In this Thesis I present simulation- and theory-based studies of pattern formation and growth in collections of micro-organisms, in particular bacterial colonies. The aim of these studies is to introduce simple models of the 'micro-scale' behaviour of bacterial cells in order to study the emergent behaviour of large collections of them. To do this, computer simulations and theoretical techniques from statistical physics, and in particular non-equilibrium statistical physics, were used, as the systems under study are far from thermodynamic equilibrium, in common with most biological systems. Since the elements making up these sytems - the micro-organisms - are active, constantly transducing energy from their environment in order to move and grow, they can be viewed as `active matter' systems. First, I describe my work on a generalization of an archetypal model of active matter - the Vicsek model of flocking behaviour - in which the speed of motion of active particles depends on the local density of particles. Such an interaction had previously been shown to be responsible for some forms of pattern formation in bacterial colonies grown on agar plates in the laboratory. Simulations and theory demonstrated a variety of pattern formation in this system, and these results may be relevant to explaining behaviour observed in experiments done on collections of molecular motors and actin fibres. I then go on to describe work on modelling pattern formation and growth in bacterial biofilms - dense colonies of cells growing on top of solid surfaces. I introduce a simple simulation model for the growth of non-motile cells on a flat surface, whereby they move only by growing and pushing on each other as they grow. Such colonies have previously been observed experimentally to demonstrate a transition from round to 'branched' colonies, with a pattern similar to diffusion-limited aggregation. From these simulations and analytical modelling, a theory of the growth of such colonies is developed which is quite different from previous theories. For example, I find that the colony cannot grow at a constant speed if the cells are not compressible. Finally, I present some results on genetic drift and evolution in growing bacterial colonies. Genetic drift is greatly enhanced in colonies which are expanding in space, as only a few individuals at the edge of the population are able to pass on their genes onto their progeny. The individual-based simulations of biofilms described above are used to analyse which factors - such as the shape of the colony, the thickness of the growing layer of cells, and the interactions between the cells - affect the rate of genetic drift and the probability of fixation of beneficial mutations. This has implications, for example, for the evolution of antibiotic resistance in such colonies.

Les lésions iléales de patients atteints de maladie de Crohn (MC) sont anormalement colonisées par Escherichia coli adhérent et invasif (AIEC). Les mutations du gène NOD2 sont un facteur de risque pour la MC iléale et diminuent la clairance bactérienne. Le système immunitaire inné et la flore commensale sont indispensables au maintien de l’intégrité de la barrière intestinale. Le but de notre étude est d’évaluer l’impact d’un déséquilibre de la flore commensale induit par un traitement antibiotique sur la colonisation par AIEC chez des souris sauvages (WT) et NOD2 knock-out (NOD2KO), et les conséquences sur l'inflammation intestinale.MÉTHODE : Après un traitement antibiotique de 3 jours par voie orale, des souris WT et NOD2KO sont infectées avec 10^9 UFC d'AIEC (06362 ou LF82) une fois par jour pendant 2 jours. Les contrôles sont constitués de souris non infectées et de souris infectées sans traitement antibiotique. Les animaux sont sacrifiés à J1, J5 et J60 après l’infection par AIEC. En parallèle, des souris WT sont infectées par AIEC consécutivement à un traitement par dextran sodium sulfate (DSS) et sont sacrifiées 9 jours plus tard. Des échantillons de côlon, d’iléon, et tissus mésentériques sont prélevés pour 1) quantifier AIEC dans les muqueuses colique et iléale, 2) étudier la translocation bactérienne et 3) évaluer les signes d’inflammation histologiques et moléculaires. RÉSULTATS : Sans traitement antibiotique, AIEC n’est pas capable de coloniser les souris WT et NOD2KO. Comparé aux animaux non traités, le traitement antibiotique a permis une augmentation significative de la colonisation des flores adhérentes colique et iléale par AIEC chez les souris WT et NOD2KO. Une colonisation persistante par AIEC était encore observée à J5 uniquement chez les souris NOD2KO, mais n’était plus détectée à J60. La translocation mésentérique d’AIEC était observée uniquement chez les souris NOD2KO. De plus, on remarque une plus grande sensibilité des souris NOD2KO traitées par antibiotiques à la colonisation intestinale par des entérobactéries opportunistes potentiellement pathogènes. Aucun signe d’inflammation intestinale histologique ou moléculaire n’est observé chez les souris WT et NOD2KO traitées par antibiotiques et infectées par AIEC. Au cours de la colite induite par le DSS, une colonisation et une persistance d'AIEC ont été observés dans le côlon. De plus, une augmentation dramatique des paramètres clinique, histologique et moléculaire de la colite a été observé chez les souris infectées par AIEC mais pas chez les souris infectées par une souche d'E. coli commensale.CONCLUSION : Le traitement antibiotique était nécessaire à la colonisation de l'intestin et des tissus mésentériques par AIEC, et la persistance d'AIEC était dépendante de NOD2. AIEC a exacerbé une colite préexistante induite par le DSS chez les souris WT. / Ileal lesions of Crohn's disease (CD) patients are abnormally colonized by adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). NOD2 gene mutations are risk factors for CD and impair bacterial clearance. Since innate immune system and commensal microbiota are critical to maintain intestinal barrier integrity, we evaluated the impact of commensal microbiota disruption induced by short term antibiotic treatment on AIEC colonization in wild type (WT) and NOD2 knock-out mice (NOD2KO), and the consequences on intestinal inflammation. Methods: After 3 days of oral antibiotic treatment, WT and NOD2KO mice were infected with 10^9 CFU AIEC once a day for 2 days. Controls are constitued by non infected mice and mice challenged with AIEC without antibiotic treatment. Animals were sacrificed 1, 5 and 60 days after AIEC administration. In parallel, mice were challenged with AIEC subsequent to a dextran sodium sulfate (DSS) treatment and sacrificed 9 days later. Ileum, colon, and mesenteric tissues were sampled for 1) AIEC quantification in ileal and colonic tissues, 2) bacterial translocation, and 3) evaluation of intestinal inflammation. Results: Without antibiotic treatment, AIEC was not able to colonize WT and NOD2KO mice. Compared with non-treated animals, antibiotic treatment led to a significant increase in ileal and colonic adherent AIEC colonization in both WT and NOD2KO mice. Persistent AIEC colonization was still observed until day 5 only in NOD2KO mice, disappearing at day 60. Mesenteric translocation of AIEC was observed only in NOD2KO mice. Morover, NOD2KO mice treated with antibiotics were more colonized by opportunistic enterobacteria. No inflammation was observed in WT and NOD2KO mice treated with antibiotics and infected with AIEC. During DSS-induced colitis, colonization and persistence of AIEC was observed in the colon. Moreover, a dramatic increase in clinical, histological, and molecular parameters of colitis was observed in mice infected with AIEC but not with a commensal E. coli strain.Conclusion: Antibiotic treatment was necessary for AIEC colonization of the gut and mesenteric tissues and persistence of AIEC was dependent on NOD2. AIEC exacerbated a preexisting DSS-induced colitis in WT mice.

Identifica grupos filogenéticos de Escherichia coli aislados a partir de hisopados rectales de neonatos alpacas (Vicugna pacos) con diarrea. El muestreo se realiza con hisopos estériles y es transportado en medio Stuard, el aislamiento en agar Mc Conkey y la identificación por pruebas bioquímicas convencionales. E. coli es aislada de 119 muestras de un total 150 colectadas. La determinación de los grupos filogenéticos se realiza mediante la utilización del método de PCR triplex descrito por Clermont et al. (2000), para clasificar a E. coli en 4 grupos filogenéticos A, B1, B2 y D, basándose en 3 marcadores genéticos chuA, yjaA y TSPE4.C2. Determina que los grupos filogenéticos B1 y D tienen mayor frecuencia con 65.55% y 19.33 %, respectivamente; el grupo filogenético menos frecuente es el B2 con 1.68%. Cabe resaltar que esta es la primera investigación realizada en el Perú para agrupar cepas patógenas de E. coli basado en la agrupación filogenética.

Doctor of Philosophy / Department of Animal Sciences and Industry / J. S. Drouillard / The first chapter of this dissertation reviews factors affecting E. coli O157:H7 prevalence in the gastrointestinal tracts of cattle. Chapter 2 assessed E. coli O157:H7 ability to use bovine intestinal mucus and its constituents as substrates for growth in vitro in the presence and absence of fecal inoculum and exogenous enzymes. Whole mucus supported the greatest pathogen growth (P < 0.05), but all components tested were able to sustain E. coli growth. Chapter 3 evaluated the impact of crude glycerin feeding on E. coli O157 fecal shedding by cattle fed growing and finishing feedlot diets with corn or a combination of corn, distiller’s grains, and soybean hulls. Increasing levels of crude glycerin decreased incidence of E. coli O157 in growing cattle (linear effect, P < 0.01) and tended to do so in finishing cattle fed corn-based diets (P < 0.06). No effect of glycerin was observed in finishing cattle fed the byproduct-based diets (P > 0.05), highlighting potential for glycerin use as a means for controlling fecal prevalence of E. coli O157 in cattle fed conventional grain-based diets. Chapter 4 evaluated transportation and lairage effects on fecal shedding of E. coli in feedlot cattle by mimicking transport to the abattoir. Shedding patterns were influenced by transportation, with significantly lower E. coli O157 prevalence in transported animals 4 hours after transit (P < 0.05). Additional post-transit samplings are, however, needed to confirm effects of transport stress on pathogen prevalence and shedding patterns. The experiment summarized in chapter 5 evaluated the potential for utilizing fecal long-chain fatty acid (LCFA) profiles as an indicator of E. coli O157 status. Out of 39 LCFA evaluated, only eicosapentaenoic acid (EPA) concentration was associated with presence of the pathogen (P < 0.02). The final chapter assessed the impact of dietary menthol, up to 0.3% of diet DM, on antimicrobial resistance in commensal E. coli. Menthol addition affected prevalence of tetracycline resistant E. coli, but contrary to our hypothesis, increased their occurrence after 30 days of treatment (P < 0.006). No hypothesis on mechanism responsible for this increase could be made from the present study.

Master of Science / Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology / Daniel U. Thomson / A total of 284,300 animals from 10 commercial feedyards in Nebraska and Colorado were used to evaluate the effectiveness of a siderophore-receptor/porin protein-based vaccine under commercial feedlot conditions. Individual feedlots were assigned to 1 of 2 treatments: 1) all incoming cattle injected with 2 ml of SRP E. coli O157:H7 vaccine subcutaneously at arrival and at time of re-implant (VAC) or 2) all incoming cattle were not vaccinated, and were used as negative controls (CON). Twenty freshly voided fecal samples were taken from 5 pen floors of market ready cattle at each feedyard once a month during May, June, July, and August of 2010. Pre-harvest blood samples were collected on 3 occasions throughout the summer (June, July, and August). For each sampling month, 1 lot of 5 animals representing each feedyard was sampled. Fecal and blood samples were shipped to Epitopix, LLC for subsequent microbiology and anti-SRP antibody testing. Samples were coded such that laboratory personnel were blinded to the location and treatment of samples. Cattle receiving VAC treatment had reduced prevalence of E.coli O157:H7 in their feces relative to the E. coli O157:H7 prevalence in the feces of CON cattle (12.83% vs. 20.25% for VAC and CON, respectively; P = 0.07). Anti-SRP antibody titer was higher in the serum from VAC cattle relative to the SRP titer levels in serum obtained from CON cattle (0.622 and 0.075 for VAC and CON, respectively; P < 0.001). These data suggest that vaccination of feedlot cattle with SRP upon arrival at the feedlot and again 70-100 days pre-harvest reduces shedding of E. coli O157:H7.

Escherichia coli (E. coli) is a universally accepted indicator of faecal pollution in water, and can be divided into several groups of which one group would be commensal E. coli (generally the indicator organism), and five diarrhoeagenic E. coli types. Pathogenic E. coli offers attractive possibilities to model the pathogenicity of polluted water that people drink. To date, techniques used for the detection of these pathogens include standard culturing techniques, the use of molecular probes directed against known pathogens and polymerase chain reaction (PCR) for the amplification of known virulence genes, usually after a pre-culturing step. There is however a need to speed up the process and to accurately quantify (for risk purposes) the type and number of E. coli (commensal and pathogenic) present in any given water sample. The use of more recently developed techniques such as real-time PCR and competitive PCR (c-PCR) offers us a way of quantifying the target organism and has been successfully applied in various parts of the world. The aim of this study was to adapt and use developed methodologies that employs both c-PCR and multiplex PCR (m-PCR) to quantify total E. coli, detect and distinguish between the diarrhoeagenic E. coli patho-types present in selected South African water samples without prior culture or enrichment. Using E. coli as a model pathogen, a technique was developed for the concentration of bacteria from water samples, isolation of DNA from bacteria and performing PCR’s on the extracted DNA. Three m-PCR’s were developed directed towards the housekeeping (Mdh) and virulence (eaeA, Stx1, Stx2, ST, LT, Ial and Eagg) genes associated with entero-pathogenic E. coli. c-PCR was performed using the Mdh housekeeping gene, with our modified version of the PCR product used as competitor DNA. Results obtained lead to a protocol consisting of the filtration of 100 mℓ environmental water, DNA extraction directly from the membranes, followed by quantitative c-PCR to screen for PCR inhibition as well as to quantify isolated DNA, thereafter screening of the DNA for the presence of virulence genes with m-PCR. Initial testing with known pathogens showed that this methodology was a viable option. DNA could be recovered from the filters, yielding PCR-ready templates. A total of 49 water samples were collected, these samples included household containers from rural areas, river water from three provinces in South Africa and wastewater from 4 different wastewater treatment plants around Johannesburg (Gauteng province). These water samples were subjected to the above-mentioned protocol with 100 % (49/49) of the samples testing positive for presence of the E. coli Mdh house keeping gene. Of the samples tested, 57 % (28/49) tested positive for EAEC, 0 % (0/49) tested positive for EIEC, 92 % (45/49) tested positive for ETEC, 2 % (1/49) tested positive for atypical EHEC and 0 % (0/49) tested positive for atypical EPEC. 38 percent of the water samples could be successfully quantified by c-PCR and were able to detect as low as 3 cells/mℓ. However, the remaining 62 percent DNA samples (isolated from water samples) was diluted to overcome PCR inhibition but failed to be quantified by c-PCR because the level of target DNA was too low to detect which allowed over competition of the Mdh competitor DNA. In conclusion, this method could successfully isolate E. coli DNA from various water samples. The isolated DNA could be used as PCR template and PCR inhibition could be overcome in all the samples by either diluting the sample or adding PCR facilitators. The PCR was able to amplify low levels of isolated E. coli DNA from most of the water samples and the presence of pathogens could be detected in the water with the m-PCR. Molecular quantification could be used to quantify DNA isolated from the water samples, but one limitation is the detection of very low numbers of E. coli DNA due to the nature of c-PCR, i.e. co-amplification of the target and competitor DNA. / Prof. Paul Jagals Dr. T.G. Barnard Mr. K. Maclean

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El uso indiscriminado de antimicrobianos en animales de producción es la principal causa del aumento de la resistencia bacteriana, por lo que organizaciones intergubernamentales solicitan disminuir el uso excesivo de estos fármacos. La mastitis es causada principalmente por Escherichia coli en la zona central de Chile y, debido a que su tratamiento se concentra en el uso de antimicrobianos, se ha estudiado Aloe barbadensis Miller (Aloe vera) como una alternativa terapéutica por su efecto antimicrobiano. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto inhibitorio “in vitro” de A. vera asociado a Ceftiofur en concentraciones menores a su Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), frente a E. coli ATCC 25922 y en cepas aisladas de vacas con mastitis clínica. Se utilizó el Método de Macrodilución en Caldo. La CMI fue determinada mediante turbidez y confirmada por recuento de UFC/mL y por espectrofotometría UV-visible. Las cepas de campo fueron sometidas a un estudio de sensibilidad (Kirby Bauer) frente a un panel de antimicrobianos antes de analizar el efecto inhibitorio de A. vera. La CMI de A. vera se determinó en 60 mg/mL. La asociación de A. vera/Ceftiofur no inhibió el crecimiento de E. coli ATCC 25922. Todas las cepas de campo presentaron sensibilidad intermedia o resistencia a al menos un antimicrobiano, pero fueron inhibidas por A. vera. Esto sugiere que A. vera es más efectiva en la inhibición del crecimiento de E. coli en comparación a la asociación y podría presentarse como una alternativa terapéutica frente a mastitis clínicas causadas por E. coli. / Proyecto Fondef IDeA CA12I10008

Eine eindeutige Unterscheidung zwischen extraintestinal pathogenen (ExPEC) und kommensalen E. coli-Stämmen zu treffen, fällt häufig schwer, da Virulenz-assoziierte Faktoren von ExPEC auch in kommensalen Stämmen gefunden werden können. Als naher Verwandter des uropathogenen Isolates E. coli CFT073 weist der apathogene, kommensale Stamm E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) die Expression einer Vielzahl solcher „ExPEC-Virulenzfaktoren“ auf. Dazu gehören verschiedene Fimbrien, Siderophore und Proteine, die an der Biofilmbildung beteiligt sind. Der Vergleich des Stammes mit ExPEC-Isolaten lässt daher Rückschlüsse auf die Funktion dieser Faktoren im jeweiligen ökologischen Kontext zu. E. coli Nissle 1917 bildet den sog. rdar-Morphotyp aus, eine multizelluläre Struktur, die auf der Koexpression von Zellulose und Curli-Fimbrien beruht. Dieser findet sich bei vielen E. coli und Salmonella-Spezies, tritt aber in der Regel nur bei Temperaturen unterhalb 30 °C auf. E. coli Nissle 1917 hingegen weist diesen Phänotyp auch bei 37 °C auf, was vermutlich die Kolonisierungsfähigkeit gegenüber anderen kommensalen E. coli erhöht. Hier konnte demonstriert werden, dass die Expression des rdar-Morphotyps bei E. coli Nissle 1917 unabhängig von den bisher beschriebenen Regulatoren CsgD und YaiC ist. Mittels Mutagenese mit dem Transposon miniTn5 wurde nach rdar-negativen Klonen gesucht mit dem Ziel, einen möglichen übergeordneten Regulator dieses Phänotyps zu identifizieren. Bei dieser Untersuchung wurden einige Gene ermittelt, die bislang nicht dafür bekannt waren, die Expression von Zellulose oder Curli-Fimbrien zu beeinflussen. Während die Funktion vieler der ermittelten ORFs unbekannt war, hatte vor allem die Inaktivierung von Genen, die an der Biosynthese von Oberflächenstrukturen (Fimbrien, Kapsel, Colansäure, LPS) einen veränderten Phänotyp zur Folge. Allerdings konnte in den wenigsten Fällen ein Zusammenhang zu Curli- oder Zellulosesynthese hergestellt werden. Es zeigte sich, dass die Regulation des rdar-Morphotyps offenbar komplexer und von mehr Faktoren zumindest indirekt abhängig ist, als bislang beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine 55 kb große genomische Insel untersucht, die im asnW-tRNA-Lokus inseriert ist und die Proteine für die Synthese eines hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids kodiert. Die Insel konnte mittels PCR in extraintestinal pathogenen sowie kommensalen Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 nachgewiesen werden, darunter die Stämme E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073 und J96. Eine Kokultivierung von HeLa-Zellen mit diesen Bakterien hatte eine Blockierung des Zellzyklus und Megalozytose (zytopathischer Effekt) zur Folge. Die Deletion der asnW-Insel führte zur Aufhebung des zytopathischen Phänotyps, der durch Einbringen des Genclusters auf einem BAC-Vektor wieder hergestellt werden konnte. Der zytopathische Effekt konnte nur nach direktem Kontakt der Bakterien mit HeLa-Zellen beobachtet werden und war weder durch Bakterienlysate, abgetötete Bakterien oder Kulturüberstände zu erzielen. Das PKS/NRPS-Gencluster umfasst 18 ORFs (clbA bis clbR), von denen 17 an der Synthese der aktiven Komponente beteiligt sind. Die Anzahl der Genprodukte und die Abfolge der putativen Domänen unterscheidet sich dabei von allen bislang beschriebenen PKS/NRPSSystemen. Untersuchungen zur Transkription ergaben drei monocistronisch und vier teilweise sehr große (bis 23 kb) polycistronisch transkribierte Einheiten aus bis zu sechs ORFs. Zudem konnte eine konstitutive Transkription aller ORFs festgestellt werden, wenngleich in unterschiedlicher Stärke. Nach Kontakt mit HeLa-Zellen wurde keine erhöhte Transkription oder Promotoraktivität einzelner ORFs festgestellt. Daher scheint die Kontaktabhängigkeit des zytopathischen Effekts nicht auf einer durch HeLa-Zellen hervorgerufenen Induktion der PKS/NRPS-Expression zu beruhen. Die Kontaktabhängigkeit konnte durch die Induktion bzw. Überexpression einer PKS/NRPS (clbB), den putativen Schlüsselenzymen Thioesterase (clbQ) und Phosphopantetheinyl-Transferase (clbA) oder dem möglichen Regulator clbR nicht überwunden werden. Mittels Luziferase-Reportergenfusionen konnte ein Einfluss unterschiedlicher Medien und Kulturbedingungen auf die Promotoraktivität einzelner Gene festgestellt werden. Dies wurde auf den Einfluss des BarA/UvrY- Zweikomponentensystems zurückgeführt, welches über CsrA/CsrBC den Kohlenstoff-Metabolismus von E. coli post-transkriptional reguliert. Die natürliche uvrY-Deletionsmutante UPEC 536 wies trotz des Besitzes des kompletten PKS/NRPS-Genclusters keinen zytopathischen Effekt auf. Dieser konnte jedoch durch Komplementation mit uvrY wieder hergestellt werden. Dies ist der erste Hinweis für einen außerhalb der asnW-Insel liegenden Regulationsmechanismus der PK/NRP-Synthese. Die Funktion des Peptid-Polyketids in vivo bleibt weiterhin unklar und könnte sowohl Fitness als auch Virulenz von E. coli beeinflussen. / In many cases, it is difficult to draw a clear distinction between extraintestinal pathogenic (ExPEC) and commensal E. coli strains as virulence-associated factors of ExPEC can also be found in commensal strains. Being closely related to the uropathogenic strain CFT073 E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) exhibits expression of several of such “ExPEC virulence factors”. Belonging to those are various fimbriae, siderophores, and proteins involved in biofilm formation. Therefore, the comparison of ExPEC isolates and E. coli Nissle 1917 can reveal insights into the function of these factors within the respective ecological context. E. coli Nissle 1917 exhibits the so-called rdar morphotype, a multicellular structure based on the co-expression of cellulose and curli fimbriae. It can be found in many E. coli and Salmonella species, but is usually restricted to temperatures below 30 °C. However, E. coli Nissle 1917 features this phenotype also at 37 °C which might increase its colonization ability compared to other commensal E. coli. Here, it could be demonstrated that expression of the rdar morphoype in E. coli Nissle 1917 is independent of the two regulators described so far, CsgD and YaiC. Thus, by applying transposon mutagenesis using miniTn5 it was screened for rdar-negative mutants. The aim was to discover a superordinate regulator of this phenotype. During this investigation, several genes were identified which so far had not been reported to influence expression of cellulose or curli fimbriae. While the function of many of the determined ORFs was unknown, the inactivation primarily of genes involved in the biosynthesis of surface structures (fimbriae, capsule, colanic acid, LPS) resulted in an altered phenotype. However, only in a few cases a connection to the biosynthesis of curli fimbriae or cellulose could be established. In conclusion, the regulation of curli and cellulose biosysnthesis proved to be more complex and dependent – at least indirectly – on more factors than previously described. In the second part of this thesis, a genomic island, 55 kb in size and inserted into the asnW-tRNA locus, was investigated, which encodes proteins necessary for the synthesis of a hybrid nonribosomal peptide-polyketide. By PCR the island was proven to be present in extraintestinal pathogenic as well as in commensal isolates of the phylogenetic group B2, among those the strains E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073, and J96. Cocultivation of HeLa cells with those bacteria induced cell cycle arrest and megalocytosis (cytopathic effect). Deletion of the asnW island resulted in abolition of the cytopathic effect, which could be restored by introduction of a BAC vector containing the gene cluster. The cytopathic effect was only observed after direct contact of the bacteria with HeLa cells and could not be achieved using bacterial lysates, killed bacteria or culture supernatants. The PKS/NRPS gene cluster comprises 18 ORFs (clbA to clbR) of which 17 are involved in the synthesis of the active compound. The number of gene products and the sequence of putative domains differ from those of all PKS/NRPS systems described so far. Investigations on the transcription of the island revealed three monocistronically transcribed units and four polycistrons of sizes up to 23 kb. In addition, a constitutive transcription of every ORF was observed, albeit at variable levels. Upon cell contact, neither elevated transcription nor different promoter activities of single ORFs were observed. Thus, the contact dependence of the cytopathic effect does not seem to result from an induction of expression caused by HeLa cells. The contact dependence could not be overcome by induction or overexpression of either a PKS/NRPS (clbB), the putative key enzymes thioesterase (clbQ) and phosphopantetheinyl transferase (clbA), or the potential regulator clbR. Using luciferase reporter gene fusions an influence of diverse media and culture conditions on the promoter activities of singele genes was detected. This was ascribed to the influence of the BarA/UvrY two-component system, which regulates the carbon metabolism of E. coli on the post-transcriptional level via CsrA/CsrBC. The natural uvrY deletion mutant UPEC 536, despite containing the complete PKS/NRPS gene cluster, did not exhibit an cytopathic effect. However, this feature could be restored by complementation with uvrY. This is the first evidence for an regulatory mechanism of the PK/NRP synthesis located beyond the asnW island. The in vivo function of the peptide-polyketide so far remains unclear, but it might affect fitness as well as virulence of E. coli.

Der apathogene E. coli Stamm DSM 6601 (E. coli Nissle 1917) kann als Modellorganismus für die Verwendung eines kommensalen Gram-negativen Bakterienstammes als Probiotikum angesehen werden. Dieser E. coli Stamm wurde intensiv erforscht und seine Eigenschaften sind daher gut charakterisiert. Der probiotische Charakter dieses Bakterienstammes ist auf gute Kolonisierungseigenschaften des menschlichen Darms, immunmodulatorische Effekte und antagonistische Wirkungen zurückzuführen. Der E. coli Stamm DSM 6601 wird seit einigen Jahrzehnten zur Behandlung verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen eingesetzt und seine therapeutische Wirksamkeit ist wissenschaftlich bewiesen. Daher eignet sich dieser Stamm als Modellstamm für die Entwicklung eines bakteriellen Lebendvektors, der für mukosale Immunisierungen oder die zielgerichtete Lieferung von therapeutischen Molekülen in den Darm eingesetzt werden könnte. Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der kryptischen Plasmide pMUT1 und pMUT2 des probiotischen E. coli Stammes DSM 6601 durch Analyse der DNA-Sequenz. Die Analyse ergab, dass das Plasmid pMUT1 ein Replikationssystem vom ColE1-Typ, ein Mobilisierungssystem sowie eine Stabilitätsregion enthält, während das Plasmid pMUT2 ein ColE2-ähnliches Replikationssystem und ein anderes Mobilisierungssystem besitzt. In beiden Plasmiden konnten keine weiteren offenen Leserahmen mit bekannter Funktion identifiziert werden. Des Weiteren wurde ein spezifisches PCR-Nachweissystem für den E. coli Stamm DSM 6601 etabliert, das auf einer Methode zur direkten DNA-Isolierung aus Stuhlproben und einem optimierten PCR-Protokoll für auf den kryptischen Plasmiden basierende Primerkombinationen beruht. Dadurch konnte eine Sensitivität von 10(3)-10(4) Bakterien/0,1 g Stuhl erreicht werden, die vergleichbar mit den Nachweisgrenzen anderer beschriebener PCR-Nachweissysteme ist. Durch Analysen von Patientenstuhlproben wurde die Spezifität und der diagnostische Nutzen dieses PCR-Nachweissystems bestätigt. Darüber hinaus wurde eine plasmidfreie Variante des E. coli Stammes DSM 6601 hergestellt. Durch funktionelle Untersuchungen dieses Stammes konnten keine Unterschiede im Vergleich zu dem Wildtyp festgestellt werden, wodurch eine mögliche Funktion der beiden kryptischen Plasmide weiterhin unklar bleibt. Diese plasmidfreie Variante kann als Lebendvektor für rekombinante Plasmide auf Basis der Plasmide pMUT1 und pMUT2 verwendet werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von stabilen Klonierungsvektoren für den probiotischen E. coli Stamm DSM 6601. Durch Integration von Antibiotika-Resistenzkassetten in die Plasmide pMUT1 und pMUT2 wurden Klonierungsvektoren konstruiert, die auch nach Insertion weiterer DNA-Fragmente ohne Antibiotika-Selektionsdruck stabil in diesem Stamm beibehalten werden. Zusätzlich wurde durch die stabile Expression von fluoreszierenden Proteinen ein visuelles Nachweissystem etabliert, das bei in vivo Experimenten verwendet werden kann. Dadurch wird die Möglichkeit geboten, Erkenntnisse über Kolonisierungseigenschaften sowie Interaktionen des E. coli Stammes DSM 6601 mit endogenen Mikroorganismen und Zellen des Darmimmunsystems zu erlangen, was zur Aufklärung der Wirkungsweise dieses Stammes beitragen könnte. Im Hinblick auf die Entwicklung eines Lebendvakzins auf der Basis des probiotischen E. coli Stammes DSM 6601 wurden Adhäsine von humanpathogenen enterohämorrhagischen E. coli und von tierpathogenen enterotoxischen E. coli in diesem Stamm exprimiert. Bei ersten Immunisierungsversuchen in Mäusen konnte jedoch keine Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen diese Adhäsine nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die inhibitorische Wirkung des E. coli Stammes DSM 6601 auf die Invasivität von Salmonellen in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Typ 1- und F1C-Fimbrien keine Rolle bei dem inhibitorischen Effekt in vitro spielen und dass durch diesen E. coli Stamm in konventionellen Mäusen keine inhibitorischen Wirkungen nachzuweisen sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden durch die Entwicklung von stabilen Klonierungsvektoren und die Etablierung von Nachweissystemen für den probiotischen E. coli Stamm DSM 6601 die Grundlage für den Einsatz dieses Stammes als Lebendvektor und für in vivo Untersuchungen, die zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen dieses Stammes beitragen könnten. / The nonpathogenic E. coli strain DSM 6601 (E. coli Nissle 1917) can be considered as model organism for the employment of a commensal Gram-negative bacterial strain as a probiotic. This E. coli strain has been intensively investigated and therefore its properties are well characterized. The probiotic character of this strain is due to excellent colonization properties of the human gut, immunomodulatory effects and antagonistic activities. The E. coli strain DSM 6601 has been used for decades for the treatment of various gastrointestinal diseases and its therapeutic efficacy is scientifically proved. Therefore, this strain is suited as a model strain for the development of a bacterial live vector, which might be used for mucosal immunization or localized delivery of therapeutic molecules into the intestine. One major aim of this work was the characterization of the cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2 of probiotic E. coli strain DSM 6601 by DNA sequence analysis. The analysis showed that plasmid pMUT1 carries a replication system of ColE1-type, a mobilization system as well as a stabilization region, whereas plasmid pMUT2 contains a ColE2-like replication system and another mobilization system. Further open reading frames with known function were not identified in both plasmids. Furthermore, a specific PCR detection system for E. coli strain DSM 6601 was established, which uses a method for direct isolation of DNA from faecal samples and an optimized PCR protocol for primer combinations based on the cryptic plasmids. Thereby, a sensitivity of 10(3)-10(4) bacteria/0,1 g faeces was achieved that is comparable with detection limits of other described PCR detection systems. The specifity and diagnostic utility of this PCR detection system was confirmed by analysis of faecal samples from patients. In addition, a plasmid-free variant of E. coli strain DSM 6601 was constructed. Functional analyses of this strain detected no differences compared to the wildtype, whereby the possible function of both cryptic plasmids still remains unclear. This plasmid-free variant can be used as live vector for recombinant plasmids based on the plasmids pMUT1 and pMUT2. Another aim of this work was the development of stable cloning vectors for the probiotic E. coli strain DSM 6601. Cloning vectors were constructed by integration of antibiotic resistance cassettes in the plasmids pMUT1 and pMUT2, which are still stably maintained following insertion of additional DNA fragments without selection pressure by antibiotics. Furthermore, a visual detection system was established by the stable expression of fluorescent proteins that can be used in in vivo experiments. This offers the opportunity to gain knowledge of colonization properties as well as interactions of E. coli strain DSM 6601 with endogenous microorganisms and cells of the gut’s immune system, which might contribute to explain the mode of action of this strain. With regard to the development of a live vaccine based on the probiotic E. coli strain DSM 6601, adhesins of human pathogenic enterohaemorrhagic E. coli and animal pathogenic enterotoxigenic E. coli were expressed in this strain. Induction of specific immune responses to these adhesins were not demonstrated by first immunization experiments in mice. Moreover, the inhibitory effect of the E. coli strain DSM 6601 on Salmonella invasion was investigated in vivo and in vitro. It was demonstrated that type 1 and F1C fimbriae have no influence on the inhibitory effect in vitro and that no inhibitory effects could be established in conventional mice by this E. coli strain. By the development of stable cloning vectors and the establishment of detection systems for the E. coli strain DSM 6601, the results of this work provide the basis for the employment of this strain as live vector and for in vivo investigations, which might contribute to explain this strain’s mode of action.

Harnwegsinfektionen (HWI) gehören zu den häufigsten bakteriell bedingten Erkrankungen; vor allem Frauen sind sehr häufig betroffen. Harnwegsinfektionen kommt große medizinische und volkswirtschaftliche Bedeutung zu. Bei akuten unkomplizierten Infekten ist allein Escherichia coli in über 70 % der Fälle die Ursache. Auch bei komplizierten chronischen Infektionen spielt Escherichia coli in über 40 % aller Fälle eine große Rolle. E. coli Stämme, die die Nieren und ableitenden Harnwege inklusive Harnblase infizieren, werden als uropathogene E. coli (UPEC) bezeichnet. Sie unterscheiden sich von anderen, apathogenen E. coli Stämmen dadurch, daß sie bestimmte Virulenzfaktoren (VF) und Fitnessfaktoren besitzen, die ihnen besondere Virulenz verleihen. Solche Virulenzfaktoren sind vor allem Kapseln, Adhäsine, Toxine und Eisenaufnahmesysteme. In dieser Arbeit wurden Stuhl- und Urinproben von acht Patientinnen untersucht, die in der nephrologischen Abteilung der Universitätsklinik Jena betreut wurden und alle an chronisch rezidivierenden Harnwegsinfektionen leiden. Die gewonnenen Isolate wurden mittels Multiplex-PCR auf Virulenzfaktoren getestet, die für UPEC typisch sind. Des Weiteren wurden mit Hilfe der „Repetitive Extragenic Palindromic“ (Rep)-PCR und den Ergebnissen aus der Multiplex-PCR-Analyse Klone definiert. Ausgewählte Isolate wurden mittels Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) untersucht. Die Rep-PCR- und PFGE-Ergebnisse aus vorangegangenen Arbeiten (L. Brauchle, 2002 und M. Maibaum, 2003) wurden in diese Arbeit mit integriert und nomenklatorisch angeglichen. Die 167 Stuhl- und 186 Urinisolate dieser Arbeit konnten 81 Stuhl- und 64 Urinklonen zugeordnet werden. In der vorliegenden Studie scheinen die Häufigkeiten UPEC-typischer Virulenzfaktoren nach längerer chronischer Harnwegsinfektion wieder etwas anzusteigen. Insbesondere aber nahmen die Häufigkeiten der Virulenzfaktoren innerhalb der Stuhlstämme zu und entsprachen oftmals nahezu den Häufigkeiten bei Urinstämmen. Kapselgene, die bei Urinstämmen deutlich häufiger gefunden wurden, scheinen bei Chronizität eine Rolle zu spielen. Auch innerhalb der Urinklone häufiger zu finden waren die für Hämolysin, P-Fimbrien, S- bzw. F1C-Fimbrien codierenden Gencluster. Als Erregerreservoir scheint auch bei chronischen Harnwegsinfektionen der Darm festzustehen. Im Gesamtstudienzeitraum von 38 Monaten (1997-2000) koexistierten 18 Stämme in Stuhl und Urin gleichzeitig. Zehn dieser Koexistenzen wurden nochmals zu anderen Zeitpunkten gefunden (Persistenzen). Über den Vergleich der PFGE-Muster von Stuhl- und Urinklonen konnten bei Probandin Pat. 2 (HF) Klone mit dem PFGE-Muster IV und XV identifiziert werden, deren Bandenmuster sich so ähnlich sind (nur ein einziger Bandenshift), daß hier vermutlich eine DNA-Umlagerung stattgefunden hat. Innerhalb von 51 Untersuchungsterminen konnte lediglich vier Mal eine akute Exazerbation erfaßt werden. Tendenziell läßt sich über den gesamten Studienzeitraum ein Rückgang an erneuten Ausbrüchen bei ähnlicher Verteilung des Virulenzfaktorspektrums in den gefundenen Stuhl- und Urinstämmen beobachten. Eine prophylaktische Gabe von L-Methionin (Acimethin®) verminderte die Häufigkeit der untersuchten Virulenzfaktoren innerhalb der Stuhlstämme, kann aber bei chronischen Harnwegsinfektionen eine Exazerbation nicht sicher verhindern, möglicherweise jedoch deren Anzahl verringern.