Barley and wheat are the two most important crop species in Turkey. Molecular studies for increasing crop yield of these species are very important for the economic benefits of Turkey. Powdery mildew and yellow rust are the two main pathogens, infecting barley and wheat, respectively in our country and causing a great amount of yield loss each year. Till now, classical genetics studies were performed in order to develop resistant barley and wheat cultivars, but these studies have not been succesful. Therefore, molecular plant-pathogen interactions studies are starting to become the new tool to fight against pathogens. In this thesis, two important aspects of plant microbe interactions were investigated. In the first part, the role of microRNAs (miRNAs) in powdery mildew-barley pathosysytem, and yellow rust-wheat pathosystem were studied. The expression levels of miRNAs and their putative targets were investigated via miRNA microarray analysis and qRT-PCR, respectively, in response to virulent and avirulent pathogen infections. These data were used to establish a new model for powdery mildew-barley and yellow rust-wheat pathosystems. In the second part, functional analysis of a novel F-box gene, which was a ZTL-type F-box, was performed by using Barley Stripe Mosaic Virus mediated Virus Induced Gene Silencing. This F-box gene (HvDRF) (Hordeum vulgare Disease Related F-box) was induced upon yellow rust infection and we studied its role in powdery mildew infection. The results confirmed HvDRF as a positive regulator of race specific immunity and enlarged the roles of ZTL-type F-box proteins to biotic stress responses.

Le blé tendre, Triticum aestivum, est une des céréales les plus cultivées au monde et est d'une importance considérable pour l'alimentation humaine, fournissant environ un cinquième des calories consommées par l'Homme. Le rendement en grain chez les céréales dépend majoritairement du nombre et de la taille des grains. Chez le riz (Oryza sativa), le gène GW2 a été isolé dans un locus à effet quantitatif majeur pour la taille et le poids du grain. Ce gène code pour une enzyme E3 ligase de type RING, qui régule négativement la taille et le poids du grain de riz. L'homologue de GW2 chez le blé tendre, le gène TaGW2, est exprimé par trois copies TaGW2-A,TaGW2-B et TaGW2-D, portées par chacun des génomes homéologues A, B et D. Les trois copies présentent des profils d'expression distincts au cours du développement du grain. TaGW2-A a été cartographié dans une région de QTLs pour le rendement, sur le chromosome 6AS ; et du polymorphisme dans sa séquence promotrice et intronique a été retrouvé associé au poids de 1000-grains dans une core collection mondiale de blé tendre. Afin de rechercher la fonction de TaGW2, l'extinction stable des trois copies TaGW2 a été entreprise par ARN interférence. De manière surprenante, les plantes transgéniques montrent des réductions significatives des dimensions et du poids du grain de blé (- 22,5 et - 30% du volume et de la masse du grain, respectivement), ainsi que du nombre de cellules de l'albumen (- 25%), comparé aux plantes témoins dans nos conditions ; suggérant que TaGW2 est un régulateur positif de la taille finale du grain chez le blé tendre. La protéine TaGW2-A a été caractérisée aux niveaux moléculaire et biochimique : elle est une E3 ubiquitine ligase fonctionnelle in vitro, et s'accumule dans la cellule au niveau du nucléole, du nucléoplasme et du cytoplasme. Sa fonction E3 ligase semble notamment influencer sa localisation subcellulaire. Afin de déterminer la ou les voie(s) de signalisation dans la(es)quelle(s) intervient TaGW2, une banque ADNc de grains de blé a été construite et criblée par double-hybride avec 320 acides aminés de la protéine TaGW2-A. Les premiers interacteurs potentiels identifiés suggèrent d'une part un rôle de TaGW2 dans la régulation de la division cellulaire, et d'autre part une fonction E3 Nedd8 ligase, en plus de son activité E3 ligase.

PtaRHE1 is a poplar (Populus tremula x P. alba) gene encoding a REALLY INTERESTING NEW GENE (RING) domain-containing protein. RING proteins are largely represented in plants and play important roles in the regulation of many developmental processes as well as in plant-environment interactions. In this thesis, we present a functional characterization of PtaRHE1. To gain further insight into the role of this gene, molecular and genetic alteration approaches were used. The results of in vitro ubiquitination assays indicate that PtaRHE1 protein is a functional E3 ligase and this activity was shown to be specific with the human UbCH5a, among the tested ubiquitin-conjugating enzymes. Histochemical GUS stainings showed that the PtaRHE1 promoter is induced by plant pathogens and by elicitors such as salicylic acid and cellulase and is also developmentally regulated. In silico predictions and the transient expression of PtaRHE1-GFP fusion protein in N. tabacum epidermal cells revealed that PtaRHE1 is localized both in the plasma membrane and in the nucleus. The localization of expression of PtaRHE1 in poplar stem by in situ hybridization indicated that PtaRHE1 transcripts are localized within the cambial zone mainly in ray cells, suggesting a role of this gene in vascular tissue development and/or functioning. The overexpression of PtaRHE1 in tobacco resulted in a pleiotropic phenotype characterized by a curling of leaves, the formation of necrotic lesions on leaf blades, growth retardation as well as a delay in flower transition. Plant genes expression responses to PtaRHE1 overexpression provided evidence for the up-regulation of defence and/or programmed cell death (PCD) related genes. Moreover, genes coding for WRKY transcription factors as well as for MAPK, such as WIPK, were also found to be induced in the transgenic lines as compared to the wild type (WT). Taken together, our results suggest that the E3 ligase PtaRHE1 plays a role in the signal transduction pathways leading to defence responses against biotic and abiotic stresses. Identification of PtaRHE1 target(s) is required in order to fully assess the role of this E3 ligase in the ubiquitination-mediated regulation of defence response./<p>RÉSUMÉ<p><p><p>PtaRHE1 est un gène qui code pour une protéine possédant un domaine RING (REALLY INTERESTING NEW GENE) chez le peuplier (Populus tremula x P. alba). Les protéines de type RING sont très répandues chez les végétaux où elles jouent de rôles importants dans la régulation de plusieurs processus de développement et également dans les interactions plantes-environnement. Dans le cadre de ce travail, nous avons procédé à la caractérisation fonctionnelle du gène PtaRHE1. Dans le but de découvrir la fonction de ce gène, nous avons adopté une stratégie faisant usage d’approches moléculaires ainsi que de l’altération de l’expression génique. Les résultats obtenus montrent que la protéine PtaRHE1 est une E3 ligase et que cette activité enzymatique est spécifique à l’Ubiquitin-Conjugating enzym humaine UbCH5a. Les résultats du test histochimique GUS ont montré que le promoteur du gène PtaRHE1 est induit par des pathogènes et aussi par l’acide salicylique et la cellulase. Par ailleurs, ce promoteur est aussi régulé au cours du développement végétal. Les prédictions in silico et l’expression transitoire d’une fusion traductionnelle GFP-PtaRHE1, au niveau de l’épiderme des feuilles du tabac N. tabacum, ont révélé que la protéine PtaRHE1 se situe tant au niveau de la membrane cytoplasmique qu’au niveau du noyau. La localisation de l’expression du gène PtaRHE1, par les techniques d’hybridation in situ, montre que les transcrits de ce gène se retrouvent principalement au niveau des cellules de rayon, dans la zone cambiale, suggérant que ce gène pourrait jouer un rôle dans le développement ou la formation du tissu vasculaire. La surexpression du gène PtaRHE1 chez le tabac a conduit à l’obtention d’un phénotype pléiotropique caractérisé par un recroquevillement (incurvation) des feuilles, la formation des lésions nécrotiques sur le limbe, un retard de croissance ainsi qu’un retard dans la transition florale. L’analyse de la réponse de l’expression de différents gènes à la surexpression de PtaRHE1 a mis en évidence l’induction des gènes liés à la défense et ou à la mort cellulaire programmée. En outre, l’expression des gènes codant pour des facteurs de transcription WRKY et aussi des MAPKs, tel que WIPK, était aussi plus élevée chez les plantes transgéniques comparées au type sauvage. Les résultats de ce travail suggèrent que PtaRHE1, comme E3 ligase, pourrait jouer un rôle dans la transduction des signaux cellulaires conduisant aux réactions de défense contre les stress biotiques et abiotiques. L’identification de la (des) cible(s) de PtaRHE1 est indispensable pour la compréhension du rôle de cette protéine dans la régulation des réponses de défense par l’intermédiaire de l’ubiquitination.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les modifications post-traductionnelles des protéines constituent un niveau crucial de régulation de l’expression des gènes. Parmi elles, la conjugaison peptidique impliquant l’ubiquitine intervient entre autre dans la régulation de la stabilité protéique. La fixation de ce peptide de 76 acides aminés, extrêmement conservé, sous forme de chaîne de polyubiquitine, nécessite l’intervention de trois enzymes (E1, E2 et E3) et constitue un signal de dégradation de la protéine ainsi modifiée. Cette voie de régulation intervient dans de très nombreux processus biologiques. Les complexes SCF sont impliqués dans la voie de protéolyse ciblée. Ils représentent l' une des classes les plus fréquentes d'ubiquitine ligase E3 et ils sont composés de quatre sous-unités (Rbx, Cullin, SKP1, et F-box). La structure et la fonction des complexes SCF, ont été étudiées chez la levure, l’Homme et la plante modèle A. thaliana. Cependant, peu de travaux ont été réalisés chez des plantes cultivées, en particulier les céréales, telles que le blé. Cinq gènes codant pour la sous-unité Skp1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 et TSK16), cinq gènes codant pour la sous-unité F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 et ABA-T), un gène codant pour la sous-unité Cullin1 et un gène codant pour la protéine RBX du complexe SCF du blé, ont été isolés et clonés. Les différents tests d’interaction entre les quatre sous-unités du complexe SCF ont été réalisés par la méthode du double-hybride dans la levure en utilisant la technologie Gateway. Ces études ont montré que les deux protéines, TSK1 et TSK3, fixent spécifiquement différentes sous-unités F-box. Parallèlement, nous avons montré que la protéine TSK11 représente une structure particulière. Des études d’insertion/délétion sur la protéine TSK11 ont permis d’identifier un nouveau domaine indispensable à l’interaction. Les analyses par PCR semi-quantitative des différents gènes codant pour la sous-unité Skp1, dans trois tissus différents (feuille tige et racine), ont mis en évidence une expression constitutive des gènes TSK3, TSK6 et TSK11. Tandis que les gènes TSK1 et TSK16 sont exprimés préférentiellement dans les racines. Les analyses par PCR semi-quantitative sur des plantules de blé à différents stades de développement, ont mis en évidence une surexpression du gène TSK11 au moment de la floraison. Ce qui suggère que TSK11 est probablement un équivalent fonctionnel d’ASK1 chez Arabidopsis thaliana. / The selective degradation of proteins is an important means of regulating gene expression and plays crucial roles in the control of various cellular processes. The Ubiquitin (Ub)–Proteasome System (UPS) is the principal non-lysosomal proteolytic pathway in eukaryotic cells and is required for the degradation of key regulatory proteins. Ubiquitin is a 76-residue protein that can be attached covalently to target proteins through an enzymatic conjugation cascade involving three enzymes denoted, E1, E2 and E3.The SCF complex is a type of ubiquitin-protein ligase (E3) that acts as the specific factor responsible for substrate recognition and ubiquitination. Some polyubiquitinated proteins are then targeted to the 26S proteasome for degradation. The SCF complex consists of four components including SKP1, Cullin1, Rbx1 and a large gene family of F-box proteins. Twenty one SKP1-related genes have been described in the Arabidopsis genome and some of these genes have been analyzed genetically. By contrast, little is known about the function and structure of SKP1 homologues in wheat. Some of the Triticum SKP1-related protein (TSKs) have been characterized in this study. Five complete sequences of SKP1 (TSK1, TSK3, TSK6, TSK11 and TSK16), five F-box (ZTL, ATFBL5, EBF, TIR1 and ABA-T), one Cullin1 and one Rbx, were successfully cloned and biochemically characterized. Yeast two-hybrid analysis showed that TSK1 and TSK3 are capable of interacting with different F-box proteins. Furthermore, TSK11 contains an additional domain that changed its interaction capabilities. In vitro analysis using a chimeric protein showed that this additional domain could modify the interaction between a SKP-like protein and two F-box proteins. Expression analyses revealed that TSK1 and TSK16 were expressed predominantly in roots. While, TSK3, TSK6 and TSK11 were expressed in several wheat organs. In addition, the TSK11 was up-regulated in the leaves at the flowering stage.

Le blé tendre, Triticum aestivum, est une des céréales les plus cultivées au monde et est d’une importance considérable pour l’alimentation humaine, fournissant environ un cinquième des calories consommées par l’Homme. Le rendement en grain chez les céréales dépend majoritairement du nombre et de la taille des grains. Chez le riz (Oryza sativa), le gène GW2 a été isolé dans un locus à effet quantitatif majeur pour la taille et le poids du grain. Ce gène code pour une enzyme E3 ligase de type RING, qui régule négativement la taille et le poids du grain de riz. L’homologue de GW2 chez le blé tendre, le gène TaGW2, est exprimé par trois copies TaGW2-A,TaGW2-B et TaGW2-D, portées par chacun des génomes homéologues A, B et D. Les trois copies présentent des profils d’expression distincts au cours du développement du grain. TaGW2-A a été cartographié dans une région de QTLs pour le rendement, sur le chromosome 6AS ; et du polymorphisme dans sa séquence promotrice et intronique a été retrouvé associé au poids de 1000-grains dans une core collection mondiale de blé tendre. Afin de rechercher la fonction de TaGW2, l’extinction stable des trois copies TaGW2 a été entreprise par ARN interférence. De manière surprenante, les plantes transgéniques montrent des réductions significatives des dimensions et du poids du grain de blé (- 22,5 et - 30% du volume et de la masse du grain, respectivement), ainsi que du nombre de cellules de l’albumen (- 25%), comparé aux plantes témoins dans nos conditions ; suggérant que TaGW2 est un régulateur positif de la taille finale du grain chez le blé tendre. La protéine TaGW2-A a été caractérisée aux niveaux moléculaire et biochimique : elle est une E3 ubiquitine ligase fonctionnelle in vitro, et s’accumule dans la cellule au niveau du nucléole, du nucléoplasme et du cytoplasme. Sa fonction E3 ligase semble notamment influencer sa localisation subcellulaire. Afin de déterminer la ou les voie(s) de signalisation dans la(es)quelle(s) intervient TaGW2, une banque ADNc de grains de blé a été construite et criblée par double-hybride avec 320 acides aminés de la protéine TaGW2-A. Les premiers interacteurs potentiels identifiés suggèrent d’une part un rôle de TaGW2 dans la régulation de la division cellulaire, et d’autre part une fonction E3 Nedd8 ligase, en plus de son activité E3 ligase. / Wheat, Triticum aestivum, is one of the world’s major cereal crops and is of considerable importance to human nutrition, supplying one-fifth of the calories consumed by humans. For important food crops such as wheat, rice and maize, grain yield mainly depends on grain number and size. In rice (Oryza sativa), GW2 was isolated from a major quantitative trait locus for grain size and weight, and encodes an E3 RING ligase that negatively regulates these yield components. Wheat has TaGW2 homologs in A, B and D genomes; and copies show distinct expression pattern during whole grain development in wheat. TaGW2-A was mapped in a genomic region on 6AS, encompassing previous reported QTLs for yield; and polymorphisms in TaGW2-A (promoter and intron 7) were associated with thousand-grain weight, in a worldwide wheat core collection. To investigate TaGW2 function, RNA interference was used to down-regulate TaGW2 transcripts levels. Surprisingly, transgenic wheat lines significantly showed decreased grain weight and size-related dimensions, and endosperm cell number compared to controls. The present study thus suggests that TaGW2 is a positive regulator of the final grain size in wheat, conversely to GW2 in rice. Biochemical and molecular analyses of the protein TaGW2-A revealed that 1) TaGW2-A is a functional E3 ubiquitine ligase in vitro, 2) TaGW2-A accumulates in the nucleolus, the nucleoplasm, and the cytosol, 3) E3 ubiquitine ligase activity seems to impact TaGW2-A subcellular localization. To investigate the TaGW2 signalling pathway(s), cDNA library from whole wheat grains was built and screened with the bait protein TaGW2(1-320). Preliminary results from the interactomic study suggest that TaGW2 may regulate cell division. Moreover, TaGW2 may also function as an E3 Nedd8 ligase, besides its E3 ubiquitin ligase function.

[ES] La ubiquitinación inducida por hormonas desempeña un papel crucial en la vida media de los reguladores negativos clave de la propia señalización hormonal. En la señalización por ABA, los reguladores negativos clave son las PP2Cs del clado A, como PP2CA o ABI1, y su degradación es un mecanismo complementario a la inhibición de su actividad mediada por PYR/PYL/RCAR. El ABA promueve la degradación de ABI1 a través de las E3 ligasas PUB12/13, y PP2CA a través de las E3 ligasas RGLG1/5. Sin embargo, se predice que otras E3 ligasas no identificadas también regularán la vida media de las PP2Cs del clado A. En pasos posteriores de la señalización por ABA, el ABA también induce la regulación positiva de los niveles de transcrito y proteína de las PP2Cs como un mecanismo de retroalimentación negativa. Por lo tanto, restablecer la señalización de ABA también requiere la degradación de las PP2Cs para evitar su acumulación excesiva inducida por el propio ABA. En este trabajo identificamos las proteínas BTB/POZ AND MATH DOMAIN (BPM), adaptadores del sustrato de las E3 ligasas multiméricas CULLIN3-RING E3 (CRL3), como proteínas que interactúan con las PP2Cs. BPM3 y BPM5 interactúan en el núcleo con PP2CA, así como con ABI1, ABI2 y HAB1. Además, BPM3 y BPM5 aceleran la degradación de las PP2Cs de una manera dependiente del ABA y su sobreexpresión conduce a una mayor sensibilidad al ABA. Además, las plantas mutantes bpm3 bpm5 mostraron una mayor acumulación de PP2CA, ABI1 y HAB1, lo que conduce a una sensibilidad global disminuida al ABA. Finalmente, utilizando ensayos bioquímicos y genéticos, demostramos que las BPM aumentaban la ubiquitinación de PP2CA. Dado que la formación de los complejos ternarios receptor-ABA-fosfatasa se ve notablemente afectada por la abundancia de sus componentes proteicos y la concentración de ABA, revelamos que las BPM y las E3 ligasas multiméricas CRL3 son moduladores importantes de los niveles del correceptor PP2C para regular la señalización temprana de ABA, así como durante los consiguientes pasos de restablecimiento. Al contrario que con PUB12/13, no se sabe cómo el ABA aumenta la degradación de PP2CA a través de RGLG1/5. En el caso de RGLG1, esta proteína se encuentra predominantemente en la membrana plasmática, mientras que PP2CA se encuentra predominantemente en el núcleo. Nosotros demostramos que el ABA modifica la localización subcelular de RGLG1, promoviendo la interacción nuclear con PP2CA. En primer lugar, encontramos que RGLG1 está miristoilado in vivo, lo que facilita su unión a la membrana plasmática, sin embargo, el ABA inhibe esta miristoilación. El ABA también regula negativamente a N-myristoyltransferase 1, la enzima activa y central en la miristoilación de proteínas, esto puede ayudar a promover la translocación de RGLG1 al núcleo. Allí, RGLG1 puede interactuar con ciertos receptores monoméricos del ABA, como PYL8. El reclutamiento nuclear de la E3 ligasa también fue promovido por el aumento de los niveles de proteína PP2CA y por la formación de complejos RGLG1-PYL8-PP2CA en presencia de ABA. Además, nosotros encontramos que RGLG1Gly2Ala, mutada en el sitio de miristoilación N-terminal, muestra localización nuclear constitutiva y provoca una respuesta más sensible al ABA y al estrés salino y osmótico. En resumen, proporcionamos evidencia de que una ligasa E3 puede reubicarse dinámicamente en respuesta al ABA, el estrés salino y osmótico, y el aumento de los niveles de su sustrato, lo que revela un mecanismo para explicar cómo el ABA mejora la interacción RGLG1-PP2CA y, por lo tanto, la degradación de PP2CA. / [CAT] L' ubiquitinació induïda per hormones té un paper crucial en la vida mitjana dels reguladors negatius clau de la pròpia senyalització hormonal. En la senyalització per ABA, els reguladors negatius clau són les PP2Cs del clado A, com PP2CA o ABI1, i la seva degradació és un mecanisme complementari a la inhibició de la seva activitat mediada per PYR/PYL/RCAR. El ABA promou la degradació de ABI1 a través de les E3 lligases PUB12/13, i PP2CA per mitja de les E3 lligases RGLG1/5. No obstant això, es prediu que altres E3 lligases no identificades també regularan la vida mitjana de les PP2Cs del clado A. En passos posteriors de la senyalització per ABA, l'ABA també indueix la regulació positiva de nivells de transcrit i proteïna de les PP2Cs com un mecanisme de retroalimentació negativa. Per tant, restablir la senyalització d'ABA també requereix la degradació de les PP2Cs per evitar la seva acumulació excessiva induïda pel propi ABA. En aquest treball identifiquem les proteïnes BTB/POZ AND MATH DOMAIN (BPM), adaptadors del substrat de les E3 lligases multimèriques CULLIN3-RING E3 (CRL3), com proteïnes que interactuen amb les PP2Cs. BPM3 i BPM5 interactuen en el nucli amb PP2CA, així com amb ABI1, ABI2 i HAB1. A més, BPM3 i BPM5 acceleren la degradació de les PP2Cs d'una manera dependent del ABA i la seva sobreexpressió porta a una major sensibilitat al ABA. A més, les plantes mutants bpm3 bpm5 van mostrar una major acumulació de PP2CA, ABI1 i HAB1, el que porta a una sensibilitat global disminuïda a ABA. Finalment, utilitzant assajos bioquímics i genètics, aconseguint que les BPM augmentaven l' ubiquitinació de PP2CA. Atès que la formació dels complexos ternaris receptor-ABA-fosfatasa es veu notablement afectada per l'abundància dels seus components proteics i la concentració d'ABA, revelem que les BPM i les E3 lligases multimèriques CRL3 són moduladors importants dels nivells del coreceptor PP2C per regular la senyalització primerenca de ABA, així com durant els consegüents passos de restabliment. Al contrari que amb PUB12/13, no se sap com el ABA augmenta la degradació de PP2CA a través d'RGLG1/5. En el cas de RGLG1, aquesta proteïna es troba predominantment en la membrana plasmàtica, mentre que PP2CA es troba predominantment en el nucli. Nosaltres vam demostrar que l'ABA modifica la localització subcelular de RGLG1, promovent la interacció nuclear amb PP2CA. En primer lloc, trobem que RGLG1 està miristoilado in vivo, el que facilita la seva unió a la membrana plasmàtica, però, el ABA inhibeix aquesta miristoilación. El ABA també regula negativament N-myristoyltransferase 1, l' enzim actiu i central en la miristoilación de proteïnes, això pot ajudar a promoure la translocació de RGLG1 al nucli. Allà, RGLG1 pot interactuar amb certs receptors monomèrics de l'ABA, com PYL8. El reclutament nuclear de l'E3 lligasa també va ser promogut per l'augment dels nivells de proteïna PP2CA i per la formació de complexos RGLG1-PYL8-PP2CA en presència d'ABA. A més, nosaltres trobem que RGLG1Gly2Ala, mutada en el lloc de miristoilació N-terminal, mostra localització nuclear constitutiva i provoca una resposta més sensible al ABA i l'estrès salí i osmòtic. En resum, proporcionem evidència que una ligasa E3 pot reubicar dinàmicament en resposta al ABA, l'estrès salí i osmòtic, i l'augment dels nivells de la seva substrat, el que revela un mecanisme per explicar com el ABA millora la interacció RGLG1-PP2CA i, per tant, la degradació de PP2CA. / [EN] Hormone-induced ubiquitination plays a crucial role to determine the half-life of key negative regulators of hormone signaling. In case of ABA signaling, the key negative regulators are the clade-A PP2Cs, such as PP2CA or ABI1, and their degradation is a complementary mechanism to PYR/PYL/RCAR-mediated inhibition of their activity. ABA promotes the degradation of ABI1 through the PUB12/13 E3 ligases, and PP2CA through the RGLG1/5 E3 ligases. However, other unidentified E3 ligases are predicted to regulate clade A PP2Cs half-life as well. At later steps of ABA signaling, ABA also induces upregulation of PP2C transcripts and protein levels as a negative feedback mechanism. Therefore, resetting of ABA signaling also requires PP2C degradation to avoid excessive ABA-induced accumulation of PP2Cs. In this work we identified BTB/POZ AND MATH DOMAIN proteins (BPMs), substrate adaptors of the multimeric CULLIN3-RING E3 ligases (CRL3s), as PP2C-interacting proteins. BPM3 and BPM5 interact in the nucleus with PP2CA as well as with ABI1, ABI2 and HAB1. Additionally, BPM3 and BPM5 accelerate the turnover of PP2Cs in an ABA-dependent manner and their overexpression leads to enhanced ABA sensitivity. Moreover, bpm3 bpm5 mutant plants showed increased accumulation of PP2CA, ABI1 and HAB1, which leads to global diminished ABA sensitivity. Finally, using biochemical and genetic assays we demonstrated that BPMs enhance the ubiquitination of PP2CA. Given the formation of receptor-ABA-phosphatase ternary complexes is markedly affected by the abundance of protein components and ABA concentration, we reveal that BPMs and multimeric CRL3 E3 ligases are important modulators of PP2C co-receptor levels to regulate early ABA signaling as well as the subsequent resetting steps. In contrast to PUB12/13, it was not known how ABA enhances the degradation of PP2CA by RGLG1/5. RGLG1 is predominantly found in the plasma membrane whereas PP2CA is predominant in the nucleus. We demonstrate that ABA modifies the subcellular localization of RGLG1, promoting nuclear interaction with PP2CA. Firstly, we found that RGLG1 is myristoylated in vivo, which facilitates its attachment to the plasma membrane, nevertheless, ABA inhibits its myristoylation. ABA also downregulates N-myristoyltransferase 1, the central active enzyme of protein myristoylation, which may help to promote RGLG1 translocation to the nucleus. There, RGLG1 can interact with certain monomeric ABA receptors, as PYL8. Enhanced nuclear recruitment of the E3 ligase was also promoted by increasing PP2CA protein levels and the formation of RGLG1-PYL8-PP2CA complexes in the presence of ABA. Additionally, we found that RGLG1Gly2Ala protein, mutated at the N-terminal myristoylation site, shows constitutive nuclear localization and causes an enhanced response to ABA and salt and osmotic stresses. In summary, we provided evidence that an E3 ligase can dynamically relocalize in response to ABA, salt and osmotic stress, and increased levels of its target, which reveals a mechanism to explain how ABA enhances RGLG1-PP2CA interaction and hence PP2CA degradation. / Julián Valenzuela, J. (2020). Regulation of ABA signaling through degradation of clade A PP2Cs by the RGLG1 and CRL3 BPM E3 ligases [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137777 / TESIS

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L’adaptation des cellules à leur environnement externe repose sur la transduction adéquate de signaux régulés par une pléthore d'événements moléculaires. Parmi ces événements moléculaires, les modifications post-traductionnelles (MPT) de protéines aident à intégrer, à traduire et à organiser de façon spatiotemporelle ces signaux pour que les cellules puissent réagir aux stimuli externes. Parmi les modifications post-traductionnelles, les petites protéines de la famille de l’Ubiquitine (Ublps, Ubiquitin-like proteins) jouent un rôle majeur dans presque toutes les voies de signalisation. Cette thèse rapporte des études fonctionnelles et structurales des interactions covalentes et non covalentes entre SUMO (Small Ubiquitin related MOdifier), un membre de la famille des Ublps, et trois protéines d'échafaudage, TIF1beta, le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc, PIAS1, une ligase E3 pour SUMO et PML, un suppresseur de tumeur. La première étude rapporte l'identification et la caractérisation biochimique des sites de SUMOylation de TIF1beta. Nous avons déterminé que la modification covalente de six résidus lysine par SUMO est essentielle à l’activité de répression de la transcription induit par TIF1beta. En outre, nous présentons des évidences indiquant que la SUMOylation de TIF1 exige non seulement sa capacité à homo-oligomériser, mais est aussi positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB des protéines à doigts de zinc. Partant de ce constat, nous postulons que les protéines KRAB-multidoigt de zinc recrutent leur corépresseur TIF1betaà des gènes cibles, mais aussi accentuent son activité répressive grâce à l'augmentation de sa SUMOylation. Notre seconde étude révèle qu’en plus de réprimer la transcription en tant que MPT covalente, SUMO joue aussi un rôle important dans la répression en tant que partenaire non covalent d’interactions protéine-protéine. Nous avons montré que SUMO interagit simultanément avec deux enzymes de la machinerie de SUMOylation, l’unique enzyme de conjugaison E2, UBC9, et la ligase E3 PIAS1 au sein d’un complexe ternaire répresseur. En outre, nous révélons que la formation du complexe ternaire PIAS1:SUMO:UBC9 est modulée par le niveau de phosphorylation de résidus sérine juxtaposés à un motif d’interaction avec SUMO (SIM) dans PIAS1. Ainsi, SUMO agit comme un adaptateur spécifique qui stabilise les interactions UBC9 E2: E3 PIAS1. Partant de ce constat, nous proposons que les enzymes E2 et E3 des autres systèmes Ublps exploitent des mécanismes similaires dans le cadre de leur fonction Enfin, notre troisième étude explore la régulation des interactions non covalentes de SUMO par la phosphorylation. En utilisant une combinaison d'études in vivo et in vitro, nous démontrons que l'interaction entre SUMO1 et PML est régi par la phosphorylation dépendant de CK2 sur quatre résidus sérine de PML. Les structures cristallographiques des complexes PML-SIM:SUMO1 révèlent que les phospho-sérines de PML contactent des résidus de la région basique de SUMO1. Sachant que la kinase CK2 peut être induite par des kinases activables par le stress, ces résultats suggèrent que les interactions non-covalentes avec SUMO sont modulées par le stress cellulaire. Sur la base de cette constatation, nous postulons que des événements analogues affectent des protéines contenant des séquences SIM ciblées par CK2. En résumé, cette étude révèle qu’en plus de son rôle de MPT, SUMO peut fonctionner comme un adaptateur permettant des interactions spécifiques entre protéines tel que pour les enzymes E3 et E2. / Cell adaption to the external environment relies on proper signal transduction that is orchestrated by a plethora of molecular events. Among these molecular events, post-translational modifications (PTMs) of proteins help to spatiotemporally integrate, translate and dispatch signals so cells can respond to external stimuli. Among these post-translational modifications, the Ubiquitin-like proteins (Ublps) play a major role in almost all signaling pathways. This thesis reports functional and structural studies of the covalent and non-covalent interactions between the Small Ubiquitin-related MOdifier (SUMO), a member of the Ublps family, and three scaffold proteins, TIF1beta, the corepressor of KRAB-Multifinger proteins, PIAS1, a SUMO E3 ligase and the Promyleocytic leukemia (PML) tumor suppressor protein. The first study reports the identification and the biochemical characterization of TIF1betaSUMOylation sites. We mapped six SUMOylation sites in TIF1beta and determined that the covalent modification of these sites by SUMO is essential for its transcriptional repression activity. In addition, we present evidence indicating that SUMOylation of TIF1beta requires not only its ability to homo-oligomerize, but is positively regulated through its interaction with KRAB domains found in zinc-finger proteins. Based on this finding, we postulate that these KRAB domain containing multifinger proteins not only recruit TIF1beta co-repressor to target genes but also increase its repressive activity through enhancement of its SUMOylation. The work in the second study reveals that in addition to suppressing transcription as a covalent PTM, SUMO plays an important role in repression as a non-covalent protein-protein interaction partner. We determine that SUMO can form a repressive complex by simultaneously forming non-covalent interactions with UBC9 and PIAS1, the E2 and E3 enzymes in the SUMOylation system. In addition, we report that the formation of the PIAS1:SUMO:UBC9 ternary complex is modulated by the phosphorylation of serine residues juxtaposed to a SUMO-Interacting Motif (SIM) found in PIAS1. Thus SUMO acts as a specific adaptor that stabilizes UBC9 E2: PIAS1 E3 interactions. Based on this finding, we propose that the E2 and E3 enzymes from other Ublps systems exploit similar mechanisms as part of their function Finally, our third study explores the regulation of SUMO non-covalent interactions by phosphorylation. Using a combination of in vivo and in vitro studies we demonstrate that the interaction between SUMO1 and PML is governed by CK2-dependent phosphorylation of four serine residues in PML. Crystal structures of PML-SIM:SUMO1 complexes reveal that these PML phospho-serine specifically contact SUMO1 basic patch residues. Since CK2 kinase is induced by stress activated kinases pathways, this indicates that SUMO non-covalent interactions are regulated by cellular stress. Based on this finding, we postulated that analogous events influence other CK2-targeted SIM-containing proteins. In summary, this study reveals that in addition to its well described function as PTM, SUMO can function as an adaptor enabling specific proteins interactions such as functional E3:E2 enzymes pairs.

L’adaptation des cellules à leur environnement externe repose sur la transduction adéquate de signaux régulés par une pléthore d'événements moléculaires. Parmi ces événements moléculaires, les modifications post-traductionnelles (MPT) de protéines aident à intégrer, à traduire et à organiser de façon spatiotemporelle ces signaux pour que les cellules puissent réagir aux stimuli externes. Parmi les modifications post-traductionnelles, les petites protéines de la famille de l’Ubiquitine (Ublps, Ubiquitin-like proteins) jouent un rôle majeur dans presque toutes les voies de signalisation. Cette thèse rapporte des études fonctionnelles et structurales des interactions covalentes et non covalentes entre SUMO (Small Ubiquitin related MOdifier), un membre de la famille des Ublps, et trois protéines d'échafaudage, TIF1beta, le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc, PIAS1, une ligase E3 pour SUMO et PML, un suppresseur de tumeur. La première étude rapporte l'identification et la caractérisation biochimique des sites de SUMOylation de TIF1beta. Nous avons déterminé que la modification covalente de six résidus lysine par SUMO est essentielle à l’activité de répression de la transcription induit par TIF1beta. En outre, nous présentons des évidences indiquant que la SUMOylation de TIF1 exige non seulement sa capacité à homo-oligomériser, mais est aussi positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB des protéines à doigts de zinc. Partant de ce constat, nous postulons que les protéines KRAB-multidoigt de zinc recrutent leur corépresseur TIF1betaà des gènes cibles, mais aussi accentuent son activité répressive grâce à l'augmentation de sa SUMOylation. Notre seconde étude révèle qu’en plus de réprimer la transcription en tant que MPT covalente, SUMO joue aussi un rôle important dans la répression en tant que partenaire non covalent d’interactions protéine-protéine. Nous avons montré que SUMO interagit simultanément avec deux enzymes de la machinerie de SUMOylation, l’unique enzyme de conjugaison E2, UBC9, et la ligase E3 PIAS1 au sein d’un complexe ternaire répresseur. En outre, nous révélons que la formation du complexe ternaire PIAS1:SUMO:UBC9 est modulée par le niveau de phosphorylation de résidus sérine juxtaposés à un motif d’interaction avec SUMO (SIM) dans PIAS1. Ainsi, SUMO agit comme un adaptateur spécifique qui stabilise les interactions UBC9 E2: E3 PIAS1. Partant de ce constat, nous proposons que les enzymes E2 et E3 des autres systèmes Ublps exploitent des mécanismes similaires dans le cadre de leur fonction Enfin, notre troisième étude explore la régulation des interactions non covalentes de SUMO par la phosphorylation. En utilisant une combinaison d'études in vivo et in vitro, nous démontrons que l'interaction entre SUMO1 et PML est régi par la phosphorylation dépendant de CK2 sur quatre résidus sérine de PML. Les structures cristallographiques des complexes PML-SIM:SUMO1 révèlent que les phospho-sérines de PML contactent des résidus de la région basique de SUMO1. Sachant que la kinase CK2 peut être induite par des kinases activables par le stress, ces résultats suggèrent que les interactions non-covalentes avec SUMO sont modulées par le stress cellulaire. Sur la base de cette constatation, nous postulons que des événements analogues affectent des protéines contenant des séquences SIM ciblées par CK2. En résumé, cette étude révèle qu’en plus de son rôle de MPT, SUMO peut fonctionner comme un adaptateur permettant des interactions spécifiques entre protéines tel que pour les enzymes E3 et E2. / Cell adaption to the external environment relies on proper signal transduction that is orchestrated by a plethora of molecular events. Among these molecular events, post-translational modifications (PTMs) of proteins help to spatiotemporally integrate, translate and dispatch signals so cells can respond to external stimuli. Among these post-translational modifications, the Ubiquitin-like proteins (Ublps) play a major role in almost all signaling pathways. This thesis reports functional and structural studies of the covalent and non-covalent interactions between the Small Ubiquitin-related MOdifier (SUMO), a member of the Ublps family, and three scaffold proteins, TIF1beta, the corepressor of KRAB-Multifinger proteins, PIAS1, a SUMO E3 ligase and the Promyleocytic leukemia (PML) tumor suppressor protein. The first study reports the identification and the biochemical characterization of TIF1betaSUMOylation sites. We mapped six SUMOylation sites in TIF1beta and determined that the covalent modification of these sites by SUMO is essential for its transcriptional repression activity. In addition, we present evidence indicating that SUMOylation of TIF1beta requires not only its ability to homo-oligomerize, but is positively regulated through its interaction with KRAB domains found in zinc-finger proteins. Based on this finding, we postulate that these KRAB domain containing multifinger proteins not only recruit TIF1beta co-repressor to target genes but also increase its repressive activity through enhancement of its SUMOylation. The work in the second study reveals that in addition to suppressing transcription as a covalent PTM, SUMO plays an important role in repression as a non-covalent protein-protein interaction partner. We determine that SUMO can form a repressive complex by simultaneously forming non-covalent interactions with UBC9 and PIAS1, the E2 and E3 enzymes in the SUMOylation system. In addition, we report that the formation of the PIAS1:SUMO:UBC9 ternary complex is modulated by the phosphorylation of serine residues juxtaposed to a SUMO-Interacting Motif (SIM) found in PIAS1. Thus SUMO acts as a specific adaptor that stabilizes UBC9 E2: PIAS1 E3 interactions. Based on this finding, we propose that the E2 and E3 enzymes from other Ublps systems exploit similar mechanisms as part of their function Finally, our third study explores the regulation of SUMO non-covalent interactions by phosphorylation. Using a combination of in vivo and in vitro studies we demonstrate that the interaction between SUMO1 and PML is governed by CK2-dependent phosphorylation of four serine residues in PML. Crystal structures of PML-SIM:SUMO1 complexes reveal that these PML phospho-serine specifically contact SUMO1 basic patch residues. Since CK2 kinase is induced by stress activated kinases pathways, this indicates that SUMO non-covalent interactions are regulated by cellular stress. Based on this finding, we postulated that analogous events influence other CK2-targeted SIM-containing proteins. In summary, this study reveals that in addition to its well described function as PTM, SUMO can function as an adaptor enabling specific proteins interactions such as functional E3:E2 enzymes pairs.

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