It has recently become apparent that cells encode a large number of novel non-protein-coding genes called long non-coding RNAs (lncRNAs). Whilst the biological function of many lncRNAs remains unknown, recent evidence has suggested that lncRNAs may be important regulators of cellular growth, differentiation and may play a significant role in cancer. Epidermal growth factor (EGF) – an activator of the ERK1/2 signalling cascade – is an important spatio-temporal regulator of transcription and, ultimately, of cellular growth and movement. EGF stimulation triggers a wave-like expression of immediate-early genes (IE genes), followed by delayed-early genes (DE genes) and secondary-response genes (SR genes). Over the years, considerable effort has been made to unravel the regulatory loops downstream of EGF signalling. This study investigated whether lncRNAs are sensitive to EGF signalling and whether they play a role in the transcriptional programme associated with EGF signalling. In order to identify lncRNAs regulated by EGF signalling, I sequenced nuclear RNA in the presence or absence of EGF stimulation. RNA-seq data showed that 173 lncRNAs are upregulated by EGF, of which 89 were intergenic lncRNAs (lincRNAs). The time-dependent expression profile of EGF-upregulated lincRNAs followed the well-established expression pattern of IE genes. Finally, investigation of the expression of lincRNAs in primary breast and lung cancer cells showed that EGF-upregulated lincRNAs were differentially expressed in cancer. The EGF-dependent induction profile and cancer enrichment were particularly strong for one of the transcripts – EGF-induced lncRNA 1 (EIN1) – and I selected it for further studies. Firstly, using bioinformatics and biochemical approaches, I confirmed the non-coding status of the EIN1 transcript. Secondly, I confirmed that EIN1 transcription is ERK1/2-dependent and is independent of protein synthesis. Investigation of EIN1 expression in normal tissues showed its high enrichment in the human cardiovascular system. At the cellular level, the EIN1 transcript was predominantly found in the nucleus. Functionally, the depletion of endogenous EIN1 transcripts (using the newly developed CRISPRi approach) led to changes in the EGF-dependent transcription programme. EIN1 downregulation resulted in the addition of normally EGF-independent genes into the EGF-dependent expression programme. Collectively, these results show that EGF (via the ERK1/2 pathway) can regulate transcription of lincRNAs. The EIN1 example suggests that lincRNAs may play a crucial role in the modulation of the EGF-dependent expression programme by limiting of the scope of the programme.

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Receptor-tyrosine kinases (RTKs) are membrane bound receptors characterized by their intrinsic kinase activity. RTK activities play an essential role in several human diseases, including cancer, diabetes and neurodegenerative diseases. RTK activities have been regulated by the expression or silencing of several genes as well as by the utilization of small molecules. Ras Interference 1 (Rin1) is a multifunctional protein that becomes associated with activated RTKs upon ligand stimulation. Rin1 plays a key role in receptor internalization and in signal transduction via activation of Rab5 and association with active form of Ras. This study has two main objectives: (1) It determines the role of Rin1 in the regulation of several RTKs focusing on insulin receptor. This was accomplished by studying the Rin1-insulin receptor interaction using a variety of biochemical and morphological assays. This study shows a novel interaction between the insulin receptor and Rin1 through the Vps9 domain. Two more RTKs (epidermal growth factor receptor and nerve growth factor receptor) also interacted with the SH2 domain of Rin1. The effect of the Rin1-RTK interaction on the activation of both Rab5 and Ras was also studied during receptor internalization and intracellular signaling. Finally, the role of Rin1 was examined in two differentiation processes (adipogenesis and neurogenesis). Rin1 showed a strong inhibitory effect on 3T3-L1 preadipocyte differentiation but it seems to show a modest effect in PC12 neurite outgrowth. These data indicate a selective function and specific interaction of Rin1 toward RTKs. (2) It examines the role of the small molecule Dehydroleucodine (DhL) on several key signaling molecules during adipogenesis. This was accomplished by studying the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes exposed to different concentrations of DhL in different days of the adipocyte formation process. The results indicate that DhL selectively blocked adipocyte formation, as well as the expression of PPARγ, and C/EBPα. However, DhL treatment did not affect Rin1 or Rab5 expression and their activities. Taken together, the data indicate a potential molecular mechanism by which proteins or small molecules regulate selective and specific RTK intracellular membrane trafficking and signaling during cell growth and differentiation in normal and pathological conditions.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Der ischämische Schlaganfall gehört wegen seiner Folgen wie beispielsweise persistierenden Lähmungen und Sprachstörungen bis hin zum Versterben des Patienten angesichts der hohen Inzidenz zu den derzeit sozioökonomisch bedeutsamsten Krankheitsbildern (Ward et al. 2005, Kolominsky-Rabas et al. 2006). Die Möglichkeiten der Akutbehandlung sind trotz intensiver Forschungsbemühungen während der letzten Jahrzehnte nicht zufriedenstellend, da hierfür nur ein vergleichsweise geringer Anteil der Patienten in Frage kommt. Der Einsatz von neuroprotektiven Substanzen stellt eine vielversprechende Option dar, auch wenn bisher kein Neuroprotektivum den regelhaften klinischen Einsatz erreicht hat. Die vorliegende tierexperimentelle Arbeit an Ratten analysierte den Einfluss der beiden intravenös applizierten Faktoren pigment epithelium-derived factor (PEDF) und epidermal growth factor (EGF) auf die Bestandteile der Blut-Hirn-Schranke (BHS) bei zerebraler Ischämie. Diese Arbeit basiert ganz wesentlich auf der Studie von Pillai et al. (2013), in der intravenös appliziertes PEDF im Schlaganfall-Tiermodell zum Einsatz kam: Beide Faktoren verkleinerten nach einstündigem filamentären Verschluss der Arteria cerebri media und anschließender Reperfusion die mittels Magnetresonanztomographie (MRT) bestimmte ischämische Läsionsgröße. Darüber hinaus führten sie im geschädigten Gebiet - verglichen mit der Kontrollgruppe - zu einer verringerten Ödembildung. Dabei erzielte die Intervention durch PEDF stärkere Effekte gegenüber der Behandlung mit EGF, im Besonderen wurde in der PEDF- Gruppe die weitere Zunahme des Ödems im Infarktareal und dem unmittelbar angrenzenden Gewebe nach 48 Stunden verringert. Beiträge zur Aufklärung hierfür verantwortlicher molekularer Mechanismen durch histochemische Untersuchungen des Hirngewebes waren Ziel der vorliegenden Arbeit. Hierzu wurde den Tieren das Hirngewebe an Tag 7 nach induziertem Infarkt entnommen und für die immunhistochemische Analyse aufgearbeitet. Mit einem Gefrierschnittmikrotom wurden 30 μm dicke Frontalschnitte der Paraformaldehyd- fixierten Vorderhirnblöcke von 26 Tieren angefertigt. Als Regions of Interest (ROI) innerhalb der Schnitte wurden die striatale Ischämiezone (Infarktkern), eine ipsilateral striatal gelegene, weniger Ischämie-betroffene Zone (Grenzzone), das kontralaterale Striatum (Kontrolle) sowie ein ischämisches Kortexareal festgelegt. Qualitative Analysen umfassten neben wichtigen zellulären Komponenten der BHS, den Astrozyten und Endothelzellen, auch Mikroglia/Makrophagen sowie das azelluläre Basalmembranprotein Kollagen IV. Alle Versuchsgruppen zeigten eine deutliche Hochregulierung von Kollagen IV im zentralen Infarktgebiet, verglichen mit der kontralateralen Hirnregion. Andere Arbeiten hatten diese Überexpression von Kollagen IV zu früheren Zeitpunkten nach Schlaganfall bereits beschrieben (Beaten und Akassoglou 2011, Ji und Tsirka 2012, Summers et al. 2013); neu ist die Persistenz der Hochregulierung bis mindestens Tag 7 nach fokaler zerebraler Ischämie. Im gleichen Ischämie-beeinflussten Gebiet konnten morphologische Zeichen eines veränderten Aktivitätszustandes von Mikroglia/Makrophagen festgestellt werden. In den Regionen, die nicht direkt von der Ischämie betroffen waren (z.B. dem kontralateralen Striatum), stellten sich ramifizierte Mikrogliazellen in mäßiger Dichte dar. Im Gegensatz dazu akkumulierten amöboide Mikroglia/Makrophagen im Infarktareal. In der Übergangszone zwischen geschädigtem Gewebe und nicht direkt Ischämie-betroffenen Regionen zeigte sich in allen Tieren die Ausprägung einer Astroglianarbe, bestehend aus einer dichten Formation von stark GFAP-markierten Astrozyten. Bei der semiquantitativen Gegenüberstellung der einzelnen Untersuchungsgruppen wiesen die mit PEDF behandelten Ratten in Relation zur Kontrollgruppe eine um den Faktor 3 geringere Hochregulierung von Kollagen IV im Infarktgebiet auf. Im Areal der Infarktpenumbra war die Intensität des GFAP-Immunsignals der PEDF-Gruppe im Vergleich zur EGF-Gruppe verdoppelt. Darüber hinaus schienen die Faktoren keinen Einfluss auf die Akkumulation/Morphologie von Mikroglia/Makrophagen im Infarktgebiet zu haben. Hervorzuheben ist die in PEDF-behandelten Ratten gegenüber EGF-behandelten Tieren und Kontrolltieren verringerte Kollagen IV-Hochregulierung im Infarktgebiet und die verstärkte Bildung einer GFAP-immunopositiven Astroglianarbe in der ischämischen Grenzzone. Beide Befunde eignen sich zur Erklärung der durch Pillai et al. (2013) erzielten Ergebnisse. Hinweise für den molekularen Mechanismus, der der Verringerung der BHS-Permeabilität zugrunde liegt, finden sich in vorausgegangenen Studien, die einen antiangiogenetischen Effekt von PEDF über eine Abschwächung des VEGF-Pathways beschrieben haben (Dawson 1999, Liu et al. 2004, Zhang et al. 2006). Die Wirkung von intravenös appliziertem PEDF als neuroprotektive Therapieoption des Hirninfaktes benötigt weitere Untersuchungen um die in beiden Arbeiten festgestellten Effekte zu bestätigen. Hierbei erscheint ein Tiermodell sinnvoll, das – analog zur klinischen Situation – rekanalisierende Therapien wie die Thrombolyse oder mechanische Rekanalisation berücksichtigt. Zusätzliche Mehrfachmarkierungen ermöglichten neue qualitative Aussagen zur zerebralen Ischämie im Rattenmodell, die Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen bieten. Die nähere Charakterisierung von Gefäßveränderungen nach fokaler zerebraler Ischämie gelang durch eine Dreifachmarkierung von STL, Kollagen IV und Fibronektin. Hier zeigte sich neben der bereits oben beschriebenen Hochregulation von Kollagen IV auch eine verstärkte Expression von Fibronektin im Bereich des Infarktkerns, kolokalisiert mit STL-markierten Mikroglia/Makrophagen. Das Areal mit deutlicher Fibronektinmarkierung war flächenmäßig erheblich größer als der Kollagen IV-immunpositive Bereich. Die Analyse der Basalmembranbestandteile kann neue Erkenntnisse zum Mechanismus der ischämischen Schädigung der BHS bei fokaler zerebraler Ischämie im Tiermodell liefern und bietet sich möglicherweise als Indikator für das Schädigungsausmaß an. Darüber hinaus waren im stark Kollagen IV-markierten ischämischen Kernbereich Aquaporin 4 (AQP4)-immunpositive Astrozytenfortsätzen fast vollständig eliminiert. Mit größerer Entfernung vom ischämischen Kern nahm in der Grenzzone die AQP4-Dichte zu, während die Kollagen IV-Immunmarkierung schwächer wurde. Dieser Befund deutet auf eine Regulation der Kollagen IV-Expression durch einen intakten Endothelzell-Astrozytenendfuß-Kontakt hin, der in der Ischämiezone aufgehoben scheint. Ein Verlust von Astrozytenendfuß-Endothelzell-Kontakten im Schlaganfall- Tiermodell wurde in einer vorangegangenen Arbeit bereits beschrieben (Ito et al. 2011). Zudem fanden Kwon et al. (2009) eine positive Korrelation zwischen der Anzahl von intakten Astrozyten-Basalmembran-Kontakten zur Dicke der BM im striatalen Kapillargebiet von Ratten. Darüber hinaus konnten Yang und Rosenberg (2011) zeigen, dass in der frühen Phase der zytotoxischen Ödemformation nach Schlaganfall Tiere mit Deletion von AQP4 eine verringerte Ödembildung aufwiesen, wogegen in einer späteren Phase, in der das vasogene Ödem dominiert, AQP4 als passives Wasserkanalprotein die Beseitigung des Ödems beschleunigte (Zador et al. 2007). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen die pathophysiologische Bedeutung AQP4- positiver Astrozytenfortsätze und ihrer Gefäßkontakte speziell im Periinfarktgebiet nahe, sodass diese Strukturen in weiterführenden Studien hinsichtlich ihrer therapeutischen Modulierbarkeit fokussiert werden sollten.:1 Einleitung 1.1 CharakterisierungdesSchlaganfalls 1.1.1 Begriffsdefinition 1.1.2 Epidemiologie 1.2 Blut-Hirn-Schranke (BHS) und Neurovaskuläre Einheit (NVU) 1.2.1 Zelluläre und azelluläre Bestandteile der BHS 1.2.2 DiffusionundaktiverTransport 1.2.3 ElektrolyteundWasserhomöostase 1.2.4 Astrozyten 1.2.5 MikrogliaundMakrophagen 1.2.6 Perizyten 1.3 PathophysiologiedesSchlaganfalls 1.3.1 PerfusionundexzitatorischeReaktion 1.3.2 Zelluläre und molekulare Mechanismen der Inflammation 1.4 TherapiedesSchlaganfalls 1.4.1 ThrombolysemittelsAlteplase(rtPA) 1.4.2 IntraarterielleBehandlung 1.4.3 Basistherapie 1.5 Experimentelle Grundlagen der vorliegenden Arbeit 2 Zielstellung 3 Studiendesign, Material und Methoden 3.1 Studiendesign 3.2 Material 3.2.1 UntersuchtesGewebe 3.2.2 Chemikalien 3.2.3 Lösungen 3.2.4 Mehrfachmarkierungen 3.3 Methoden 3.3.1 OperativesVorgehen 3.3.2 Behandlung mit EGF und PEDF 3.3.3 Gewebevorbereitung 3.3.4 Fluoreszenzmarkierungen 3.3.5 Ausschlusskriterien 3.4 Auswertung 3.4.1 Fluoreszenzmikroskopie 3.4.2 Semiquantitative Analyse von Kollagen IV, GFAP und Iba 3.4.3 QualitativeAnalysen 4 Ergebnisse 5 Diskussion 5.1 Tiermodell 5.2 OperativesVerfahren;tMCAO 5.3 VEGFundAQP4 5.4 KollagenIVundFibronektin 5.5 DetektionvonAstroglia 5.6 DarstellungvonMikrogliaundMakrophagen 5.7 PEDFundEGFalsNeuroprotektiva 6 Zusammenfassung der Arbeit

The EGF-TM7 receptor CD97 shows different features of expression and function in muscle cells compared to hematopoetic and tumor cells. Since the molecular function and regulation of CD97 are poorly understood, this study aimed at defining its basal transcriptional regulation in smooth muscle cells (SMCs). The computational analysis of the CD97 5′-flanking region revealed that the TATA box-lacking promoter possesses several GC-rich regions as putative Sp1/Sp3 binding sites. Transfection studies with serially deleted promoter constructs demonstrated that the minimal promoter fragment resided in the − 218/+ 45 region containing one out of five identified GC-boxes in the leiomyosarcoma cell line SK-LMS-1 and human bronchial smooth muscle cells (HbSMCs). Mutation of the most proximal GC-site in CD97 reporter gene constructs caused a significant decrease in promoter activity. Gel shift assays and chromatin immunoprecipitation revealed that Sp1 and Sp3 bound specifically to the most proximal GC-site. Furthermore, we showed that Sp1 and Sp3 over-expression activates CD97 promoter activity in HEK293 cells. Our data characterize for the first time the activity of the human CD97 promoter which is controlled by Sp1/Sp3 transcription factors in SMCs.

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