In Europa stellt die Multiple Sklerose (MS) die häufigste neuroimmunologische Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) dar. Relevante Daten zum Krankheitsverlauf der MS wurden durch Untersuchungen im Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelits (EAE) gewonnen. Nach gegenwärtigem Kenntnisstand wandern autoreaktive T-Zellen vom T-Helfer-1 (Th-1) Typ in das ZNS ein und lösen eine gegen Bestandteile der Markscheide gerichtete Entzündung aus. Diese Zellen exprimieren große Mengen des für sie typischen Zytokin Interferon-gamma (IFN-gamma), was in zahlreichen Zelltypen die Expression des Tryptophan degradierenden Enzyms Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) induziert. Seit 1998 ist bekannt, dass die Inhibition der IDO zu einer durch T-Zellen vermittelten Abstoßung allogener Feten führt. Diese immunregulatorische Funktion von IDO konnte auf den schnellen Abbau der essentiellen Aminosäure Tryptophan und der im folgenden Abbauweg synthetisierten T-Zell-toxischen Metabolite zurückgeführt werden. Da im entzündeten ZNS-Gewebe während der MS und der EAE das IDO induzierende Zytokin IFN-gamma ebenfalls exprimiert wird, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden in wie weit die IDO an der Immunregulation des ZNS unter autoimmuner Neuroinflammation während EAE, beteiligt ist. Mittels HPLC konnte gezeigt werden, dass die relative IDO Aktivität im ZNS während der akuten und der Erholungsphase der Erkrankung signifikant gesteigert ist. Erfolgte ab dem Ausbruch der Erkrankung die systemische Inhibition der IDO Aktivität mit dem spezifischen IDO-Inhibitor 1-Methyl-Tryptophan, so führte dies zu einem signifikant schwereren Krankheitsverlauf im Vergleich zu Kontrolltieren. Mittels Immunzytochemie wurde gezeigt, dass aktivierte Mikroglia IDO im entzündeten ZNS und in Zellkultur nach IFN-gamma Stimulation exprimieren. Aufgrund von RT-PCR Analysen weiterer Enzyme des Kynureninweges konnte dessen Regulation während EAE nachgewiesen werden Entlang dieses Stoffwechselweges werden T-zell-toxische Tryptophanmetabolite gebildet die an der Eliminierung autoreaktiver T-Zellen im ZNS während der Erholungsphase der EAE beteiligt sein könnten und somit die aktivierten Th1 Zellen im ZNS einen antiinflammatorischen Rückkopplungsmechanismus auslösen. / Multiple sclerosis (MS) is the most widespread neuroimmunological disease of the central nervous system (CNS) in Europe. By applying the animal model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), important insights into the disease course of MS have been gained. At present it is accepted that at the onset of the disease myelin-reactive T helper type 1 (Th1) cells infiltrate the CNS and induce autoimmune neuroinflammation. Activated Th1 cells express high amounts of the cytokine interferon-gamma (IFN-gamma). This pro-inflammatory signaling molecule is known to induce the expression of the tryptophan-degrading enzyme Indolmaine 2,3- Dioxygenase (IDO) in several cell types. Since 1998 it is known that inhibition of IDO induces the T cell-mediated rejection of allogeneic concepti in mice. The mechanism of this immunregulatory function of IDO was shown to be due to the degradation of the essential amino acid tryptophan and the subsequent synthesis of T cell toxic metabolites. Since the IDO-inducing cytokine IFN-gamma is also expressed within inflamed CNS tissue during MS and EAE, the present work investigated the role of IDO in immunregulation of the CNS during autoimmune neuroinflammation in the EAE model. A significant increase in relative IDO activity within the CNS during the acute and remission phases of EAE was identified by HPLC analysis. Systemic inhibition of IDO activity by the specific IDO inhibitor 1-methyl-tryptophan reduced the remission and exacerbated the progression of the disease in comparison to control animals. Activated microglia were identified by immunocytochemistry as IDO-expressing cells within the acute inflamed CNS and in cell culture after IFN-gamma stimulation. Enzymes following IDO in the kynurenine pathway were shown by RT-PCR to be up-regulated in the disease course. The analyzed enzymes are known to produce T cell toxic tryptophan metabolites and might therefore be involved in the elimination of autoreactive T cells from CNS tissue. In conclusion, the presented data support the view that autoreactive Th1 cells in the CNS induce a self-limiting negative feedback mechanism which limits the spread of inflammation, thereby reducing bystander damage in the CNS.

Das Proteasom ist das zentrale proteolytische System in eukaryontischen Zellen, welches die Mehrzahl der intrazellulären Proteine abbaut. Da viele essentielle Prozesse in der Zelle proteolytisch reguliert werden, besitzt das Proteasom eine außerordentliche biologische Bedeutung. Die Erforschung des Proteasoms im ZNS steht erst am Anfang, dennoch zeigen zahlreiche Untersuchungen, dass Inhibition bzw. Störung des Ubiquitin-Proteasom-Systems mit vielen neurologischen oder neurodegenerativen Erkrankungen einhergeht. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit nach Veränderungen des Proteasoms in Entzündungsprozessen im ZNS am Beispiel der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis (EAE) in der Maus gesucht. Schwerpunkt der Untersuchungen war das Proteasom in Astrozyten. Astrozyten stellen die größte Gruppe unter den Gliazellen dar und besitzen vielfältige Funktionen, zu denen neben klassischen housekeeping Funktionen auch Aufgaben bei der Immunantwort zählen. Der enge und für Neurone essentielle Kontakt prädestiniert Astrozyten, neuronale Erkrankungen mit auszulösen und zu modulieren. In dieser Arbeit wurden in primär isolierten Astrozyten Immunproteasomen (IP) detektiert. Durch Experimente mit der Astrozytenzelllinie TSA-3 konnte gezeigt werden, dass Astrozyten im unstimulierten Zustand nur Standardproteasom besitzen, auf Stimulation jedoch mit der Bildung von IP reagieren. Das Fehlen von IP in Astrozyten unter in vivo Bedingungen deckte sich mit den Strukturanalysen von Proteasomen aus dem Großhirn von Mäusen verschiedener Altersstufen, den mRNA-Expressionsanalysen sowie immunhistologischen Untersuchungen von Hirngewebe aus EAE Mäusen. Die aus dem Großhirn isolierten Proteasomen nach Induktion einer EAE durch Myelin-Oligodendrocyten-Glycoprotein (MOG) enthielten keine IP. Dennoch erfolgt eine Aktivitätsveränderung im Proteasom vor dem Auftreten der ersten EAE Symptome, die in vitro zu einer effizienteren Epitopgenerierung aus einem MOG-Peptid führt. / The proteasome is the central proteolytic system in all eukaryotic cells catalysing the degradation of the majority of intracellular proteins. Since many essential processes are proteolytically controlled, the proteasome is of crucial biological importance. Yet numerous investigations show that many neurological or neurodegenerative diseases go along with inhibition and/or changes of the ubiquitin-proteasome-system. Therefore the present thesis investigates the proteasome system during inflammatory processes in the CNS, namely during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a widely used animal model for human multiple sclerosis. Main focus of the investigations was the proteasome in astrocytes. Astrocytes embody the largest group of glial cells in the CNS and possess various functions. Apart from classical housekeeping functions astrocytes take part in the immune reaction in the CNS. Their close and essential contact to neurons predestines astrocytes to cause and modulate neural diseases. In the present work immune proteasome subunits were detected in primary astrocytes isolated from newborn mice. On the other hand, when grown under resting conditions the murine astrocyte cell line, TSA-3, contains standard proteasome only, however, when treated with interferon gamma, these cells produce immune proteasomes, too. Subunit analyses of proteasomes isolated from the cerebrum of mice of different age, measurement of the mRNA expression level of proteasome subunits as well as immune-histological investigations of brain tissue from mice confirmed the absence of immune proteasome in astrocytes under in vivo conditions. Proteasomes isolated from mouse brain after induction of EAE by active immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) did not contain immune subunits. Nevertheless an activity change in the proteasomes isolated from brains before onset of EAE was observed, which lead to a more efficient epitope generation from MOG peptide.

Schädigungen im zentralen Nervensystem treten nicht nur bei der Multiplen Sklerose (MS), sondern auch bei einer Vielzahl weiterer entzündlicher Schadensparadigmen auf. Allgemeines Kennzeichen dieser primär wie auch sekundär entzündlichen neurodegenerativen Erkrankungen ist das Auftreten von oxidativem Stress in Verbindung mit einer eingeschränkten Regeneration von Nervenzellen und einem übermäßiges Auftreten von Astrozyten. Allerdings ist bislang nicht bekannt, welche Faktoren für eine frühe neuronale Schädigung verantwortlich sind, und welche Faktoren zu einem übermäßigen Auftreten von Astrozyten beitragen. Vorarbeiten belegten, dass Apoptose-regulierende Systeme, wie z.B. der TRAIL-Signalweg, sowohl an der Immunregulation als auch an Schädigungsprozessen im Gehirn beteiligt sein können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine auf das ZNS beschränkte Blockade des TRAIL-Signalwegs in der EAE, dem Tiermodell der MS, zu einer signifikanten Verminderung des Erkrankungsgrades führte. Darüber hinaus wurde eine reduzierte Enzephalitogenität von TRAIL-defiziente Myelin-spezifischen Lymphozyten belegt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der TRAIL-vermittelte Schädigungsmechanismus die Pathogenese der Neuroinflammation entscheidend mitbestimmt und die immunregulatorische Wirkung eine eher untergeordnete Rolle spielt. Dagegen stellte sich im Tiermodell der bakteriellen Meningitis heraus, dass TRAIL hier eine anti-inflammatorische Rolle im ZNS spielt, die vor allem durch eine TRAIL-R-abhängige apoptotische Minderung der Entzündungsreaktion vermittelt wird. Eine Beeinflussung der Migration von Effektorzellen durch TRAIL konnte in diesem Modell ausgeschlossen werden. Anscheinend hängt die therapeutische Modulation des TRAIL-Systems entscheidend von der jeweils zu Grunde liegenden Ätiopathogenese ab und kann nicht allgemein auf entzündliche ZNS-Erkrankungen übertragen werden. Als mögliche Ursache für eine verminderte Regenerationsfähigkeit endogener Stammzellen konnte hier ein endogener Mechanismus aufgedeckt werden, der als Antwort auf oxidativen Stress zu einem quantitativen Überwiegen von Astrozyten führt. Dabei zeigte sich, dass nicht toxische oxidative Bedingungen das Proliferationsvermögen von neuralen Stammzellen deutlich hemmten und dazu führten, dass anstelle von Neuronen vornehmlich Astrozyten entstehen. Dieses veränderte Differenzierungsvermögen ließ sich sowohl in vitro als auch in vivo experimentell nachvollziehen und wies darauf hin, dass durch milde Entzündungsprozesse hervorgerufene basale metabolische Veränderungen die neuronale und astrogliale Entwicklung aus neuralen Stammzellen reziprok reguliert wird. In weiteren Untersuchungen stellte sich heraus, dass die Histondeacetylase Sirt1 in neuralen Stammzellen als Sensor für das Redox-Potenzial dient. Schon geringe metabolische Änderungen induzierten die Bindung an den bHLH-Transkriptionsfaktor Hes1, die zu einer direkten Modulation des pro-neuronalen Transkriptionsfaktors Mash1 führten und die Differenzierung von neuralen Stammzellen zugunsten der astroglialen Entwicklung beeinflussten. Die Aufklärung dieses Mechanismus könnte somit zukünftig helfen, intrinsische Regenerationsprozesse nach Schädigung des ZNS zu verstärken und damit neue therapeutische Perspektiven bei neurologischen Erkrankungen zu öffnen. / Damage processes of the central nervous system (CNS) are not only found in Multiple sclerosis (MS) even in a variety of inflammatory diseases. A common feature of these inflammatory neurodegenerative disorders is the existence of oxidative stress in combination with a failure of neuronal replenishment and the predominant occurrence of astrocytes (known as astrogliosis). So far, factors, which are responsible for early neuronal damage and overwhelming generation of astrocytes, are not known. Recent studies could show that the tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) might be involved in immunregulation as well as damage processes in the CNS. Here, it could be shown that blockade of TRAIL in the CNS of animals suffering from experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) significantly ameliorates the disease. Furthermore, transfer of myelin-specific TRAIL-deficient T cells into wild type recipients lead to a significantly attenuated disease score. These findings underline the contribution of TRAIL to irreversible CNS damage. In the adult mammalian brain, multipotent and self-renewing neural progenitor cells (NPCs) have the capacity to generate new neurons, astrocytes and oligodendrocytes. NPCs may thus serve as a regenerative tool by which brain damage could be compensated. However, repair processes in response to all forms of neuronal injury, be they inflammatory, ischemic, metabolic, traumatic or other, are characterized by the failure of neuronal replenishment and the predominant occurrence of astrocytes. The common molecular pathways underlying this phenomenon are only poorly understood. Here, it could be shown that subtle alterations of the redox state, found in different brain damage scenarios, substantially regulate the fate of murine NPCs via the histone deacetylase silent mating type information regulation 2 homolog 1 (Sirt1). Mild oxidative conditions suppress proliferation of NPCs and direct their differentiation towards the astroglial at the expense of the neuronal lineage (and vice versa). Under oxidative conditions, NPCs upregulate Sirt1 in vitro and in vivo, which then binds to the transcriptional repressor Hes1 and finally downregulates the pro-neuronal basic helix-loop-helix transcription factor Mash1. Furthermore, it could be shown that targeted modulation of Sirt1 activity mimics the effects of subtle redox alterations. The results provide evidence for an as yet unknown metabolic master switch, which determines the fate of NPCs. Targeting these mechanisms may minimize undesired aspects of reactive astrogliosis as well as improve the success of therapeutic neural stem cell implantation.

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Self-reactive CD4+ helper T cells (Th) are key causal agents in the pathogenesis of many autoimmune diseases. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a CD4+T cell model of the demyelinating autoimmune disease multiple sclerosis (MS). It has been shown that EAE is caused by CD4+ T-cells that produce pro-inflammatory cytokines IFN-γ (Th1) and IL-17 (Th17). As such, understanding how these Th cells are generated and controlled is essential. There is debate as to whether Th1 and Th17 cells act independently in EAE or if there is plasticity between these two subtypes, and whether the capacity to switch from Th1 to Th17 confers pathogenic capacity. T-bet was first described as the master transcription factor for Th1 cells, and is thought to have a critical role in EAE even though IFN-γ, the Th1 archetypal cytokine, has been shown to be redundant. More recent work has shown that T-bet is expressed in multiple immune cell types, and it remains unclear in what cells the expression of T-bet is required for EAE. Considerable efforts have been put into understanding the role of T-bet in EAE pathogenesis, with a view to modulate cells expressing T-bet for therapy. The hypothesis of this work was that T-bet has multifaceted roles in EAE, in initiating and directing an immune response in innate antigen presenting cells such as dendritic cells (DC) as well as programming pathogenic effector CD4+ T cell (Teff) response to antigen. T-bet-/- mice were studied using different models of EAE to dissect the role of T-bet in disease pathogenesis. Active immunisation of C57BL/6 mice with the immunodominant peptide from myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) showed that T-bet-/- mice developed EAE with an IL-17 dominated profile and critically, T-bet-/- mice were able to produce GM-CSF which has recently been described as a key cytokine for EAE. T-bet-/- cells were not able to transfer EAE in a model of passive transfer EAE, where CD4+ T cells were polarised towards a Th1 profile in vitro. Illustrating that T-bet is required in CD4+ T cells for Th1 mediated EAE. DC driven EAE showed that T-bet-/- DC were able to activate CD4+ T cells in vitro and cause EAE upon co-transfer into host mice with transgenic CD4+ T cells. Thus, it has been shown that T-bet is not required in EAE. This work represents a step further towards understanding the disease mechanisms involved in EAE and suggests T-bet is not an appropriate therapeutic target for the treatment of MS.

Axonal pathology is a key contributor to long-term disability in multiple sclerosis (MS), an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system (CNS), but the mechanisms that underlie axonal insults remain unclear. While most axonal pathologies characterized in MS are a direct consequence of myelin loss, we propose that axonal pathologies also occur independent of demyelination. In support of this idea, we recently reported that mice that develop experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a model commonly used to mimic the pathogenesis of MS, exhibit a structural and functional disruption of the axon initial segment (AIS), a subdomain of the axon that acts as the trigger-zone for action potential generation. Importantly, this disruption is independent of myelin loss. Although the mechanism responsible for AIS disruption remains unclear, we observed an attenuation of the AIS insult following treatment with a known scavenger of oxygen free radicals. To further investigate the role of oxidative stress in modulating AIS stability, we employed an in vitro model in which neurons were exposed to a spontaneous reactive oxygen and nitrogen species generator. Through this approach, we demonstrated that oxidative stress is capable of AIS modulation acting through induction of cytosolic calcium (Ca2+) influx from both extracellular and intracellular sources, resulting in calpain protease activation. Furthermore, because rises in intracellular Ca2+ are central to these and other mechanisms of AIS disruption, we next investigated the cisternal organelle (CO), an AIS-localized Ca2+-regulating structure. Although this organelle could prove to be central to AIS modulation, very little is known about the mechanisms regulating its stability. Through this line of investigation, we provide the first evidence of pathological alteration to the CO in a disease state. This disruption precedes loss of AIS protein clustering and axo-axonic GABAergic input in both EAE and MS postmortem tissue. Overall, these studies reveal a primary axonal insult, independent of myelin loss, in a disease classically characterized as a white-matter pathology. Instead, this insult is most likely driven by oxidative stress through local Ca2+ dysregulation at the AIS, providing novel therapeutic targets for MS.

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A healthy immune system's core challenge is to mount appropriate responses to an immense and unknown variety of antigenic stimuli. By unraveling the regulatory networks that drive and control immune-cell behaviors, we can begin to identify the means by which proper balance can be achieved and aberrant behaviors clinically corrected. Traditionally, major advances in our understanding of cellular immunological processes depended critically on both improved perturbation and enhanced observation methods. In my doctoral research, I have pursued both strategies to elucidate the differentiation and effector functions of adaptive immune Th17 cells. These cells exemplify the need for balance: while Th17 cells are needed to induce clearance of fungal infections and extracellular bacteria, irregular responses have been strongly implicated in autoimmunity. / Chemistry and Chemical Biology

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Aus klinischen Studien ist bereits bekannt, dass die aus der Christrose (Helleborus purpurascens) isolierte makrozyklische Substanz MCS-18 in der Lage ist, eine pathologisch aktivierte Immunreaktion wie die rheumatoide Arthritis zu unterdrücken. In der vorliegenden Arbeit stand die Untersuchung der immunmodulatorischen Wirkung von MCS-18 auf dendritische Zellen (DZ) im Vordergrund. Um eine potente Immunantwort zu induzieren, müssen DZ reifen. Hier konnte in vitro gezeigt werden, dass MCS-18 in der Lage ist, die Expression der typischen Reifungsmarker wie CD80, CD86 und vor allem CD83 zu unterdrücken. Darüber hinaus konnte in vitro eine konzentrationsabhängige Reduktion der DZ- T-Zell - Clusterbildung und eine Blockade der DZ-vermittelten T-Zell Stimulation nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit konnte zusätzlich eine dosisabhängige Reduktion der DZ-unabhängigen, anti-CD3/anti-CD28-vermittelten T-Zell Stimulation gezeigt werden. Ferner konnte eine konzentrationsabhängig reduzierte CCR7 -Expression auf der Oberfläche behandelter DZ und daraus resultierend eine eingeschränkte Migrationsfähigkeit der DZ entlang eines CCL19-Gradienten nachgewiesen werden. In vivo besitzt MCS-18 das Potential, die der EAE (ein Mausmodell der humanen Multiplen Sklerose) assoziierten Paralysesymptome sowohl bei prophylaktischer als auch bei einer realen Verhältnisse am nächsten kommenden therapeutischen Gabe zu reduzieren. Selbst bei der Induktion einer zweiten EAE konnte ein lang anhaltender immunsupprimierender Effekt von MCS-18 festgestellt werden. Am bedeutendsten für eine potentielle spätere therapeutische Anwendung am Menschen ist jedoch die Tatsache, dass MCS-18 auch oral verabreicht wirksam bleibt. Histologisch konnte bei mit MCS-18 behandelten Mäusen eine stark reduzierte Infiltration des Gehirns und Rückenmarks mit CD45+ Leukozyten nachgewiesen werden. Zusammengefasst zeigen sowohl die in vitro als auch die in vivo gewonnenen Daten das große therapeutische Potential von MCS-18 für die Therapie von autoimmunen oder anderen immunbedingten Erkrankungen auf.