um gene blaCTX-M-15 por um plasmídeo IncX1, e os genes blaCTX-M-55 por plasmídeos IncFII ou IncN/FII. Nas amostras de carnes de frango da França, os genes blaCTX-M-1 são carreados por plasmídeos IncI1 ou IncFII, blaTEM-52 por plasmídeos IncI1 ou IncX1, blaCMY-2 por plasmídeos IncA/C ou IncK, e o gene blaSHV-12 por um plasmídeo IncI1. Todos os quatro principais grupos filogenéticos de E. coli (A, B1, B2, D) foram detectados, porém o filogrupo D foi predominante entre as linhagens do Brasil, e os filogrupos D, A e B1 foram igualmente distribuídos nas linhagens recuperadas na França. Em resumo, E. coli presentes na cadeia de produção de frangos carreiam genes de ESBL e de AmpC plasmideal, e genes, plasmídeos e linhagens resistentes a antimicrobianos parecem ser específicos em cada região geográfica. / Resistance to extended spectrum cephalosporins (ESC) mediated by the production of extended-spectrum β-lactamases (ESBL) by Enterobacteriaceae is a global public health concern. In this context, the raise in ESC-resistance among Escherichia coli isolated from food-producing animals is an important issue, since commensal bacteria from producing animals may contaminate food products and reach the human gut through the food chain. Brazil is an important producer and the greatest exporter of chicken meat in the world, so, it is of utmost importance to monitor the presence of these bacteria in this food sector. In this study, a comparison of the resistance genotype to ESC in E. coli isolated from chicken meat produced in Brazil and France was performed, considering that there is no commercial relationship of chicken meats between these countries. This approach may be useful to understand the dynamics of the resistance factors in chicken production chain. Also, isolates from cloacal swabs collected in Brazil were studied. For this, samples of chicken meat from different markets and chicken cloacal swabs from three separate farms were sampled in the State of São Paulo, Brazil. In addition, chicken meat samples were acquired from markets in Lyon, France. Meat samples and cloacal swabs were inoculated on MacConkey agar supplemented with ESC. Colonies were identified by an automated system, and antimicrobial susceptibility was tested by disc diffusion. PCRs for detection of blaESBL and blapAmpC genes were performed and phylogenetic groups were determined. The bla genes were sequenced, and plasmids were characterized by rep-typing and southern blot/hybridization on S1-PFGE gels. Almost all pieces of chicken meat presented at least one ESC-resistant E. coli, and 53.8% of chickens were also colonized by ESC-resistant E. coli. Resistance to phenicols, quinolones, aminoglycoside and sulphonamides was also detected. A total of 60 strains isolated from Brazilian samples was studied and the blaCTX-M-2 gene was the main responsible for the ESC-resistance, but blaCTX-M-55, blaCMY-2, blaCTX-M-15 and blaCTX-M-8 were also detected. From 77 strains isolated from chicken meat samples from France, the blaCTX-M-1 gene was the main responsible for ESC-resistance, but blaTEM-52, blaCMY-2 and blaSHV-12 were also detected. Most of blaCTX-M-2 were associated to ISCR1 and complex class 1 integrons, and blaCTX-M-1, blaCTX-M-15, blaCTX-M-55, and the eight blaCMY-2 from Brazil were preceded by ISEcp1. The blaCTX-M-8 gene was associated to IS10. In samples from Brazil, one blaCTX-M-2 gene was harbored by an IncHI2/P plasmid, blaCTX-M-8 was carried by an IncI1 plasmid, one blaCTX-M-15 was carried by an IncX1 plasmid, and the blaCTX-M-55 genes were harbored by IncFII or IncN/FII plasmids. In chicken meats from France, the blaCTX-M-1 genes were harbored by IncI1 or IncFII plasmids, blaTEM-52 were carried by IncI1 or IncX1 plasmids, blaCMY-2 were carried by IncA/C or IncK plasmids, and the blaSHV-12 gene was harbored by an IncI1 plasmid. All four major phylogenetic groups (A, B1, B2, D) were present, but phylogroup D was predominant among strains from Brazil, and phylogroups D, A and B1 were equally distributed in strains recovered in France. In summary, E. coli in the chicken production chain carry genes for ESBL and plasmidic AmpC, and genes, plasmids and antimicrobial resistant strains seem to be specific for each geographic region.

Resumo: Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) são reconhecidas como agentes causadores de infecções em humanos em todo o mundo. O principal reservatório é o bovino. Neste trabalho, cepas de STEC previamente isoladas de fezes bovinas foram caracterizadas usando PCR multiplex para determinar os genes de virulência (stx1, stx2, ehxA, eaeA e saa), soroaglutinação passiva reversa em látex (RPLA-VTEC screen) para avaliar a expressão da toxina Shiga, PCR-RFLP e sequenciamento para obter os subtipos e a variabilidade dos genes stx2, respectivamente. Foram determinados também os sorotipos, o perfil de sensibilidade e a viabilidade das cepas de STEC em queijo minas frescal. A freqüência de STEC nas amostras de fezes bovinas foi de 37%. Foram encontrados trinta e quatro sorotipos de STEC sendo os mais freqüentes o ONT:H7 (10%), O22:H8, O22:H16 e ONT:H21 (7% cada). Onze sorotipos encontrados não tinham sido associados com STEC até o momento. A maioria das STEC (96%) foi susceptível a todos os antimicrobianos testados. A produção de toxina Shiga determinada pelo ensaio RPLA foi de 89%. Os marcadores de virulência foram encontrados em 11 diferentes combinações, a mais freqüente foi stx2 (27%), stx1 stx2 e stx1 stx2 ehxA saa (16% cada). Foram detectados 8 subtipos de stx2: stx2OX3a/O111; stx2; stx2c; stx2(vha); stx2(vhb); stx2OX3b; stx2vnb/vhc e stx2O48. Os genes que apresentaram maior freqüência foram: stx2 e stx2c. As seqüências parciais obtidas sugerem a presença de elevada variabilidade nos genes do tipo stx2 nas STEC analisadas. A viabilidade de STEC não-O157 em queijo minas revelou que diferentes cepas de STEC podem ser detectadas nos queijos após 10 dias de armazenamento sob refrigeração. Os dados encontrados neste trabalho sugerem isolados com alto potencial de patogenicidade oferecendo risco de desencadear graves infecções à população. / Abstract: Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is recognize worldwide as an organism capable to cause human diseases. Cattle are the main source of STEC. In this research, STEC strains previously isolated were analyzed using multiplex-PCR for virulence genes, the RPLA assay to detect the Shiga toxin production and serotyping. PCR-RFLP and nucleotide sequence were analyzed to detect stx2 genes subtypes and their variability. Moreover tests for antimicrobial susceptibility and the vialbility of STEC in Minas Frescal cheese were done. The frequency of cattle shedding STEC was 37%. Thirty-four serotypes of STEC were found, the most frequent being ONT:H7 (10%), O22:H8, O22:H16 and ONT:H21 (7% each). Eleven serotypes had not been associate with STEC until the moment. Most of the strains (96%) were susceptible to all antimicrobial agents tested. Production of Shiga toxin by the RPLA assay was detected in most (89%) of the STEC strains. The frequency of virulence markers were found in 11 diferent combinations: stx2 (27%), stx1 stx2 e stx1 stx2 ehxA saa (16% each). Eigth stx2 subtypes were detect (stx2OX3a/O111; stx2; stx2c; stx2(vha); stx2(vhb); stx2OX3b; stx2vnb/vhc; stx2O48) and the most frequent were: stx2; stx2c. The partial sequences of stx2 genes suggested a high variability of stx2 types in the STEC analyzed. The STEC viability in cheese could be detected after 10 days of storage under refrigeration. The results found in this work suggest strains with high potential of pathogenicity offering risk to lead serious infections to the population. / Orientador: Ruben Pablo Schocken-Iturrino / Coorientador: José Moacir Marin / Coorientadora: Cyntia Maria Telles Fadel-Pichetch / Banca: Luiz Augusto do Amaral / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Alessandra Aparecida Medeiros / Banca: Elaine Cristina Pereira de Martins / Doutor

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente, em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, cujo sequenciamento completo do genoma a capacita como um interessante modelo para o estudo da regulação da FBN. No genoma de P. riograndensis foram identificados três agrupamentos contendo genes relacionados à FBN. Um deles, com uma organização estrutural menos conservada, foi considerado inativo a partir de análises de PCR em tempo real e de atividade de promotor. Os outros dois tiveram seus transcritos identificados e induzidos sob condições de fixação de nitrogênio, sendo um deles responsável pela codificação de um sistema alternativo da nitrogenase, independente de molibdênio. Esse sistema alternativo foi identificado como sendo aquele composto apenas por ferro e validado tanto pela análise das sequências dos genes estruturais, como pela atividade enzimática em meio sem molibdênio. Sequências localizadas a aproximadamente 250 pares de bases (pb) a montante do início da tradução dos primeiros genes dos dois agrupamentos funcionais também tiveram suas atividades como regiões reguladoras validadas pelo reconhecimento em Escherichia coli, com um provável padrão de iniciação da transcrição constitutivo. Uma menor atividade de transcrição foi observada no fragmento de 500 pb localizado a montante do agrupamento dos genes da nitrogenase alternativa, indicando a presença de regiões contendo motivos de regulação negativa do processo. Investigações mais detalhadas dessas sequências podem revelar padrões inéditos para a regulação da FBN em bactérias Gram-positivas, em geral, e em P. riograndensis, em particular. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gramnegative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis is a Gram-positive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. In P. riograndensis genome three cluster comprising BNF related genes were identified. One of them, displaying a less conserved structural organization, was stated as inactive from real time PCR and promoter activity analysis. The other ones had their transcripts identified and responded to nitrogen fixation conditions. One of the active clusters comprises genes coding for an alternative nitrogenase system independent of molybdenum, the iron-only system. This alternative system was validated by enzymatic activity under Mo-depleted conditions. Sequences 250 base pairs (bp) upstream from the first open reading frame (ORF) of each active cluster had their promoter activities validated by recognizing in Escherichia coli, showing a probable constitutive expression pattern. A weaker promoter activity was identified in a fragment 500 bp upstream of the first ORF from the alternative cluster, suggesting the presence of a negative regulation motif. Future investigations may provide us with new patterns of BNF regulation in Gram-positive bacteria, in general, and in P. riograndensis in particular.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-04-12T19:24:52Z No. of bitstreams: 1 2009_MarcioMandelliLorenzoni.pdf: 3831224 bytes, checksum: 3001c54fd129f0a73cc6293a06a30627 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-06T19:42:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_MarcioMandelliLorenzoni.pdf: 3831224 bytes, checksum: 3001c54fd129f0a73cc6293a06a30627 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-06T19:42:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_MarcioMandelliLorenzoni.pdf: 3831224 bytes, checksum: 3001c54fd129f0a73cc6293a06a30627 (MD5) Previous issue date: 2009-07 / As Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) correspondem a um grupo heterogêneo e pouco caracterizado quando comparado aos demais patotipos de E. coli. O fato de algumas linhagens descritas serem patogênicas e outras não geram dúvidas sobre a classificação precisa deste grupo. Contribui para isso, o fato de ainda não existir qualquer marcador molecular específico para genes de virulência de DAEC. Alguns patógenos da mucosa intestinal fazem uso do Sistema de Secreção Tipo Três (TTSS) para a injeção de proteínas efetoras em células alvo. Neste trabalho, utilizando linhagens de DAEC isoladas de crianças diarréicas do DF, realizamos experimentos de PCR com iniciadores definidos a partir de genes do TTSS da linhagem E23468/69 de EPEC. Assim, foram sintetizados iniciadores dirigidos às seqüências rorf1, cesAB, escR, escT e sepQ. Análises de similaridade revelaram escores de até 100% entre alguns dos produtos obtidos e linhagens de EPEC, EHEC, STEC. Foi possível identificar o fragmento de DNA referente ao provável gene escR completo, bem como de seqüências de DNA extremamente conservadas da rorf1, cesAB, escT e sepQ. Os produtos das amplificações correspondentes aos prováveis genes do TTSS foram clonados, para a criação de um banco de seqüências, visando futuras análises. Devido ao êxito na detecção de alguns prováveis genes do TTSS em nossas amostras e, uma vez que a expressão de genes do TTSS ainda não foi relatada em DAEC, experimentos visando analisar a expressão desses prováveis genes foram realizados por meio de RT-PCR, empregando RNA isolado de linhagens de DAEC em culturas submetidas a condições de indução dos genes do TTSS. Tal abordagem nos permitiu demonstrar que houve transcrição dos prováveis genes escN, escR e escT, apesar dos resultados divergirem um pouco em relação às amostras e genes testados. Nossas análises indicaram claramente a presença e a expressão dos prováveis genes do TTSS em duas das amostras de DAEC analisadas. Estudos complementares deverão ser realizados a fim de avaliarmos a funcionalidade deste sistema de secreção e os resultados obtidos certamente contribuirão na elucidação dos mecanismos de virulência deste ainda controverso patotipo. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The diffusely adhering Escherichia coli (DAEC) is a heterogeneous group and less characterized when compared to other pathotypes of E. coli. The fact that some strains are pathogenic and others not, creates doubts about the exact classification of this group. Contributes to it, the lack of molecular markers corresponding to the virulence genes of DAEC. Some intestinal pathogens use the Type Three Secretion System (TTSS) to inject effector proteins into target cells. In this study, using strains of DAEC originated from diarrheic children of DF, we performed PCR experiments employing primers based on genes of the TTSS of EPEC strain E23468/69, directed to the sequences rorf1, cesAB, escR, escT and sepQ. DNA analyses revealed similarity scores of 100% between some of the products and EPEC, EHEC and STEC strains. It was possible to detect the presence of a DNA fragment corresponding to the complete escR gene, as well as highly conserved DNA sequences homologous to rorf1, cesAB, escT, and sepQ. The amplification products corresponding to the probable TTSS genes were cloned in order to create a database of sequences, to be submitted to further analyses. The success obtained in detecting probable TTSS genes in our samples and, since the expression of genes of the TTSS has not yet been reported in DAEC, experiments were performed in order to examine the expression of these candidate genes by means of RNA extraction and reverse transcription procedures of cultures grown under TTSS genes induction conditions. This approach allowed us to conclude that the escN, escR and escT genes were transcribed, although the results differ somewhat among the samples and genes tested. Our analyses clearly showed the presence and expression of TTSS genes in two samples of DAEC. Additional studies should be conducted to assess the functionality of this secretion system, and the results certainly help in elucidating the mechanisms of virulence of this still controversial pathotype.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-06-22T17:34:58Z No. of bitstreams: 1 2011_ViniciusOliveiraDrummond.pdf: 1609526 bytes, checksum: f4744ae412556481127ea51ce3e5bc78 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-08T23:05:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_ViniciusOliveiraDrummond.pdf: 1609526 bytes, checksum: f4744ae412556481127ea51ce3e5bc78 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-08T23:05:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_ViniciusOliveiraDrummond.pdf: 1609526 bytes, checksum: f4744ae412556481127ea51ce3e5bc78 (MD5) / O crescimento da exportação brasileira de produtos de origem suína brasileira exige uma maior preocupação com a sanidade destes animais, uma vez que doenças como colites e diarreias promovem atraso no desenvolvimento e algumas vezes na morte dos animais. A Escherichia coli está entre os agentes mais comumente isolados como causadores dessas afecções e animais hígidos podem abrigar cepas de E. coli que contenham genes para a produção de fatores de virulência, como enterotoxinas. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar bioquimicamente, traçar um perfil de resistência antimicrobiana e detectar genes de toxinas em cepas de E. coli de suínos hígidos no Distrito Federal. Foram isoladas 127 cepas de E. coli de 109 suínos e identificadas bioquimicamente, inclusive para presença de hemólise em ágar sangue, testadas para genes de enterotoxinas (STa, LT-I, LT-II, Stx1 e Stx2) e resistência a antimicrobianos. Na análise bioquímica não foram observadas grandes diferenças das tabelas de identificação de enterobactérias. Das 127 cepas isoladas, em 66,1% (84) foi verificada a presença de hemólise, e dessas, somente cinco (5,9%) apresentaram genes de virulência. Oito cepas (6,3%) possuíam genes para enterotoxinas, sendo que quatro (3,2%) foram positivas somente para LT-I, três (2,4%) foram positivas somente para STa e uma (0,8%) foi positiva para STa e LT-I. Nenhuma apresentou gene para LT-II, Stx1 ou Stx2. Quanto ao perfil de resistência antimicrobiano, os antibióticos com maiores porcentagens de resistência foram a Lincomicina (100%), Sulfonamidas (74,8%), Tetraciclina (70,1%), Doxiciclina (66,1%) e Ampicilina (51,2%). Os maiores índices de sensibilidade antimicrobiana foram observados na Norfloxacina (82,7%), Gentamicina (75,6%), Sulfametoxazol + Trimetoprim (63%), Enrofloxacina (58,3%), Cloranfenicol (56,7%) e Estreptomicina (53,5%). O resultado apresentado nesse estudo demonstra que mesmo um suíno hígido pode carrear cepas de E. coli com altas taxas de resistência antimicrobiana e que possuem genes codificadores de enterotoxinas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The growth of exports of Brazilian swine products has consequently a greater concern for the health of these animals, since diseases like diarrhea and colitis promote a developmental delay and sometimes in the animal's death. Escherichia coli is among the most common isolated agents causing these injuries, and healthy swines may harbor E. coli strains that have genes for virulence factors, like enterotoxins. The goal of this study was isolation and biochemical identification, antimicrobial resistance profile and detection of genes for enterotoxins in strains of E. coli from healthy swines in Distrito Federal. A total of 127 strains of E. coli were isolated from 109 swines and biochemically tested, observed for hemolysis on blood agar, tested for enterotoxin genes (STa, LT-I, LT-II, Stx1 e Stx2) and for antimicrobial resistance. In biochemical tests there were no significative differences between the results and the enterobacterial identification tables. In 84 (66.1%) strains were observed hemolysis, and from these, five (5.9%) were positive for virulence genes. Eight strains (6.3%) had genes for enterotoxins, with four (3.2%) positive only for LT-I, three (2.4%) positive only for STa and one (0.8%) positive for both toxins. There were no positives for LT-II, Stx1 or Stx2. When antimicrobial resistance was analyzed, the most resistant antibiotics were Lincomycin (100%), Sulfonamide (74.8%), Tetracycline (70.1%), Doxycyclin (66.1%) and Ampicillin (51.2%). The most sensitive antimicrobials were Norfloxacin (82.7%), Gentamicin (75.6%), Sulfamethoxazole + Trimethoprim (63%), Enrofloxacin (58.3%), Chloramphenicol (56.7%) and Streptomycin (53.5%). These results demonstrate that even a healthy swine could carry E. coli strains with high numbers of antimicrobial resistance and with genes that encode enterotoxins.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Death from acute diarrhea has been reduced since 80Âs. However diarrhoeal diseases account for nearly 1.34 million deaths a year among children under-five years of age, making them the second most common cause of child deaths worldwide. As mortality acute diarrhea was reduced, persistent diarrhea (PD) has become a major enteric diseases infant collaborating to morbidity of affected populations. Small intestinal mucosa injury that becomes prolonged has been named as a central mechanism in the pathophysiology of PD. The protein malnutrition and infection by Escherichia coli enteroaggregative (EAEC) are strongly associated with development PD. The present study investigated the effect of supplementation of Alanyl-Glutamine on monolayer of intestinal cells in the absence of infection, evaluated some parameters of the injury caused by EAEC (strain 239-1) on the intestinal mucosa in vitro and modulation of such injury by Alanyl-Glutamine 10mM. The result show that effects of supplementation of Alanyl-Glutamine 10mM is no different from effects free glutamine 4mM. Compared to E. coli HS, EAEC infection reduced the number of migrating cells, increased the percentage of necrosis, decreased the proliferation and transcription-reverse from small GTPases (RhoA, Rac1 and Cdc42), within 6 hours of contact. The contact EAEC reduced transcription of IL-8 (6h and 0h), NF-κB (6h) and TLR5 (6h and 12h) and increased TNF-α expression. The treatment of infection with Ala-Gln 10mM altered the following parameters: reduced the percentage of necrosis, increase of cell migration, although it has not caused changes in the transcription of Rho GTPases genes, increased transcription IL-8, NF-κB (6h) e TLR5 (6h and 12h). Treatment with dipeptidio significantly reduced the secretion of TNF-α (12h) while increased protein expression of IL-6 (6 e 12h). In conclusion, found that glutamine deprivation decreases cellular response against the infectious stimulus. The EAEC appears to minimize the innate host immune defenses by reducing the transcription of NF-kB and TLR5 and limit the increased transcription of IL-8. The Ala-Gln seems to make the cell more reactive against injurious stimuli, increasing their responsiveness through increased transcriptional IL-8, NF-kB and TLR5. Moreover increased protein expression of IL-6 appears to be one of the mechanisms by which promotes Ala-Gln protective effect on the intestinal epithelial barrier. / A morte por diarreia aguda tem apresentado grande declÃnio desde a dÃcada de 80 em todas as regiÃes do mundo. Entretanto as doenÃas diarreicas ainda sÃo responsÃveis por 1,34 milhÃes de mortes infantis a cada ano e representam a segunda maior causa de mortalidade no grupo etÃrio com idade inferior a 5 anos. Com o declÃnio de mortalidade por casos de diarreia aguda a diarreia persistente (DP) se tornou uma das principais doenÃas entÃricas infantis contribuindo para morbidade das populaÃÃes afetadas. Uma lesÃo no intestino delgado que se torna prolongada tem sido colocada como elemento central da patofisiologia da DP. A desnutriÃÃo proteica e a infecÃÃo por Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) estÃo fortemente associados ao desenvolvimento da DP. O presente estudo investigou o efeito da suplementaÃÃo de Alanil-Glutamina sobre monocamada de cÃlulas da mucosa intestinal na ausÃncia de infecÃÃes. Avaliou alguns parÃmetros da lesÃo promovida por EAEC (cepa 239-1) sobre a mucosa intestinal in vitro e a modulaÃÃo de tal dano pela Alanil-Glutamina 10Mm. Os resultados obtidos mostram que os efeitos da suplementaÃÃo de Ala-Gln 10mM nÃo diferem dos efeitos exibidos pela glutamina livre 4mM. Em relaÃÃo a cepa comensal E. coli HS, a infecÃÃo com EAEC reduziu de forma significativa a quantidade de cÃlulas em migraÃÃo, aumentou o percentil de necrose, diminuiu a proliferaÃÃo celular e reduziu significativamente a transcriÃÃo dos genes das pequenas GTPases (RhoA, Cdc42 e Rac1) apÃs 6h de contato com enterÃcitos. O contato com EAEC reduziu a transcriÃÃo de IL-8 (0h e 6h), NF-κB (6h) e TLR5 (6h e 12h) e aumentou a expressÃo proteica de TNF- α (12h). O tratamento da infecÃÃo com Ala-Gln 10mM alterou significativamente os seguintes parÃmetros: aumento da quantidade de cÃlulas em migraÃÃo embora nÃo tenha causado alteraÃÃo na transcriÃÃo dos genes da pequenas GTPases, reduÃÃo do percentual de necrose, aumento da proliferaÃÃo celular, aumento da transcriÃÃo IL-8, NF-κB (6h) e TLR5 (6h e 12h). O tratamento com o dipeptidio reduziu significativamente a secreÃÃo de TNF-α (12h) enquanto aumentou a expressÃo proteica de IL-6 (6 e 12h). Em conclusÃo, verificamos que a privaÃÃo de glutamina diminui a resposta celular frente ao estÃmulo infeccioso. A EAEC, por sua vez, parece minimizar as defesas imunes inatas hospedeiro ao reduzir a transcriÃÃo de NF-kB e TLR5 e limitar o aumento da transcriÃÃo de IL-8. A Ala-Gln parece tornar a cÃlula mais reativa frente aos estÃmulos lesivos, aumentando sua capacidade de resposta atravÃs do aumento transcricional de IL-8, NF-kB e TLR5. Por outro lado o aumento da expressÃo proteica de IL-6 parece ser um dos mecanismos pelas quais Ala-Gln promove efeito protetor sobre a barreira epitelial intestinal.