Integrin α6β4 is upregulated in pancreatic carcinoma, where signaling promotes metastatic properties, in part by altering the transcriptome. Such alterations can be accomplished through DNA demethylation of specific promoters, as seen with the pro-metastatic gene S100A4. I found that signaling from integrin α6β4 dramatically upregulates expression of amphiregulin (AREG) and epiregulin (EREG), ligands for the epidermal growth factor receptor (EGFR), and that these ligands promote pancreatic carcinoma invasion. To determine if AREG and EREG are regulated by DNA methylation, pancreatic cancer cells with low AREG and EREG expression were treated with the DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2’-deoxycytidine (5-Aza-CdR), resulting in stable overexpression of AREG and EREG, and this induction required signaling from integrin α6β4. Similarly, treatment of cells with high integrin α6β4 with the methyl donor S-adenosylmethionine inhibited gene expression of AREG and EREG. Whole genome bisulfite sequencing on pancreatic cancer cells reveled hypomethylation of the promoter regions of AREG and EREG when integrin α6β4 is high, and these regions correspond to H3K27Ac, indicative of enhancer location. Interestingly, I also observed genome-wide DNA demethylation, and a large proportion of altered CpGs correspond to potential enhancers. It is currently accepted that active DNA demethylation occurs via DNA repair. I tested this hypothesis by treating cells with Gemcitabine, which inhibits multiple components of DNA repair, including DNA demethylation mediated by GADD45A. Gemcitabine treatment resulted in marked reduction in AREG and EREG expression. To further test the involvement of GADD45A, I used RNAi-mediated knockdown or cDNA overexpression to alter GADD45A levels. In both instances, AREG and EREG expression positively correlated with GADD45A, particularly when integrin α6β4 is high, indicating that GADD45A is a rate-limiting step in AREG and EREG overexpression. Similarly, using stable shRNA, I show that Thymine DNA Glycosylase (TDG), and TET1 known modulators of DNA demethylation, are required for AREG and EREG expression in integrin α6β4 high cells, and nuclear localization of TDG is much higher in cells with high integrin α6β4. Using a specific inhibitor I found that AREG and EREG expression is dependent on Parp-1. Finally, I determined that integrin α6β4 signaling enhances cells ability to respond to and survive in the presence of DNA damage, and that active DNA repair is required for integrin α6β4 mediated DNA demethylation. Taken together, these data indicate that DNA repair is required to maintain overexpression of AREG and EREG in response to signaling from integrin α6β4 and that integrin α6β4 promotes this overexpression by enhancing DNA repair.

Die Entwicklung von Fernmetastasen ist die Haupttodesursache bei Tumorerkrankten und der entscheidende klinisch relevante Schritt während der Tumorprogression. Die Seed and Soil Theorie von Stephen Paget besagt, dass verschiedene Tumorzellen spezifische Zielorgane während der Metatasierung bevorzugen. Während das häufigste Target der kolorektalen Karzinome die Leber ist, hat der triple-negative molekulare Subtyp von Brustkrebs die Neigung, in das Gehirn zu metastasieren. Interessanterweise spielen sowohl deregulierte EGFR (Epithelial growth factor receptor) als auch WNT Signalwege in diesen beiden Entitäten eine entscheidende Rolle. Das Ziel der Arbeit ist, die Rolle der beiden Signalwege in soliden Tumorzelllinien in Bezug auf die Tumorprogression und Kolonisation zu untersuchen. Im Rahmen der molekularen Charakterisierung der Zelllinien zeigten sich die Mammakarzinomzelllinie 410.4 und die kolorektale Tumorzelllinie CMT-93 als passende Modellsysteme für unsere Fragestellung. Anschließend wurden der EGFR und der WNT Signalweg in diesen Zellen im Sinne von gain of function und loss of function moduliert und die Auswirkungen auf Aspekte der Tumorprogression analysiert. In CMT-93 Zellen wurde ein EGFR Knockdown etabliert. Während der Knockdown keinen Einfluss auf die Proliferation hat, vermindert er die Invasion der Zellen. Somit konnte dem effizienten Knockdown eine funktionelle Wirksamkeit zugeschrieben werden. Eine EGFR Überexpression konnte sowohl in 410.4 als auch in CMT-93 Zellen etabliert werden. Die Analyse der jeweiligen Signalkaskadenweiterleitung ergab zwar Änderungen und somit eine funktionelle Relevanz, dies blieb jedoch ohne Auswirkungen auf das Invasionspotential der Zelllinien. Ein Knockdown von β-Catenin konnte in 410.4 zwar etabliert werden, blieb jedoch ohne funktionelle Auswirkungen. Eine stabile Überexpression von β-Catenin war nicht erfolgreich, da dies offenbar mit der Viabilität der Zellen interferierte. Die Relevanz des β-Catenin-abhängigen WNT Signalwegs in den beiden gewählten Zelllinien konnte somit nicht abschließend geklärt werden. Des Weiteren wurde die Bedeutung des nicht-kanonischen WNT Signalwegs via ROR2 und WNT11 untersucht. Dabei ergab sich, dass die Überexpression von WNT11 und ROR2 in 410.4 Zellen deren Invasion durch einen RHOA-abhängigen Mechnismus steigert und einen Einfluss auf den PI3K Signalweg hat. Es ist anzunehmen, dass WNT11 als downstream Target über ROR2 induziert wird und über einen positiven Feedback-Loop via ROR2 eine autokrine Stimulation ausübt.

Doctor of Philosophy / Department of Biochemistry and Molecular Biophysics / Anna Zolkiewska / The ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) family of multi-domain proteins modulates a number of cellular signaling pathways in both normal and cancerous cells. ADAM12 has been shown to be a candidate cancer gene for breast cancer and its expression is up-regulated in breast tumors. The human ADAM12 transcript is alternatively spliced. One of these splice variants encodes a transmembrane ADAM12 isoform, ADAM12-L, which has been demonstrated to release cell signaling molecules from the cell surface. Another variant encodes a secreted protease, ADAM12-S, which cleaves extracellular matrix proteins and other secreted proteins. Although these variants are expressed from the same promoter, their relative expression levels are highly discordant. Here, I demonstrate variant-specific regulation of ADAM12 transcripts by microRNAs. Members of the microRNA-29 and microRNA-200 families target the unique 3’UTR of the ADAM12-L transcript and cause transcript degradation. Additionally, I show the presence of a novel ADAM12 splicing event in which 9 additional nucleotides are inserted in the region encoding the autoinhibitory pro-domain. I demonstrate that this novel variant is expressed in breast epithelial cells and breast cancer cell lines. The resulting protein isoform does not undergo proteolytic processing to activate the protease. Additionally, trafficking of the novel isoform to the cell surface is impaired and this isoform is localized to the endoplasmic reticulum. Finally, I determined a role for ADAM12-L in the progression of triple negative breast cancers (TNBCs). These tumors are lacking expression of hormone receptors and the HER2 receptor. HER2 is a member of the epidermal growth factor receptor (EGFR) family and the loss of the HER2 receptor causes tumors to rely on EGFR for propagating pro-growth signals. I show here that, in TNBC tumors, ADAM12-L expression is strongly correlated with poor patient prognosis and increased activation of EGFR. These data suggest that in TNBCs, ADAM12-L enhances tumor growth via EGFR activation. Collectively, the data presented here demonstrate (a) transcript-specific regulation of ADAM12 in breast cancer, (b) the existence of a novel splice variant and protein isoform with impaired cellular trafficking, and (c) an important role of the ADAM12-L isoform in EGFR activation in TNBC.

Die EGFR-Signalübertragung steuert viele verschiedene zelluläre Prozesse in allen Arten von Epithelzellen, einschließlich des Darmepithels. Diese Prozesse reichen von Proliferation und Wachstum über Differenzierung bis hin zu Autophagie und Apoptose. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, die Signalveränderungen zu charakterisieren, die im Darmepithel als Reaktion auf EGF-induzierten Hungerstress stattfinden. Kontraintuitiv führte eine 24-stündige EGF-Starre zu einer deutlichen Phosphorylierung von EGFR, MEK1/2 und ERK1/2, was auf eine Aktivierung dieser Signalachse in Darmzellen hindeutet. Diese Veränderungen waren am signifikantesten in den undifferenzierten CD44-reichen Krypta-Basiszellen. Interessanterweise war die EGF-Starvation-induzierte ERK1/2-Phosphorylierung mit der Hochregulierung einer Untergruppe von ERK-Zielgenen verbunden, bei denen es sich zumeist um primäre Zielgene handelt. Die Überexpression des EGFR-Liganden HBEGF und des FGFR-Liganden FGF1 in ausgehungerten Zellen könnte für die hungerbedingte Zunahme der MAPK-Aktivität verantwortlich sein, obwohl eine erhöhte Sekretion dieser Liganden durch ausgehungerte Organoide nicht bestätigt werden konnte. Dennoch wird die kompensatorische Ligandensekretion durch die Beobachtung gestützt, dass die erneute Zugabe von EGF zu ausgehungerten Organoiden die pERK1/2-Spiegel auf den Ausgangswert zurücksetzt, was bedeutet, dass EGF mit einem anderen von ausgehungerten Zellen sezernierten Liganden um den EGFR konkurriert. Zusätzlich zu HBEGF wurde festgestellt, dass andere Gene, die für den Schutz, das Überleben und die Regeneration des Darmepithels bekannt sind, in ausgehungerten Organoiden überexprimiert werden, wie z. B. Reg3b. Insgesamt können die in dieser Studie berichteten EGF-induzierten Veränderungen der MAPK-Signalübertragung und der globalen Genexpression als ein überlebensförderndes Programm interpretiert werden, das bevorzugt in Darmstammzellen und frühen Vorläuferzellen aktiviert wird. / EGFR signaling drives many different cellular processes in all kinds of epithelial cells including the intestinal epithelium. Such processes range from proliferation and growth to differentiation to autophagy and apoptosis. The present study aims to characterize signaling changes that take place in the intestinal epithelium in response to EGF starvation-induced stress using epithelial organoids derived from the mouse duodenum and human colorectal tumor tissue. Counterintuitively, 24 h EGF starvation induced a prominent phosphorylation of EGFR, MEK1/2 and ERK1/2 indicating an activation of this signaling axis in intestinal cells. These changes were most significant in the undifferentiated CD44-high crypt base cells. Interestingly, EGF starvation-induced ERK1/2 phosphorylation was associated with upregulation of a subset of ERK target genes that were mostly primary-response targets. Overexpression of the EGFR ligand HBEGF and the FGFR ligand FGF1 in starved cells may account for starvation-driven increase in MAPK activity, although an increased secretion of these ligands by starved organoids was not confirmed. Nevertheless, compensatory ligand secretion is still supported by the observation that EGF re-addition to starved organoids restores pERK1/2 levels to baseline which implies that EGF competes for EGFR with some other ligand secreted by starved cells. In addition to HBEGF, other genes known to promote protection, survival and regeneration of the intestinal epithelium were found to be overexpressed in starved organoids such as Reg3b. Collectively, EGF starvation-induced changes in MAPK signaling and global gene expression reported in this study can be interpreted as a pro-survival program that gets activated preferentially in intestinal stem cells and early progenitors.

Les maladies dégénératives de la rétine sont une des causes principales de cécité. Parmi différentes stratégies thérapeutiques actuellement étudiées, notre équipe s’intéresse au potentiel régénératif de la rétine. Une source cellulaire d'intérêt sont les cellules de Müller, principal type de cellules gliales de la rétine, capables de se réactiver en cas de dégénérescence et d’adopter certaines caractéristiques de cellules souches. Elles entrent alors dans un état appelé gliose réactive. Tandis que chez certaines espèces comme le poisson, elles permettent la régénération de la rétine, elles ont des capacités régénératives très limitées et inefficaces chez les mammifères. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires régissant la gliose réactive des cellules de Müller est donc essentielle si l’on veut identifier des cibles thérapeutiques capables de stimuler le potentiel de régénération de ces cellules. Dans ce contexte, le but de mon projet de thèse a été d’étudier le rôle du co-facteur de transcription YAP dans la réactivation des cellules de Müller. Cette protéine est l’effecteur de la voie de signalisation Hippo, connue pour son implication dans la régulation des cellules souches et la régénération de certains organes.Dans un premier temps, nous avons réalisé une analyse transcriptomique qui a montré que la voie Hippo/YAP est une des principales voies dérégulées dans un modèle de dégénérescence rétinienne chez la souris. Nous avons ensuite montré que la protéine YAP est spécifiquement exprimée dans les cellules de Müller et que son expression et son activité transcriptionnelle sont augmentées au cours de la dégénérescence lorsque les cellules de Müller deviennent réactives. Ces données suggèrent pour la première fois un lien entre YAP et la gliose réactive dans la rétine. Par conséquent, dans un second temps, mon projet de thèse a consisté en l’étude fonctionnelle de YAP dans les cellules de Müller. Dans ce but, nous avons généré par croisements chez la souris un modèle inductible de délétion du gène Yap spécifiquement dans ces cellules. Ce modèle a permis de montrer qu’en absence de Yap en conditions physiologiques, plusieurs gènes spécifiques des cellules de Müller sont dérégulés, suggérant un dysfonctionnement de ces cellules. L’étude phénotypique a permis de révéler que ces dérégulations moléculaires conduisent à un vieillissement prématuré des cellules de Müller et à une baisse de la vision chez les souris âgées. Ces données suggèrent que YAP est requis pour le fonctionnement normal des cellules gliales de Müller. Nous avons ensuite examiné l’impact de la perte de Yap dans les cellules de Müller en conditions de dégénérescence des photorécepteurs. Une analyse transcriptomique a permis de montrer que différents aspects de la réponse moléculaire des cellules de Müller réactives sont affectés. Parmi les processus biologiques dérégulés, nous nous sommes intéressés à la régulation de la prolifération cellulaire. Nous avons montré que YAP est nécessaire à l’augmentation de l’expression de gènes associés à la réentrée dans le cycle cellulaire de la glie de Müller. Par ailleurs, nos résultats suggèrent que des composants de la voie de signalisation EGFR, connue pour son rôle central dans la réactivation des cellules de Müller, sont régulés par YAP.Dans l’ensemble, ces résultats révèlent l’importance de YAP (i) dans le fonctionnement des cellules de Müller en conditions physiologiques pour maintenir l’homéostasie rétinienne, et (ii) dans la régulation des processus de réactivation de ces cellules en conditions dégénératives. De plus, ces données permettent de proposer un modèle selon lequel YAP serait impliqué dans le contrôle de la réentrée des cellules de Müller dans le cycle cellulaire via une interaction avec la voie de signalisation EGFR. Ce travail a donc contribué à approfondir nos connaissances du réseau de signalisation impliqué dans la réactivation des cellules de Müller de la rétine des mammifères. / Retinal dystrophies are one of the main causes of blindness. Among the different therapeutic strategies currently studied, our team is interested in the regenerative potential of endogenous retinal cells. A cellular source of interest are Müller cells, which are the main type of glial cells in the retina. These cells are able to reactivate in case of retinal degeneration and adopt various characteristics of stem cells. They enter a state called reactive gliosis. While in some species such as the fish, they allow the complete regeneration of the retina, they have very limited and ineffective regenerative capacities in mammals. Increasing our knowledge of the complex molecular response of Müller cells to retinal degeneration is thus essential for the development of promising new therapeutic strategies. In this context, the aim of my thesis project was to study the role of the co-transcription factor YAP in Müller cells reactivation. This protein is the main effector of the Hippo signaling pathway which is a crucial player in the field of stem cell biology and regeneration.As a first step, we performed a transcriptomic analysis, which revealed that the Hippo/YAP pathway is one of the main signaling deregulated in a mouse model of photoreceptor degeneration. In particular, we found that YAP is specifically expressed in Müller cells and strongly upregulated upon retinal degeneration, when these cells are reactivated. We thus uncovered for the first time a link between the Hippo/YAP pathway and reactive gliosis in the retina. Consequently, the second part of my thesis project was to undertake a functional study of YAP in Müller cells. For this purpose, we generated, by crossing, a mouse model allowing for Yap conditional knockout specifically in these cells. This model allowed us to show that Yap deletion leads to deregulation of several Müller cell specific genes. A phenotypic analysis revealed that these molecular deregulations lead to premature aging of Müller cells and visual defects in old mice. These results suggest that YAP is required for normal function of Müller glial cells. We then studied the impact of Yap deletion in Müller cells under degenerative conditions. A transcriptomic analysis revealed that various aspects of the molecular response of reactive Müller cells are affected in the absence of Yap. Among the deregulated biological processes, we focussed in particular in the regulation of cell proliferation. We found that YAP is required to trigger cell cycle gene upregulation that occurs in Müller glial cells following photoreceptor cell death. Furthermore, our results suggest that some components of the EGFR signaling pathway, which is known for its central role in the reactivation of Müller cells in pathological conditions, are regulated by YAP in Müller cells.Taken together, these results highlight the importance of YAP (i) in Müller cell function under physiological conditions to maintain retinal homeostasis, and (ii) in the regulation of Müller cell reactivation process under degenerative conditions. Moreover, these data allow us to propose a model in which YAP would be involved in the control of Müller glia cell cycle re-entry through its interaction with the EGFR signaling pathway. Therefore, this work has contributed to increase our knowledge of the signaling network involved in the reactivation of Müller cells in the mammalian retina.