Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias con mención en Microbiología. / El telurito es un compuesto tóxico para Escherichia coli que genera un aumento de las especies reactivas de oxígeno, protoporfirina IX y en general un desbalance en el metabolismo celular. Genes del metabolismo del nitrato son inducidos en presencia de telurito, lo que se ha relacionado con la contribución de la nitrato reductasa A (NR A) en la resistencia al tóxico. Sin embargo, no se ha estudiado la implicancia de esta vía –reducción de nitrato y nitrito- en la resistencia a telurito. A pesar de la contribución de NR A en la resistencia al tóxico, la reducción de nitrato a nitrito puede ser perjudicial dados los efectos deletéreos del nitrito para la célula, llevando a proponer que las enzimas responsables de disminuir sus niveles en el citoplasma también contribuyen a la resistencia a telurito. Se estudió el crecimiento de cepas mutantes en los genes napA, nirB y nrfA en medio MD con nitrato y se encontró que las dos primeras son más afectadas por el tóxico que la cepa control. Esto sugiere que la nitrato reductasa periplasmática y la nitrito reductasa del citoplasma contribuyen a la resistencia a telurito por disminución de los niveles de nitrito en el citoplasma. Concordante con ello, mutantes carentes de genes que especifican las nitrito reductasas (nirB y nrfA) son más sensibles a la adición conjunta de nitrito y telurito que la cepa control. Para el análisis de los resultados se utilizó el área bajo la curva de crecimiento de cada cultivo, ya que esta métrica refleja en un único valor el tamaño inicial de la población, la velocidad de crecimiento y el crecimiento máximo del cultivo. Además, y dada la capacidad del nitrito de generar óxido nítrico, las cepas mutantes en genes de la maquinaria celular de destoxificación del radical -norR, norV y hmp- también son más sensibles a telurito que la cepa control en medio MD con nitrato. Esto sugiere que la generación de óxido nítrico y especies reactivas de nitrógeno podrían subyacer la toxicidad del telurito en cultivos que crecen en presencia de nitrato. / Tellurite is a toxicant for Escherichia coli which generates increased reactive oxygen species, protoporphyrin IX and in general, an unbalance in cellular metabolism. Genes involved in nitrate metabolism are induced in the presence of tellurite, which has been related to the contribution of nitrate reductase A (NR A) to the toxicant resistance. However, the involvement of this pathway -nitrate and nitrite reduction- in tellurite resistance has not been studied. Despite the contribution of NR A to the toxicant resistance, reduction of nitrate to nitrite can be harmful given the dangerous effects of nitrite inside the cell, thus allowing the proposal that the citoplasmic enzymes responsible for decreasing its levels also contribute to tellurite resistance. Growth of mutants napA, nirB and nrfA was studied using MD medium containing nitrate, E. coli ΔnapA and ΔnirB were more affected by the toxicant than the control strain. This suggests that periplasmic nitrate reductase and cytoplasmic nitrite reductase contribute to tellurite resistance by decreasing nitrite levels in the cytoplasm. In support of this, mutants lacking genes encoding nitrite reductases (nirB and nrfA) are more sensitive than controls regarding the addition of nitrite and tellurite. Results were expressed as area under the growth curve, since this metric reflects in a single value the initial population size, growth rate and the maximum growth of the culture. In addition, and in accordance with the nitrite's ability to generate nitric oxide, mutants in the cellular detoxification machinery of the radical -norR, norV and hmp- were also more sensitive to tellurite than the control strain in MD medium containing nitrate; thus suggesting that nitric oxide and reactive nitrogen species generation could help tellurite toxicity in the presence of nitrate.

Thesis (Ph. D.)--Boston University, 1994. / The Escherichia coli mannitol permease (EIIMtl) is a 68 kilodalton (kDa) membrane-bound protein that carries out phosphoenolpyruvate-dependent transport and phosphorylation of D-mannitol. This protein also catalyzes a phosphoexchange reaction between mannitol and mannitol-1-phosphate and acts as a chemotactic receptor for mannitol in this bacterium. The gene that encodes this protein, mtlA, has been cloned and sequenced. A structural model for the EIIMtl has been previously proposed based upon hydropathy analysis of the deduced amino acid sequence of mtlA, proteolysis studies, and 'phoA fusion analysis. According to this model, the N-terminal domain (residues 1-334) is comprised of six or seven membrane-spanning alpha-helices and the C-terminal domain (residues 335-637), which contains two phosphorylation sites, is exposed to the cytoplasm. A series of mtlA deletion mutants was constructed for further analysis of structure/function relationships in the mannitol permease. In this study, several deletion mutants are selected for characterization of their mannitol binding activity, insertion/stability in the membrane, and oligomerization. The results showed that [TRUNCATED]

Memoria para optar al título de Ingeniero Civil Químico / Memoria para optar al título de Ingeniero Civil en Biotecnología / En búsqueda de un sistema de expresión recombinante que reduzca los requerimientos de purificación respecto a los de alternativas existentes, se optó por desarrollar la secreción inducible. Para esto fue necesario definir los componentes del sistema junto con la variable operacional de control, cuya modificación activa la liberación de las proteínas producidas desde la célula hospedera al sobrenadante del cultivo. Las proteínas autotransportadoras poseen un sistema de secreción eficiente y constan de dos dominios distintivos en su forma madura: el dominio pasajero (DP), unidad funcional que se expone al medio extracelular, y la unidad de translocación (UT), que se inserta en la membrana externa para permitir el paso del DP desde el periplasma. Dentro de esta familia, el antígeno 43 (Ag43) de Escherichia coli K12 representa un candidato ideal como base para el sistema de expresión. El enlace peptídico que une al DP y la UT es clivado autoproteolíticamente y posteriormente ambos dominios permanecen asociados por interacciones no covalentes, por lo que se pueden separar fácilmente. Si en el corte o la asociación participan aminoácidos con cadenas laterales ácidas o básicas, una modificación en el pH del medio podría alterar su interacción, cambiando la tasa de liberación del DP. Para identificar la zona dentro de la proteína que cataliza la proteólisis se diseñaron variantes de Ag43 nativa con distintos segmentos del DP y enhanced green fluorescent protein (EGFP) como módulo reportero. Se construyeron mediante Gibson Assembly en vectores pET22 y luego se indujo su expresión. Analizando proteínas quiméricas tanto de células enteras como lisadas se comprueba que el corte ocurre incluso cuando se elimina el sitio activo propuesto en literatura, correspondiente a un motivo aspartil-proteasa dentro del DP. Utilizando la fluorescencia de EGFP se monitoreó la localización del DP en función del tiempo paralelamente en medios con pH 7, 6 y 5, observándose una disminución en la liberación hacia el sobrenadante a medida que éste se acidifica. Se determinó que el segmento del DP necesario para la autoproteólisis son sus últimos 50 aminoácidos (extremo carboxilo), lo que refuta el supuesto de que el sitio identificado previamente es responsable del corte. Dado que el pH óptimo de cultivo para E. coli es de 7 y la liberación máxima en el sobrenadante se registró para el mismo pH, se descarta la acidificación del medio como método para inducir la secreción. Existe la posibilidad de mantener la secuencia nativa y estudiar el comportamiento del fenómeno frente a cambios en otras variables de operación o identificar con exactitud los aminoácidos clave para el corte y la asociación entre dominios con el fin de someterlos a Ingeniería de Proteínas.

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / En el metabolismo heterotrófico, NADH y NADPH se producen a partir de la oxidación de intermediarios por las deshidrogenasas presentes en las vías del metabolismo central. Durante el crecimiento de Escherichia coli en glucosa como única fuente de carbono, un tercio de la producción total del NADPH proviene de las deshidrogenasas de la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato: la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Diversos grupos han estudiado como se altera la fisiología de E. coli cuando se modifican las razones NADH/NAD y NADPH/NADP, encontrando que la sobreproducción de NADPH puede llevar a la inviabilidad celular cuando se utiliza glucosa como única fuente de carbono. Estudios para comprender la importancia del balance de cofactores han llevado a cambiar la especificidad de sustrato de estas enzimas, de modo que puedan usar NAD como cofactor en lugar de NADP. Este enfoque ha sido fructífero en el caso de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, pero no en el caso de 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Esta enzima cataliza la descarboxilación de 6-fosfogluconato para producir ribulosa 5-fosfato, usando NADP como cofactor con alta especificidad. Una forma de estudiar este problema es investigando el efecto en el metabolismo, de forzar el flujo de glucosa hacia la vía de las pentosas fosfato. Bajo condiciones de crecimiento en glucosa, la sobreproducción de NADPH generaría una reducción significativa de la tasa de crecimiento de E. coli. La hipótesis de este trabajo es que el cambio de especificidad in vivo de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa de Escherichia coli desde NADP a NAD, permite una recuperación parcial en la tasa de crecimiento en una cepa Δpgi ΔudhA, incapaz de sobrevivir en medio mínimo con glucosa como única fuente de carbono, debido a la alteración en la topología de las vías centrales del metabolismo. Para cambiar la especificidad por cofactor de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa, en este trabajo, se implementaron metodologías de diseño racional y evolución dirigida para lograr la forma NAD específica. Para identificar posiciones determinantes de la especificidad por NAD(P) se realizó un análisis de traza evolutiva de la familia 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Se encontró 3 loops que serían relevantes para la especificidad por NAD(P), incluyendo el motivo NRX3K contenido en el loop β2-α2 del bolsillo de unión a dinucleótido en la enzima de E. coli. Desde este análisis, se generó mediante mutagénesis sitio dirigida la variante N33D-R34V-S35K-K38N. Debido a la presencia de estas mutaciones, la KM para NAD disminuyó 5 veces mientras que no se observó actividad con NADP. Se generó la cepa de E. coli Δpgi Δ(edd-eda) ΔudhA Δgnd mediante la eliminación del gen de fosfoglucosa isomerasa, el operón Entner-Doudoroff, de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa y de la transhidrogenasa UdhA, que reoxida el NADPH. Esta cepa presentó una marcada disminución en la tasa de crecimiento debido al incremento en la producción de NADPH al desviar el flujo de glucosa a través de la vía de las pentosas fosfato. Esta mutante se transformó con un plásmido que poseía la versión del gen de 6-fosfogluconato deshidrogenasa dependiente de NAD, encontrándose que la presencia de la 6-fosfogluconato deshidrogenasa productora de NADH le permite a esta bacteria recuperar la capacidad de crecer en medio mínimo suplementado con glucosa como única fuente de carbono. Para incrementar la especificidad de la enzima por NAD, se generó una librería por mutagénesis de saturación de sitios en 4 residuos dentro de los 3 loops. Además, se desarrolló un sistema de selección basado en la cepa de E. coli Δpgi Δ(edd-eda) ΔudhA Δgnd. Debido a las diferencias en las velocidades de crecimiento, se logró diseñar un sistema de selección basado en el enriquecimiento de cultivo, aislando aquellas cepas que estaban complementadas con 6-fosfogluconato deshidrogenasa productora de NAD. Sin embargo, al usar el protocolo propuesto se observó que los niveles de expresión de las variantes de enzimas varían considerablemente entre antes y después de someter la cepa a selección en medio mínimo, por lo que el protocolo debe ser optimizado para que el cepa sea utilizada como sistema de selección para una librería de variantes 6-fosfogluconato deshidrogenasa. De este trabajo se concluye que el uso in vivo de una variante de 6-fosfogluconato deshidrogenasa con un cambio de especificidad de cofactor desde NADP a NAD, permite recuperar parcialmente el crecimiento en medio mínimo suplementado con glucosa como única fuente de carbono, probablemente debido a modificaciones en el balance de los cofactores NAD(P)H/NAD(P). Finalmente, la relación entre el crecimiento y la especificidad de las deshidrogenasas del metabolismo central puede ser utilizada como método de selección de variantes con especificidad de cofactor cambiada de NADP a NAD mediante evolución dirigida / In the heterotrophic metabolism, NADH and NADPH are produced from the oxidation of intermediates by dehydrogenases present in central metabolism pathways. During the growth of Escherichia coli in glucose as sole carbon source, one third of the total NADPH production belongs to the oxidative branch of the pentose phosphate pathway: the glucose 6-phosphate dehydrogenase and the 6-phosphogluconate dehydrogenase. Several groups have been studying how the E. coli physiology is modified when NADH/NAD and NADPH/NADP are altered, finding that NADPH overproduction could lead to cell unviability when glucose is the sole carbon source. Studies to understand the importance of cofactor balance have lead to change the substrate specificity of theses enzymes, in order to use NAD as cofactor instead of NADP. This approach has been succeeding for glucose 6-phosphate dehydrogenase, but not for 6-phosphogluconate dehydrogenase. This enzyme catalyzes the decarboxylation of 6-phosphogluconate to produce ribulose 5-phosphate, using NADP as cofactor with high specificity. One form of to study this problem is investigating the effect in the metabolism, due to force the glucose flux through the pentose phosphate pathway. Under glucose growth conditions, NADPH overproduction would generate a significant reduction in growth rate of E. coli. The hypothesis of this work is that the specificity change in vivo of the 6-phosphogluconate dehydrogenase from E. coli, from NADP to NAD, allows to restore partially the growth rate in a Δpgi ΔudhA strain, unable to grow in minimal media with glucose as sole carbon source, due to modifications in the topology of the central metabolism pathways. To change the cofactor specificity of the 6-phosphogluconate dehydrogenase, in this work, rational design and directed evolution methodologies were implemented to obtain the NAD-specific form. To identify determinants positions of the NAD(P) specificity, evolutionary trace analysis to the 6-phosphogluconate dehydrogenase family was performed, finding 3 loops that could be relevant for NAD(P) specificity, including the β2-α2 loop containing the NRX3K motif of the dinucleotide binding pocket of the E. coli enzyme. From this analysis, the variant N33D-R34V-S35K-K38N was generated by site-directed mutagenesis. Due the presence of these substitutions, the NAD KM decreased 5-times and no activity was observed with NADP. A E. coli Δpgi Δ(edd-eda) ΔudhA Δgnd strain was generated by deleting phosphoglucose isomerase gen, Entner-Doudoroff operon, 6-phosphogluconate dehydrogenase and UdhA transhydrogenase, which reoxidize NADPH. This strain shows a remarkable decreased growth rate due to NADPH production increment by forcing glucose flux through pentose phosphate pathway. This strain was transformed with a plasmid bearing a 6-phosphogluconate dehydrogenase gen variant NAD-dependent, finding that the presence of the NADH-producing 6-phosphogluconate dehydrogenase allows the bacteria to restore the capacity to grow in minimal media with glucose as sole carbon source. In order to increase the NAD specificity, a clone library by site-saturation mutagenesis of 4 residues within the 3 loops was performed. In addition, a selection strategy based on the designed strain was developed. Since the growth rates differences, a selection system based on enrichment culture, isolating NAD-producing 6-phosphogluconates bearing strains. However, with the proposed protocol, enzymes variants expression levels vary between before and after strain culturing in minimal media, so the protocol must be optimized in order to use the strain as a selection system for a 6-phosphogluconate dehydrogenase library. We conclude from this work that the usage in vivo of a 6-phopshogluconate dehydrogenase variant with a specific change from NADP to NAD, allows partially restore the growth rate of an unviable strains in glucose as sole carbon source, probably by modifications in the NAD(P)H/NAD(P) cofactors balance. Finally, the relation between growth rate and central metabolism dehydrogenase specificity can be used for biotechnological purposes, like a selection system for directed evolution / FONDECYT 1121170 y 1140754 ; CONICYT PCHA/Beca Magíster

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) es un patógeno zoonótico emergente, que puede causar enfermedades severas en humanos, como colitis hemorrágica (CH) y síndrome hemolítico urémico (SHU). Se han reportado infecciones con STEC en personas producto del contacto directo con animales de compañía, y de estos se han aislado cepas de este patógeno con virulotipo asociado a enfermedad severa. Sin embargo, en Chile a la fecha no se encuentra información disponible al respecto. Por esta razón, este proyecto busca aportar con información sobre la caracterización de cepas de STEC circulantes en parte de la población canina y felina nacional. Para cumplir con lo anterior, se recolectaron torulados rectales de 300 perros y 300 gatos mascotas, entre octubre y diciembre del año 2018. Se realizaron dos rondas de cultivo, en caldo tripticasa de soya y en agar MacConkey; y mediante PCR se buscó determinar la presencia de los genes stx1 y stx2 con el fin de identificar cepas de STEC en las muestras obtenidas. Además, se contempló la detección de los genes eae, lpf, saa y hlyA en las cepas de STEC aisladas. Sin embargo, con esta metodología no fue posible el aislamiento de cepas de STEC en las muestras procesadas. En vista de los resultados obtenidos podemos concluir que los perros y gatos con dueño en algunas comunas de la Región Metropolitana representarían un riesgo bajo en la transmisión de cepas de STEC con determinantes de virulencia asociados a CH y SHU en las personas. Sin embargo, es necesaria la realización de otros estudios, con un mayor tamaño muestreal y que analicen las distintas variables que puedan afectar la colonización de STEC en estos animales. / Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is an emerging zoonotic pathogen, which can cause severe diseases in humans, such as hemorrhagic colitis (HC) and haemolytic uraemic syndrome (HUS). Infections have been reported in people as a result of direct contact with companion animals, and from these STEC strains with virulotype associated with severe disease have been isolated. However, to date in Chile there is no information available about it. For this reason, this project seeks to provide information on the characterization of circulating STEC strains in part of the national dog and cat population. In order to comply with the above, rectal swabs from 300 dogs and 300 pet cats were collected between October and December of 2018. Two rounds of culture were carried out in tripticase soy broth and on MacConkey agar; and by means of PCR, the presence of the stx1 and stx2 genes was attempted in order to identify STEC strains in the samples obtained. In addition, the detection of eae, lpf, saa and hlyA genes in the isolated STEC strains was contemplated. However, with this methodology it was not possible to isolate STEC strains in the processed samples. In view of the results obtained, we can conclude that household dogs and cats in some communes of the Metropolitan Region would represent a low risk in the transmission of STEC strains with virulence determinants associated with HC and HUS in people. However, it is necessary to carry out further studies, with a larger sample size and that address the different variables that may affect the colonization of STEC in these animals. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt Iniciación N° 11170363

Escherichia coli enteropatogéna (EPEC) se encuentra entre una de las principales causantes de diarrea en niños de países en vías de desarrollo, estas bacterias pueden ser calsificadas en típicas (tEPEC) y atípicas (aEPEC) dependiendo de la presencia o ausencia de un plásmido llamado EAF (E. coli adherence factor), respectivamente. El objetivo de este estudio fue describir la diversidad alélica de genes de virulencia de EPEC, el fenotipo, y su relación con las características clínicas. Se analizaron 120 cepas de EPEC aisladas de un estudio de cohorte en niños menores de un año en Lima. Utilizando la técnica de PCR-RFLP se caracterizaron los alelos de los genes eae (intimina), bfpA (proteína bundlina del bundle-forming pilus) y perA (plasmid encoded regulator). El fenotipo de EPEC fue evaluado mediante la precipitacion de proteínas secretadas (EspA, EspB, EspD y EspC), el ensayo de adherencia y el ensayo de polimerización de actina (FAS). Las cepas aEPEC (eae+, bfp-) fueron más comunes, tanto en casos de diarrea (54/74, 73%) como en controles (40/46, 87%). Del total de cepas evaluadas se encontraron 13 alelos del gen eae; los más frecuentes fueron: beta (34/120, 28%), theta (24/120, 20%), kappa (14/120, 12%) y mu (8/120, 7%). Se encontraron 5 alelos de bfpA; los más frecuentes fueron: beta1/7 (10/26), alpha (7/26) y beta5 (3/26). El alelo gamma del gen eae fue el más frecuente entre los episodios de diarrea de larga duración (> 7 días) que en los de menos duración (3/26, 12% vs. 0/48, 0%, p menor 0.05). Por otro lado, el alelo kappa del gen eae está relacionado con un puntaje cliníco más severos en comparación a otros alelos (p menor 0.05). De los cuatro patrones de adherencia encontrados LA (adherencia localizada); LAL (similar a la LA); DA (adherencia difusa) y IS/NA (bacterias aisladas/no adherencia), el patrón LA se encontró muy frecuente en las tEPEC (eae+, bfpA+) versus las aEPEC dentro de los casos de diarrea (6/8, 75% vs. 2/38, 5%, p menor 0.05), mientras el patrón IS/NA estuvo relacionado a las aEPEC versus las tEPEC en los casos de diarrea (26/38, 68% vs. 1/8, 13%, p menor 0.05). Se encontró que la polimerización de actina estuvo más relacionada a las tEPEC que a las cepas aEPEC en los casos de diarrea (6/8, 75% vs. 1/38, 3%, p menor 0.05). / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) strains are amongst the major causes of infantile diarrhea in developing countries and can be classified as typical (tEPEC) atypical (aEPEC), depending on the presence or absence of the E. coli adherence factor plasmid (pEAF), respectively. The aim of this study was to describe the allelic diversity of critical virulence EPEC genes, phenotype; and the association of these results with clinical characteristics. 120 EPEC strains isolated from a cohort diarrhea study in Peruvian children were characterized for the allele of eae (intimin), bfpA (bundling pilin protein of bundle-forming pilus) and perA (plasmid encoded regulator) genes by PCR-restriction fragment length polymorphism. The EPEC phenotype was evaluated using, the protein precipitation assay (EspA, EspB, EspD y EspC), the adherence and the actin polymerization assay (FAS). aEPEC strains (eae+, bfp-) were the most common pathotype in diarrhea (54/74, 73%) and control samples from children without diarrhea (40/46, 87%). Overall there were 13 eae alleles; the most common were beta (34/120, 28%), theta (24/120, 20%), kappa (14/120, 12%) and mu (8/120, 7%). There were 5 bfpA alleles; the most common were beta1/7 (10/26), alpha3 (7/26) and beta5 (3/26). There were 3 perA alleles: beta (8/16), alpha (7/16) and gamma (1/16). The gamma-intimin allele was more frequently found in diarrhea episodes of longer duration (>7 days) than shorter (3/26, 12% vs. 0/48, 0%, p less than 0.05). The kappa-intimin allele had the highest clinical severity score in comparison to other alleles (p less than 0.05). Of the four adherence patterns found: LA (localized adherence); LAL (LA-like); DA (diffuse adherence) and IS/NA (isolated strain/ not adherence); LA pattern was more related to tEPEC (eae+, bfpA+) than aEPEC in diarrhea cases (6/8, 75% vs. 2/38, 5%, p less than 0.05). The IS/NA pattern was related to aEPEC compared to tEPEC in diarrhea cases (26/38, 68% vs. 1/8, 13%, p less than 0.05). We found that the actin polimerization (P) was significantly associated to tEPEC in both, diarrhea (6/8, 75% vs. 1/38, 3%, p less than0.05). / Tesis

Decay kinetics of bacteria in biological wastewater treatment systems are vital to efficient design and operation of treatment plants.  Of special concern are decay characteristics of fecal indicator organisms, which can aid design of wastewater treatment processes to eliminate fecal pathogens.  This study focuses on characterizing the decay of three strains of the key fecal indicator bacterium, Escherichia coli, and comparing microbial techniques for quantifying decay rates.  Traditional metrics for monitoring decay include volatile solids and plate counts, which may not provide the full picture of specific decay dynamics. In particular, the viable-but-not-culturable growth phase is challenging to assay.  Recently, more specific molecular techniques have been developed, such as DNA and RNA extraction with qPCR and RT-qPCR, ATP assays and live/dead cell-staining.  However, these assays have not been widely accepted or bench-marked against traditional techniques.  It is expected that molecular assays will generate kinetic constants that better reflect the viability and activity of the bacteria as they decay, generating a more integrated understanding of the decay process.  Cells grown in pure culture were spiked into microreactors and subjected to a variety of time/temperature treatments in both buffered pure culture and sludge matrices.  These scenarios were intended to mimic on a small scale typical waste treatment processes, more specifically pasteurization, thermophilic digestion and land application.  Results indicate decay curves similar to traditional curves but with constants that vary with respect to the strains and the characterization methods used.  The foundation laid by this work can be utilized in further studies involving other organisms in a variety of environmental scenarios. / Master of Science

Plants are abundant in cytochrome P450s constituting about 1% of their protein coding genes. Some of these P450s catalyze oxidation reactions in metabolic pathways that lead to valuable compounds, like the anticancer drug paclitaxel, the blue pigment indigo and the promising antileukemic agent indirubin. The promiscuous nature of P450 catalysis enables simultaneous production of indirubin and indigo from a common substrate, but it also decreases the yield of paclitaxel in both plants and heterologous hosts, respectively. In this thesis, the catalytic promiscuity of CYP725A4 from Taxus cuspidata and CYP71B102 from Isatis tinctoria were investigated. CYP725A4 and CYP71B102 are involved in the biosynthesis of paclitaxel and indigo/indirubin pathways, respectively. CYP725A4 is known to catalyze the hydroxylation of endotaxadiene to taxadiene-5α-ol (T5α-ol), a precursor to paclitaxel, while CYP71B102 catalyzes the production of indigo and indirubin via hydroxylation of indole. CYP725A4 exhibited catalytic promiscuity upon heterologous expression in Escherchia coli producing 5(12)-oxa-3(11)-cyclotaxane (OCT) and 5(11)-oxa-3(11)-cyclotaxane (iso-OCT) as major products, and T5α-ol as a minor product with trace amounts of unidentified monooxygenated taxanes. The presence of T5α-ol was confirmed by comparing its gas chromatography and mass spectroscopy (GC-MS) retention time and spectrum with a standard T5α-ol, while those of others were verified by matching mass spectra from previous studies. Coexpression of CYP725A4 with cytochrome P450 reductase, CPR (as either fused or separate proteins) and cytochrome b5 (Cb5) did not affect the ratios of OCT, iso-OCT, and T5α-ol, although Cb5 had an apparently negative impact on CYP725A4 activity. Attempts to modify the catalytic promiscuity of CYP725A4 were conducted by mutating key residues at the active site of the enzyme. A mutant V3741 increased the production of T5α-ol by ~10 fold, although it still supported the formation of OCT and iso-OCT as major products. The levels of these compounds in V374I were almost 45% less than in native CYP725A4. Site-directed mutagenesis was also performed on taxadiene synthase (TS) to find a mutant that only produced exotaxadiene, which could be provided to CYP725A4 as an alternative substrate. Among the TS mutants generated, none were capable of producing only exotaxadiene, but two of the TS mutants, Y684C and Q609E, produced a reasonable amount of exotaxadiene. However, coexpression of these mutants with CYP725A4 and TCPR continued to produce OCT and iso-OCT. When CYP71B102 was expressed in E. coli, indigo was the main product, while indirubin and 2-oxindole were minor products, as verified by high-performance liquid chromatography (HPLC). Half-strength terrific broth (TB) medium in combination with 5-aminolevulinic acid supplementation and isatin hydrolase coexpression altogether increased indigo formation, while supplementation with isatin and 2-oxindole increased indirubin formation. The results of this study showed that the catalytic promiscuity of CYP725A4 and CYP71B102 could be modulated by metabolic and enzyme engineering to increase the yield of commercially important compounds, like paclitaxel, indigo and indirubin.

This document only includes an excerpt of the corresponding thesis or dissertation. To request a digital scan of the full text, please contact the Ruth Lilly Medical Library's Interlibrary Loan Department (rlmlill@iu.edu).

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