En l'actualitat es coneix un gran ventall d'enzims naturals capaços de catalitzar la formació d'enllaços caboni-carboni amb estereoquímica definida que obren noves perspectives en el camp de la síntesi asimètrica aportant solucions sintètiques en camps difícils d'abordar des de la perspectiva de la síntesi orgànica convencional. Aquests enzims són bàsicament aldolases i transcetolases. En concret es coneix una família de quatre aldolases depenents de DHAP que catalitzen la formació d'un enllaç C-C amb generació de dos nous centres quirals amb estereoquímica definida i complementària: segons l'aldolasa utilitzada s'obtindrà de forma específica un dels quatre diaestereoisòmers possibles. Aquesta família d'aldolases ha despertat un gran interès com a eina sintètica.El projecte en que s'emmarca aquesta tesi aposta per l'estudi d'aquest grup de biocatalitzadors i pretén contribuir al desenvolupament pràctic de les aldolases centrant-se en els aspectes de producció dels enzims i en el desenvolupament de metodologia per a la seva utilització en síntesi quiral.En aquesta memòria de tesi doctoral s'estudia la millora de producció de l'aldolasa Fuc-1-PA en E.coli, com enzim model d'aquesta família d'aldolases depenents de DHAP. L'objectiu és definir un procés optimitzat i reproduïble per a la seva obtenció a escala productiva. Amb aquest objectiu global, es consideren els principals aspectes que condicionen la sobreexpressió de proteïnes recombinants E.coli. Primer, s'estudia la influència de la composició del medi de cultiu en el creixement i sobreexpressió recombinant. Segon, es treballa en el desenvolupament d'una estratègia de cultiu semicontínua adequada per assolir cultius d'alta densitat cel.lular de forma reproduïble. Un cop fixades les condicions d'operació per al creixement segons aquesta estratègia semicontínua, és possible definir els criteris d'inducció per maximitzar la producció de Fuc-1-PA al procés. Finalment, s'aborda la millora genètica del procés provant un nou sistema d'expressió recombinant desenvolupat pensant en la seva aplicació a escala de producció. / Nowadays, a considerable number of wild-type enzymes catalazing formation of stereo chemically defined C-C bond as natural function have been discovered. These enzymes have opened new possibilities in quiral chemistry field as they could mean a solution for problems impossible to be solved right now with conventional organic chemistry alternatives. These enzymes are, basically, aldolases and transketolases. It is important to point here out that it is known a four members DHAP dependent aldolases family which is able to catalyze the formation of a new C-C bond which results in the formation of two new quiral centers with complementary and perfectly defined stereochemistry. Hanging on the aldolase employed in the new C-C bond synthesis it is obtained specifically one of the four possibles diastereoysomers. This family has been considered really interesting as synthetic tool.The project this thesis work is related to, is focused on the study of these biocatalyzers group and its main goal is the practical knowledge of aldolases: learn new techniques for maximize their production and make it possible their final application as quiral synthetic tools.In this work, improvements in Fuculose-1-phosphate aldolase production are studied, as enzyme model of this four members family. The final goal fixed for this work is define a optimizated and reproducible process for its production at industrial scale. To obtain this final goal, here are studied the most important points affecting recombinant proteins production in E. coli. First, study of growth media composition influence in growth and recombinant overexpression. Second, search of a new semi-continues fermentation strategy which allows obtain high cell density cultures in a reproducible way. Once, growth conditions have been fixed related to this new semi continues fermentation strategy, it is possible to work on induction criteria definition in order to maximize Fuc-1-FA production. Finally, work has been focused on genetic improvement of the process. We have tested a new recombinant expression system for industrial scale application: ORT expression System.

Estudis epidemiològics han posat en evidència la importància del consum de dietes riques en aliments d'origen vegetal en la prevenció de malalties cardiovasculars, càncer i malalties neurodegeneratives. Aquests efectes beneficiosos s'han relacionat amb l'existència de compostos bioactius en aliments vegetals com poden ser els polifenols. Però per a poder extrapolar aquests resultats i valorar els efectes fisiològics in vivo és necessari estudiar la seva absorció, metabolisme i capacitat d'excreció en l'organisme. Encara és poc coneguda la biodisponibilitat dels polifenols de la dieta, l'activitat dels metabòlits formats in vivo, la seva distribució i acció en teixits diana i la concentració suficient que és capaç de desencadenar un efecte biològic protector. Per tant, és essencial conèixer l'absorció, el metabolisme i acumulació d'aquests compostos polifenols en l'organisme humà i estudiar les bases científiques que sustentin els mecanismes implicats en el seu potencial benefici per a la salut així com en la prevenció de malalties mitjançant estudis de biodisponibilitat in vivo. Donada la importància de conèixer els metabòlits biològicament actius presents en fluids biològics i en teixits diana, l'objectiu principal de la tesi doctoral ha estat posar a punt i validar metodologies analítiques altament sensibles i específiques per a la identificació i quantificació del perfil metabòlic polifenòlic in vivo de 3 tipus de compostos fenòlics rellevants en la dieta (estilbens, flavanols i isoflavones) després d'un consum d'aliments rics en aquests polifenols, ja sigui mitjançant estudis clínics d'intervenció o amb animals d'experimentació. Es va validar un mètode sensible, específic, ràpid i reproduïble per a determinar i quantificar el perfil metabòlic del resveratrol, en diversos teixits biològics. Aquest mètode va permetre determinar tant els metabòlits glucuronidats i sulfatats del resveratrol, així com aquells originats a partir de la microbiota intestinal, com el dihidroresveratrol. L'aplicació de la metodologia a estudis clínics va permetre identificar i quantificar per primera vegada el resveratrol i els seus metabòlits glucuronidats i sulfatats en mostres de LDL de voluntaris a les 24h d'un consum puntual i moderat de vi negre. A més, es va determinar el perfil metabòlic del resveratrol amb els seus metabòlits glucuronidats i sulfatats en mostres d'orina de voluntaris amb un consum puntual i moderat de 250 ml de vi negre. Es va validar un mètode sensible, ràpid i reproduïble que permet l'anàlisi simultània d'un gran nombre de mostres per a determinar els àcids fenòlics que provenen de la microbiota intestinal després de la ingesta de cacau, a més de permetre identificar i quantificar l'epicatequina i la procianidina B2. Aquest mètode va permetre identificar altres compostos microbians que provenen de la degradació de l'epicatequina, com la 5-(3',4'- dihidroxifenil)-gamma-valerolactona i la (3-metoxi-4-hidroxifenil)-gamma-valerolactona. Aplicant la metodologia validada es va determinar un ampli espectre del metaboloma polifenòlic urinari de voluntaris o rates després del consum puntual i regular de cacau.Es va demostrar que les isoflavones es distribuïen irregularment en teixits d'ovella després del consum d'un mes de trèvol vermell amb una major acumulació en ronyó seguit del fetge, òrgans de reproducció, timus, cor, múscul i encèfal. A més a més, en un estudi en humans es van determinar els metabòlits glucuronidats de daidzeina i genisteina en pròstata de voluntaris amb hiperplàsia benigna de pròstata. / Epidemiologic studies have shown the importance of the consumption of diets rich in vegetables in the prevention of cardiovascular diseases, cancer and neurodegenerative diseases. These beneficial effects have been related to the existence of bioactive compounds in vegetables. Polyphenols are a bioactive group of phytochemicals with a possible role in the prevention of certain diseases. Nevertheless, to extrapolate these results and assess the physiological effects it is necessary to study its absorption, metabolism and excretion.The study of the bioavailability it is important to know the main metabolites in the organism, their distribution in tissues and in which concentrations are found in these tissues. Therefore, sensitive and specific techniques are required to study the metabolic profile of polyphenols and in which concentrations are present in biological fluids and in target tissues after the consumption of dietetic doses of polyphenols from foods.The main objective of the present PhD has been to optimize and validate highly sensitive and specific analytical methods for the identification and quantification of metabolic profile of polyphenols (stilbenes, flavanols and isoflavones) in tissues after consumption of polyphenol from foods in human clinical studies and studies in animals.A sensible, specific, rapid and reproducible analytical method has been validated through the simultaneous analysis of a large number of samples to determine the phenolic acids that come from the intestinal microbiota after cocoa ingestion, while additionally allowing the identification and quantification of epicatechin and procianidin B2. This method has allowed the identification of other microbial compounds that come from the degradation of epicatechin, like 5-(3', 4'-dihydroxyphenyl)gamma-valerolactone and (3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)-gamma-valerolactona. Applying the validated methodology has determined a wide spectrum of urinary polyphenolic metabolome in volunteers or rats after the regular consumption of cocoa.An irregular distribution of isoflavones has been demonstrated in sheep tissues with a major accumulation in the kidney, followed by the liver, reproductive organs, thymus, heart, muscles and brain. In addition the glucuronided metabolites of daidzein and genistein have been determined in the prostate of volunteers with benign prostatic hyperplasia.

L’objectiu d’aquest estudi va ser valorar el desenvolupament del nen durant el primer any de vida en funció del tipus de lactància realitzada durant el primer semestre y de la dosis de ferro administrada durant el segon semestre. Hem observat que el 75,5% dels nens realitzen lactància materna exclusiva al néixer y el 16,5% la mantenen fins als 6 mesos. El 39,5% tenen alguna mutació en el gen HFE. La prevalença de dèficit de ferro y anèmia ferropènica es del 4,5% y 2,5% als 6 mesos y del 9,2% y 1,2% als 12 mesos. La lactància materna durant els primers 6 mesos de vida augmenta l’índex de desenvolupament mental i psicomotor als 12 mesos. A més, la ingesta de llet fortificada amb dosis alta de ferro durant el segon semestre també augmenta l’índex de desenvolupament mental i proporciona menor percentatge de dèficit de ferro i d’anèmia ferropènica als 12 mesos. / El objetivo de este estudio fue valorar el desarrollo del niño durante el primer año de vida en función del tipo de lactancia realizada durante el primer semestre y de la dosis de hierro administrada durante el segundo semestre. El 75,5% realizan lactancia materna exclusiva al nacer y el 16,5% la mantienen hasta los 6 meses. El 39,5%tienen alguna mutación en el gen HFE. La prevalencia de déficit de hierroy anemia ferropénicaes del 4,5% y 2,5% a los 6 meses y del 9,2% y 1,2% a los 12 meses.La lactancia materna durante los primeros 6 meses de vida aumenta el índice de desarrollo mental y psicomotor a los 12 meses. Además, la ingesta de leche fortificada con dosis alta en hierro durante el segundo semestre también aumenta el índice de desarrollo mental y proporciona menor porcentaje de déficit de hierro y de anemia ferropénica a los 12 meses.

Durant el curs d'aquest treball s'han realitzat l'expressió de la lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) sota en control del promotor FLD1 en el llevat Pichia pastoris i s'ha desenvolupat una estratègia de cultiu en semi-discontinu lliure de metanol. En primer lloc es va realitzar la construcció d'un vector d'expressió que conté el gen de la ROL i el promotor FLD1. Aquest vector va ser subseqüentment transformat a P. pastoris. Els cultius en discontinu en bioreactor van revelar l'efecte sinèrgic del metanol i la metilamina com a substrats inductors sobre el promotor FLD1. A més, l'ús de sorbitol com a font de carboni, combinat amb la metilamina, ha resultat ser una combinació atractiva per evitar l'ús de metanol en cultius a altes densitats cel·lulars.En segon lloc es va desenvolupar una estratègia de cultiu en semi-discontinu fent servir sorbitol i metilamina com a fonts de carboni i nitrogen respectivament. Es van dur a terme tres cultius a diferents velocitats específiques de creixement, 0.005 h-1, 0.01 h-1, i 0.02 h-1. El nivell més alt de proteïna recombinant es va obtenir al cultiu realitzat a 0.02 h-1. Malgrat això la velocitat específica de producció a tots tres cultius es va disminuir després d'arribar a un màxim a prop de les 30 hores de cultiu. Per tal d'analitzar els potencials colls d'ampolla al procés de plegament i secreció, i la possible activació de la resposta a estres per proteïnes mal plegades (UPR) durant l'expressió de ROL, es van analitzar els nivell de la xaperona BiP, indicativa d'estres. També es van analitzar els nivells intracel·lulars de ROL. Es va utilitzar la immunofluorescència, combinada amb la citometria de flux per analitzar els nivells d'aquestes proteïnes. El increment dels nivells intracel·lulars de BiP i ROL durant la fase d'inducció dels cultius va indicar una possible activació de la resposta d'estres.Es va proposar una estratègia d'enginyeria metabòlica per tal alleujar els possibles colls d'ampolla en la via de plegament i secreció. El gen HAC1 de Saccaromyces cerevisiae es va clonar i expressar constitutivament a les cèl·lules de P. pastoris co-expressant ROL. El gen HAC1 codifica per un factor de transcripció el qual és responsable de l'activació del gens relacionats amb el UPR. Els resultats dels cultius amb les soques que expressen constitutivament el gen HAC1 van mostrar un increment en els nivells d'expressió de ROL, demostrant l'efecte positiu sobre el plegament i la secreció d'aquesta modificació. Per altra banda, una segona modificació es va realitzar per a millorar l'eficiència de secreció. El gen GAS1, el qual codifica per a una glycoproteïna ancorada a la membrana plasmàtica la qual realitza els unions entre els ?-glucans de la paret cel·lular va ser disruptat. La deleció d'aquest gen va provocar un canvi a la conformació de la paret cel·lular, fent-la més permeable al pas de proteïnes, fet que va resultar en un increment en els nivells de ROL extracel·lular. També es va dur a terme l'estudi dels nivells de transcripció de determinats gens de d'interès rellevant de P. pastoris. Concretament es van quantificar els nivells de transcripció del gen de l'alcohol oxidasa (AOX1), la formaldehid deshidrogenase (FLD1), la protein disulfide isomerase (PDI), la proteina BiP (gen KAR2), el 26S rRNA, i el gen de la proteïna ROL. Els nivells de transcripció d'aquests gens es van quantificar fent servir el sandwich hybridization assay basat en la immobilització específica dels mRNAs sobre esferes magnètiques i la seva posterior detecció mitjançant fluorimetria. La velocitat específica de producció va resultar ser un factor clau en els nivells de transcripció dels gens analitzats; a més, els resultats van aportar noves evidencies que l'expressió de ROL activa la resposta a estres. Finalment, amb l'objectiu de determinar la localització intracel·lular a P. pastoris del producte recombinant, el gen de la ROL es va fusionar amb el de la green fluorescent protein d'Aequorea victoria. En cultius en discontinu els nivells d'expressió de la proteïna de fusió van ser deu vegades inferiors als del cultiu control expressant solament ROL. A més, es va observar que la fluorescència d'un producte associat al creixement de P. pastoris, probablement la riboflavina, es superposava al senyal de la GFP al medi extracel·lular. Per altra banda es va observar una acumulació intracel·lular de la proteïna de fusió localitzada a l'espai periplasmàtic i dins de compartiments cel·lulars amb aparença vacuolar. Aquest estudi ha permès el desenvolupament i la millora del sistema d'expressió de P. pastoris basant-se en l'ús del promotor FLD1 com a alternativa al clàssic AOX1. / During the course of this work, the expression of a Rhizopus oryze lipase (ROL) under the control of the FLD1 promoter in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, as well as the development of methanol-free cultivation processes and metabolic engineering strategies for process improvement has been carried out. First, an expression vector containing the ROL gene and the FLD1 promoter from P. pastoris was constructed and subsequently transformed in P. pastoris. Bioreactor batch cultivations revealed the synergetic effect of methanol and methylamine on the FLD1 promoter induction. Moreover, the use of sorbitol as carbon source, combined with methylamine as nitrogen source, was found to be an attractive alternative to the use of methanol for high cell density cultivations. Second, a new fed-batch fermentation strategy was developed using sorbitol and methylamine as carbon and nitrogen source, respectively. Three fed-batches were performed at different specific growth rates, 0.005 h-1, 0.01 h-1, and 0.02 h-1. The specific growth rate was controlled during induction phase in the 0.005 h-1, 0.01 h-1 fermentations by implementing an exponential feeding rate at limiting substrate concentration. The highest lipase productivity was obtained in the fed-batch performed at the 0.02 h-1 specific growth rate. However, product production rate of all three fermentations dropped soon after reaching a maximum at about 30 hours of culture. Third, in order to analyze potential bottlenecks in the protein folding or secretion pathway and, in particular, the potential activation of the unfolded protein response (UPR) during ROL overexpression and intracellular accumulation, the levels of a reticle endoplasmatic-resident chaperone (BiP), its induction has been related to the activation of the UPR, as well as the intracellular levels of ROL were analyzed by immunofluorescence staining combined with flow cytometry. The increase of BiP and ROL levels during the induction phase of fed-batch cultivations indicated the possible activation of the UPR. Fourth, a metabolic engineering strategy was proposed to alleviate the supposed bottleneck in the folding and secretion pathway. The Saccharomyces cerevisiae HAC1 gene was cloned and constitutively expressed in P. pastoris co-expressing ROL. The HAC1 gene codifies for a transcriptional factor which activates the UPR related genes expression. The constitutively activation of the UPR was aimed at sustaining a better protein folding and secretion efficiency. Results from the HAC1-engineered strain showed an increase in the product expression, demonstrating the positive effect of such modification on protein folding and secretion.Besides, a transcriptional analysis of some bioprocess-relevant genes of the ROL-expressing P. pastoris strains was carried out. In particular, the alcohol oxidase 1 (AOX1), formaldehyde dehydrogenase (FLD1), protein disulfide isomerase (PDI), binding protein (KAR2), 26S rRNA and the recombinant product (ROL) mRNA levels were monitored in both shake flask and fed-batch cultivations. The mRNA levels of these genes were quantified by using a sandwich hybridization assay based on immobilization of the desired mRNA on magnetic beads and subsequent detection by a fluorescence-based technique. The specific growth rate showed to be a key factor in the transcriptional level of the analyzed genes; moreover, the results gave additional evidence to the hypothesis that ROL triggers the UPR. Fifth, a second genetic modification was carried out in order to improve the secretion efficiency of ROL. The P. pastoris GAS1 gene, which codifies for a glycoprotein anchored to the outer layer of the plasma membrane performing cross links between the cell wall ?-glucans, was disrupted. The deletion of this gene provoked a change in the cell wall conformation, causing an increase of the cell wall porosity and permeability, i.e. allowing for a better release of the recombine product. Finally, in order to gain further insights on the potential accumulation of the recombinant product, ROL gene was fused with the Aequorea victoria green fluorescence protein (GFP) gene and expressed in P. pastoris. In batch culture the expression of the ROL as a fusion protein caused an important decrease in the extracellular levels of the recombinant lipase activity when compared with the control. Also, the presence of growth-related product, probably riboflavin, was found to interfere with the extracellular GFP signal. Besides, an intracellular accumulation of the fusion protein was observed both in the cell's periplasm and in vacuolar-like compartments. Overall, this study has allowed the development and improvement of the P. pastoris expression system based on the formaldehyde deshydrogenase promoter as an alternative to the classic methanol inducible alcohol oxidase promoter.

Els nostres avantpassats conservaven la carn amb sal per tenir disponibilitat de productes carnis durant tot l’any. Les impureses en nitrat que aquesta sal contenia donaven lloc a un producte carni curat amb un color vermellós característic. Avui en dia se sap que el nitrat afegit a les carns es redueix a nitrit i aquest és el responsable del típic color de curat degut a la seva reacció amb la mioglobina. El nitrit també actua com antimicrobià i prevé front l'oxidació. Malgrat els efectes desitjables del nitrit, la seva utilització pot ser un problema de salut pública degut a la formació de nitrosamines. D’altra banda, la preocupació d’alguns consumidors cap als sistemes de producció intensiva, ha comportat el creixement del mercat de productes ecològics. Els consumidors conceben que aquests productes són més saludables i de major qualitat i alhora respecten el medi ambient i els animals. Per cobrir aquesta demanda la indústria càrnia produeix aquest tipus de productes. Tot i així, la producció de productes carnis curats sense nitrats o nitrits no és possible ja que els productes resultants tindrien un color poc agradable pel consumidor i s’augmentaria l’oxidació i el risc microbiològic. Per això, la Unió Europea ha establert uns límits màxims d’addició de NaNO3 o NaNO2 de 80 mg /kg i uns límits residuals màxims de NaNO3 o NaNO2 de 50 mg/kg, per a productes carnis curats ecològics fins que no es trobi un substitutiu d’aquests. Una alternativa a la utilització de nitrats i nitrits en forma d’additiu són les fonts naturals riques en nitrats. Els sucs o els concentrats vegetals són rics en nitrats, estan disponibles al mercat i poden ser usats en productes ecològics. Per això, semblen indicats per a l’elaboració de productes carnis curats. Degut a que aquestes fonts naturals contenen alts continguts de nitrats i no de nitrits, sembla apropiat usar-los conjuntament amb bacteris iniciadors de la fermentació amb activitat nitrat reductasa. Basat en aquests antecedents, l’objectiu d’aquesta tesi doctoral va ser avaluar la possibilitat de produir un producte carni curat utilitzant aquests concentrats vegetals com agent curant conjuntament amb l’ús de bacteris amb activitat nitrat reductasa. Concretament, es va elaborar un producte carni cru curat (llonganissa) per estudiar com afectava a la qualitat la menor concentració de nitrats i nitrits emprada en productes carnis ecològics. A més, es va valorar la utilització d’un concentrat d’api com a font natural de nitrats i la utilització d’un bacteri d’elevada activitat nitrat reductasa. També es va avaluar la inclusió d’aquests concentrats vegetals rics en nitrats en productes carnis curats i cuits (botifarra catalana) i les condicions de fermentació a les quals s’havien de sotmetre els bacteris iniciadors de la fermentació amb activitat nitrat reductasa per obtenir un producte de qualitat similar al curat convencional. Els resultats mostren que les concentracions de nitrats i nitrits permeses en productes ecològics no afecten a la qualitat del producte carni curat. A més, l’ús de concentrats vegetals rics en nitrats no només minimitza els processos oxidatius i produeix un color vermell similar als productes curats amb additius sinó que a més, són ben acceptats pels consumidors. Tot i així, especialment en productes curats cuits on les reaccions de curat succeeixen d’una forma ràpida, la inclusió d’un bacteri d’elevada activitat nitrat reductasa (Staphylococcus carnosus) és necessària per reduir ràpidament el nitrat a nitrit i produir les característiques de color que el consumidor desitja. A més amb aquests cultius s’aconsegueixen concentracions de nitrats residuals molt baixes. Com a conclusió, l’ús de concentrats vegetals en combinació amb Staphylococcus carnosus és una bona alternativa a l’ús d’additius per produir productes carnis curats de qualitat. / Nitrite is responsible for the fixation of cured meat color through its reaction with myoglobin. Moreover, it acts as an antimicrobial and helps to prevent oxidation. Despite these desirable effects of nitrite, the formation of carcinogenic nitrosamines from both nitrate and nitrite sources is a health concern. Nowadays, the market for organic food is growing rapidly. Although nitrite-free cured meat products have been produced, consumers dislike them because of the lack of color in the product. In addition, cured meat products without nitrite could mean also a poor microbiological quality and high oxidative status. An alternative to the addition of chemical grade nitrates or nitrites is the addition of natural sources containing nitrate and/or nitrite, such as vegetable juices or powders. The aim of this thesis was to assess the possibility of producing a cured meat product using a nitrate-rich vegetable concentrate and a starter culture with intense nitrate reductase activity following the standards for organic products. Results showed that the concentrations of nitrate and nitrite permitted in organic meat products seemed to do not affect meat product quality parameters. In addition, the use of vegetable concentrates rich in nitrate minimize oxidative processes and lead to similar redness in meat products in the same way than additives would do. Besides, these vegetables concentrates are well accepted by consumers. However, especially in cured-cooked products in which the curing reactions take place in a short period of time, a starter culture with intense nitrate reductase activity (Staphylococcus carnosus) is required to reduce nitrate to nitrite quickly. Moreover, the addition of this starter culture causes very low residual nitrate content. In conclusion, these results confirm that the use of vegetable concentrates together with the use of Staphylococcus carnosus in cured meat products are a good strategy as an alternative to additives to produce cured meat products with good quality characteristics.

Entender la influencia de la alimentación en la salud y enfermedades humanas es uno de los mayores objetivos de la nutrición moderna. La nutrimetabolómica se define como la disciplina “ómica” que estudia cómo afecta la dieta al conjunto del metaboloma; siendo propuesta como poderosa herramienta para explorar la relación entre nutrición y salud. Esta Tesis Doctoral tiene como objetivo principal contribuir en la identificación de biomarcadores nutricionales de consumo (biomarcadores de ingesta) así como su impacto en la salud (biomarcadores de efecto), y la huella metabólica que producen sobre el perfil urinario desde distintas aproximaciones metabolómicas mediante Resonancia Magnética Nuclear. Para la consecución de este objetivo se estudió el metaboloma desde la ingesta de diferentes componentes alimentarios (alimento, complemento alimenticio y patrones alimentarios). En el caso del estudio en un alimento se utilizó vino, vino desalcoholizado y ginebra para evaluar el efecto de la matriz alimentaria de las diferentes fracciones del alimento. El análisis del metaboloma mostró tanto metabolitos provenientes del food metabolome (tartrato, etanol, manitol), endógenos (3-metil-2-oxovalerato), y derivados de la acción de la microbiota intestinal (hipurato y 4-hidroxifenilacetato). En cuanto a la matriz alimentaria, se observó una posible interacción entre el alcohol y los biomarcadores relacionados con los metabolitos de la microbiota intestinal. Seguidamente, se propuso estudiar los biomarcadores de ingesta de un alimento, y para ello se detectaron en un estudio de intervención (vino) y se determinó el poder predictivo mediante la evaluación de su sensibilidad y especificidad. Se evaluaron de forma individual, observando finalmente que la combinación de dos de ellos (tartrato+etilglucurónido) ofrecía un mayor poder predictivo (área bajo la curva [AUC]:90.7%) que individualmente. Se realizó una validación en otra población (estudio observacional), viéndose una reproducibilidad de los resultados (AUC: 92.4%) con una alta sensibilidad (≥84%) y especificidad (>90%) en ambas poblaciones. Para evaluar sobre el fenotipo metabólico el efecto de una intervención con un alimento, se estratificó una población con alto riesgo cardiovascular atendiendo a sus parámetros clínicos. Se evaluó el efecto de la ingesta de polifenoles del vino en los clúster más discriminantes (“obesos y diabéticos” vs. “sanos con riesgo”). Se observó en el metaboloma un comportamiento diferencial para la excreción del 4-hidroxifenilacetato (microbiota intestinal) en el clúster que se clasificó como “obeso y diabético” frente al clúster “sano con riesgo”, exhibiéndose en los primeros una posible alteración de la microbiota intestinal después del consumo de vino. En la evaluación de los patrones alimentarios, se analizó el perfil metabólico de una población al inicio, 1 año y 3 años de seguimiento de un patrón de Dieta Mediterránea (MD) suplementada con aceite de oliva/nueces frente a una dieta baja en grasa. Se detectaron varios metabolitos endógenos relacionados con el metabolismo energético (glucólisis, ciclo de los ácidos tricarboxílicos, β-oxidación), derivados de la microbiota, así como también del food metabolome. Asimismo, se pudo asociar ciertos metabolitos con patrones de dieta, viéndose asociadas las dos MD a un mayor consumo de vegetales, mientras que la dieta baja en grasa presentaba una mayor asociación al consumo de carne roja. En la evaluación del impacto en la salud, se administró un complemento alimenticio (probiótico) a mujeres lactantes con mastitis y se observó una mejoría y una reducción del estado inflamatorio (seguimiento médico), lo que provocó una deserción voluntaria de fármacos (ibuprofeno y paracetamol), hecho que se reflejó en el metaboloma urinario. También se vio un aumento en la excreción de creatina y de metabolitos derivados de la microbiota intestinal (hipurato y trimetilamina-N-óxido). Esta Tesis Doctoral presenta diferentes estrategias nutrimetabolómicas para el desarrollo y estudio de biomarcadores nutricionales y su impacto en la salud. / Understanding the link between nutrition and health is one of the major goals of modern nutrition. Nutrimetabolomics is an “omics” science that studies the effect of diet through the metabolome. It is a powerful tool for exploring the relationship between nutrition and health. The aim of this PhD thesis is to contribute to the identification of biomarkers related to food consumption (biomarkers of intake) and their impact on health (biomarkers of effect). To achieve this goal, the human metabolome was studied by nuclear magnetic resonance (NMR) after the intake of different food components (food, supplements and dietary patterns). Wine, dealcoholized wine and gin were used to evaluate the food matrix effect. Results showed metabolites from the food metabolome, endogenous and gut microbiota, pointing to a potential interaction between alcohol and gut microbiota. To study food exposure biomarkers, the predictive power in the wine interventional study concluded that a model combining two biomarkers (tartrate+ethyl glucuronide) has greater predictive power than the individual markers. Reproducible results also were shown in epidemiological data (AUC>90%). Furthermore, high cardiovascular risk individuals were stratified based on their clinical parameters. The effect of wine polyphenols intake in the metabolic phenotype for the two most discriminant clusters (“obese-diabetics” vs. “healthier”) was evaluated, and different excretion of gut microbiota metabolite 4-hydroxyphenylacetate was observed. Concerning the dietary patterns, the metabolic footprint after 3-years follow-up with Mediterranean diet vs. low-fat pattern was analyzed. Several metabolites (i.e. energy pathway-metabolites), and dietary patterns association with certain metabolites were also observed. To assess the impact on health, a probiotic supplement was administered to breastfeeding women with mastitis. The reduction of inflammation (medical test) and voluntary desertion of pharmacological drugs was revealed in the urinary metabolome. This Doctoral Thesis presents different nutrimetabolomics strategies to study nutritional biomarkers and improve the understanding of their impact on human health.

La composición de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (AGPI-CL) en los tejidos humanos es esencial para mantener las funciones metabólicas y la salud. Diferentes patologías, incluidas las enfermedades atópicas, han sido relacionadas con los niveles de AGPI-CL. Además de la dieta, un factor que influye en la composición de los AGPI-CL en los tejidos humanos es la síntesis de novo de los mismos. En este proceso, los AGPI-CL son sintetizados a partir de AG esenciales a través de diferentes etapas de desaturación y elongación. Las enzimas que participan son las desaturasas: Δ5-desaturasa (D5D, codificada por el gen FADS1) y Δ6-desaturasa (D6D, codificada por el gen FADS2), y las elongasas: Elongasa-2 (codificada por el gen ELOVL2) y Elongasa-5 (codificada por el gen ELOVL5). Por otro lado, existe un escaso conocimiento sobre la relación de los ácidos grasos trans (AGT) con el desarrollo de las enfermedades atópicas. Se ha sugerido que los AGT pueden modificar el metabolismo de los AGPI-CL, teniendo efectos beneficiosos los AGT procedentes de fuentes naturales [ácido t-vaccénico (VA) y ácido ruménico (RA)] respecto a los AGT de fuentes industriales [ácido elaídico (ELA)]. El objetivo principal de esta tesis fue investigar sí la composición plasmática de AG, durante la vida fetal y postnatal, afecta al desarrollo de las enfermedades atópicas en los niños. En base al Proyecto INMA de la Cohorte de Sabadell (Cataluña, España) los resultados más importantes son: Desarrollo del método que nos permitió identificar, separar y cuantificar los AG de los fosfolípidos plasmáticos y de la leche materna, especialmente los AGT (ELA, VA y RA). Se usaron placas de extracción en fase sólida (SPE) de 96 pocillos para las muestras de plasma, y se optimizó la cantidad de muestra para la leche materna. Una adecuada precisión y recuperación garantizan la validez del método. Pudimos observar que durante el primer trimestre del embarazo, niveles de ELA se correlacionan negativamente con los AGPI-CL n-3, mientras que niveles altos de ácido ruménico ayudan a una mejor metabolización de los AGPI-CL en el plasma materno. Una exposición temprana del feto a altos niveles de VA puede tener un efecto protector frente al desarrollo del eczema atópico en el primer año de vida. Además, se observó que bajos niveles de AGLP-CL n-3, especialmente EPA y DHA en el plasma del cordón umbilical están asociados con el aumento del riesgo de eczema atópico en el primer año de vida. También, bajos niveles de la suma total de AGPI-CL fueron encontrados en el plasma de madres alérgicas, lo que nos indica que la dieta durante el embarazo junto con la transferencia de los AG al feto juega un papel crítico en el desarrollo de la enfermedad. Por otro lado, se encontró que las variantes genéticas de los genes que codifican a las desaturasas y elongasas, FADS y ELOVL, en las madres y los niños determinan la composición de AG en el nacimiento y están asociadas con el desarrollo de eczema atópico y sibilancias. Finalmente, se observó que los niños de 4 años de edad con eczema atópico tienen una baja expresión de los genes FADS2 y ELOVL5. Además, se pudo comprobar que los niveles de DGLA y la actividad enzimática de la D6D están directamente influidos por los cambios de expresión del gen FADS2. En resumen, los resultados presentados en esta tesis sostienen la hipótesis de que existe una relación causal entre los ácidos grasos plasmáticos de la madre y el niño y el desarrollo de enfermedades atópicas como el eczema atópico, y que además las variantes genéticas de madre e hijo, juegan un papel crucial en la evolución de la enfermedad. / This thesis has been focused on the study of the TFA [elaidic (ELA), t-vaccenic (VA) and rumenic acid (RA)] and LC-PUFAS plasmatic composition, during fetal and postnatal life and its relation with the development of atopic diseases during childhood. An efficient fast gas chromatographic method for simultaneous determination of EA, VA and RA contents in human plasma phospholipids and human milk was optimized and validated. The study of the plasmatic levels of specific TFA in maternal plasma shows that EA correlated negatively with n-3 LC-PUFAs (EPA and DHA) and RA positively with both n-3 and n-6 LC-PUFAs in maternal plasma. Regarding to atopic diseases, high VA concentrations in maternal plasma may protect offspring against atopic eczema in infancy. Thus the FA status of the fetus during pregnancy has an important role in the development of atopic eczema in early childhood. The prevalence of this atopic disorder is related to lower cord blood plasma levels of FA belonging to n-3 series, especially DHA. The conversion of essential fatty acids to longer chain, biological active metabolites is regulated by the enzymes desaturases [5-desaturase (D5D) and 6-desaturase (D6D) encoded by genes FADS1 and FADS2, respectively] and elongases (Elongase 2 and Elongase5 encoded by genes ELOVL2 and ELOVL5, respectively). In this study we have verified that mother and child genetic variation in FADS and ELOVL genes determines FA composition at birth and is associated with the risk of developing atopic eczema and wheeze in early childhood. Moreover, we observed that changes in the mRNA-expression levels of FADS1 and 2 directly affect blood DGLA levels and D6D activity. Finally, this study suggests that low mRNA-expressions of FADS2 and ELOVL5 are associated with high risk of atopic eczema in childhood. In summary, the results presented in this thesis support the hypothesis that there is a causal relationship between plasma fatty acids composition of the mother and child and the development of atopic diseases such as atopic eczema, and additionally, that genetic variants of both mother and child play a crucial role in the evolution of the disease.

La malnutrició pot ser causada per una dieta pobra i/o per estats patològics que afectin la correcta assimilació dels nutrients. En països en vies de desenvolupament però també en països industrialitzats, la malnutrició sovint va de la mà amb la fam, i cada cop més, acompanyada d’un augment del consum de dietes riques en calories de baix cost i pobres en nutrients. Aquestes dietes són reflex del progrés en l’agricultura i en les tecnologies de processament d’aliments que contribueixen a reduir els continguts de micronutrients dels aliments, cosa que afavoreix tan a la malnutrició com a l’obesitat, i agreuja diverses malalties cròniques com les malalties cardiovasculars, diabetis i càncer. Les llavors de panís no produeixen nivells alts de carotens, que poden ser fonts de vitamina A i tenir efecte antioxidant . La biofortificació a través de l’enginyeria genètica és una estratègia cost-efectiva per millorar el contingut nutricional del panís; no obstant això, la seva elaboració requereix d'una avaluació de riscs obligatòria com a component integral del procés d'aprovació prèvia a la comercialització. Així doncs, es va avaluar la seguretat d’un panís genèticament millorat per augmentar el seu contingut en carotens (High-carotenoid corn) mitjançant un estudi de toxicitat subcrònica de 90 dies en ratolins. No es van trobar evidències de toxicitat quan es va comparar amb ratolins alimentats amb una dieta control (basada en un panís no modificat anomenat M37W). Un cop establerta la seguretat del panís, es va administrar una dieta basada en el panís genèticament millorat a ratolins model de càncer de còlon associat a colitis, a ratolins model d’obesitat i resistència a la insulina induïdes a través d’una dieta amb alt contingut en greixos, i finalment, a una línia de ratolí heterozigot per l’homòleg de fosfatasa i tensina (PTEN+/-) com a model de neoplàsia en múltiples òrgans i de malaltia hepàtica. Aquests experiments mostren que la varietat de panís enriquit en carotens presenta un efecte quimioprotector i també efectes prometedors en la promoció de la salut en paràmetres de risc relacionats amb la síndrome metabòlica i la sensibilitat a la insulina. / La malnutrición puede ser causada por una dieta pobre y/o por estados patológicos que afecten a la correcta asimilación de los nutrientes. En países en vías de desarrollo pero también en países industrializados, la malnutrición a menudo va de la mano del hambre, y cada vez más, acompañada de un aumento del consumo de dietas altas en calorías de bajo coste y pobres en nutrientes. Estas dietas son reflejo del progreso en la agricultura y en las tecnologías de procesado de alimentos que contribuyen a la reducción de los contenidos de micronutrientes de los alimentos, hecho que favorece tanto a la malnutrición como a la obesidad, y agrava diferentes enfermedades crónicas como las enfermedades cardiovasculares, diabetes y cáncer. Las semillas de maíz no producen niveles altos de carotenos, que pueden ser fuente de vitamina A y tener efecto antioxidante. La biofortificación a través de la ingeniería genética es una estrategia costo-efectiva para mejorar el contenido nutricional del maíz; sin embargo, su elaboración requiere una evaluación de riesgos obligatoria como componente integral para un proceso de aprobación previa a la comercialización. Así pues, se evaluó la seguridad de un maíz genéticamente mejorado para aumentar su contenido de carotenos (High-carotenoid corn) mediante un estudio de toxicidad subcrónica de 90 días en ratones. No se encontraron evidencias de toxicidad cuando se comparó con ratones alimentados con una dieta control (basada en maíz no modificado llamado M37W). Una vez establecida la seguridad del maíz, se administró una dieta basada en maíz genéticamente mejorado a ratones modelos de cáncer de colon asociado a colitis, a ratones modelo de obesidad y resistencia a la insulina inducidas a través de una dieta con un alto contenido en grasa, y finalmente, a una línea de ratones heterocigotos por el homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN+/-) como modelo de neoplasia en múltiples órganos y de enfermedad hepática. Los experimentos muestran que la variedad de maíz enriquecido con carotenos presenta un efecto quimioprotector y también efectos prometedores en la promoción de la salud en parámetros de riesgo relacionados con el síndrome metabólico y la sensibilidad a la insulina. / Malnutrition can be caused by a poor diet and/or by medical conditions that affect nutrient assimilation. In developing but also in industrialised countries, malnutrition often goes hand in hand with hunger, but increasingly results from the consumption of inexpensive, calorie-rich but nutrient-poor diets. Such diets reflect developments in agriculture and food processing technology that reduce the micronutrient content of foods, contributing to both malnutrition and obesity, and exacerbating many chronic diseases including cardiovascular disease, diabetes and cancer. Corn grains do not produce high levels of carotenoids, which can be a source of vitamin A and can act as antioxidants. Biofortification by genetic engineering is a cost-effective strategy to improve the nutrient content of crops, but their development requires a mandatory risk assessment as an integral component of approval process prior to commercialization. The safety of a carotenoid-enriched engineered corn variety (High-carotenoid corn) was therefore evaluated in a 90-day subchronic toxicity study in mice. This showed no evidence of toxicity compared to mice fed on control diet (based on near-isogenic unmodified M37W corn). Having established safety, diets based on the engineered corn were fed to a mouse cancer model associated with induced colitis, a mouse obesity and insulin resistance model developed by initial feeding on a high-fat diet, and finally a heterozygous phosphatase and tensin homolog knockout mouse line (PTEN+/-) as a model of multiple-organ neoplasia and liver disease. These experiments showed that the carotenoid-enriched corn variety was chemopreventive and also induced promising health-promoting effects on risk parameters related to metabolic syndrome and insulin sensitivity.

The present doctoral dissertation deals with the study of the effect of food preservation technologies, such as high pressure (HP) treatments and biopreservation with nisin, on the behaviour of Listeria monocytogenes during the shelf-life of ready-to-eat (RTE) cured and cooked meat products. Several challenge tests were designed and performed through a product-oriented approach and results were mathematically modelled. In cured meat products such as cured ham, an HP treatment was combined with nisin applied directly on the product surface or through interleavers (i.e. active packaging) to assess the effectiveness against Listeria monocytogenes during the product shelf-life.Regarding cooked meat products, besides quantifying and modelling the immediate HP-inactivation of L. monocytogenes, the pathogen behaviour after HP and during the refrigerated storage (between 4 and 12ºC) was also characterised / El treball tracta de l’estudi de l’efecte de diferents tractaments de conservació dels aliments, altes pressions (HP) i/o l’addició de bacteriocines, en el comportament de Listeria monocytogenes durant la vida útil de dues tipologies diferents de productes carnis llestos per al consum (RTE), crus-curats i cuits. Per a tal fi es van realitzar diversos challenge tests, amb un enfoc orientat a producte, que van permetre tractar els resultats obtinguts mitjançant la modelització matemàtica. En pernil curat es va avaluar l’efecte d’un tractament per HP sol o combinat amb nisina (aplicació directa o mitjançant envasat actiu) vers Listeria monocytogenes, durant la vida útil del producte. En productes cuits es va quantificar i modelitzar la cinètica d’inactivació per HP de Listeria monocytogenes obtenint un model predictiu d’inactivació per HP, i posteriorment es va caracteritzar el comportament del patogen després del tractament per HP i durant l’emmagatzematge en refrigeració a diferents temperatures

Segons la Organització Mundial de la Salut (OMS), més d’un quart de la població mundial pateix algun tipus de malaltia relacionada amb el sistema circulatori. Actualment, les malalties cardiovasculars (CV) són la principal causa de mort i discapacitat en els països desenvolupats. Només a Espanya, l’any 2012, les malalties del sistema circulatori van causar 122.097 morts, que representen un 33.3% del total de defuncions. La prevenció, més que el tractament, és una prioritat màxima per les agències de salut pública, que s’esforcen per sensibilitzar a la població amb l’objectiu de trencar aquesta tendència. El nostre paper com a investigadors en el camp de la salut és estudiar els factors de risc d’aquestes malalties i buscar la manera de reduir-los, per exemple, amb un canvi d’estil de vida i de dieta. La dieta mediterrània (DM) i altres dietes riques en fruites i hortalisses s’han considerat una bona manera de reduir la majoria de factors de risc de malalties CV ja que són riques en components bioactius, vitamines i minerals, fibra, i àcids grassos mono i poliinsaturats. En aquest estudi ens hem focalitzat en els polifenols, un grup de compostos que ens aporten la major part d’antioxidant de la dieta i que s’ha demostrat que tenen efectes beneficiosos per a la salut ja que milloren alguns factors de risc com ara l’aterosclerosi, la resistència a la insulina, els biomarcadors d’inflamació, o la pressió arterial, entre d’altres. Els polifenols són un grup de compostos molt heterogeni i nombrós: hi ha centenars de molècules descrites en diferents aliments i begudes. Aquesta varietat és un problema a l’hora d’estudiar-ne l’efecte, la biodisponibilitat o els mecanismes que expliquen els seus beneficis i, sovint, s’opta per escollir només un polifenol o un grup reduït de polifenols i estudiar-lo amb detall. No obstant, això impedeix tenir una visió global i els grups de polifenols més minoritaris han quedat sistemàticament exclosos dels estudis. Així doncs, aquest treball pretén, en primer lloc, estimar el contingut de polifenols totals ingerits a través de la dieta en la població espanyola de l’estudi PREDIMED (PRevención con DIeta MEDiterránea) i valorar l’associació d’aquests amb el risc de patir una malaltia CV i el risc de mortalitat. Els qüestionaris de freqüència de consum (QFC) són una eina àmpliament utilitzada en estudis nutricionals. No obstant, els biomarcadors nutricionals són un bon complement ja que cobreixen les limitacions pròpies dels qüestionaris. Aquesta tesi fa una revisió dels últims avenços en biomarcadors de consum de polifenols i s'explica un mètode colorimètric ràpid i senzill, adaptat del mètode de Folin-Ciocalteu (F-C), per determinar polifenols en orina. La hipertensió és un dels factors de risc CV més freqüents i estudiats. Es coneix que la ingesta d'aliments rics en polifenols pot ajudar a disminuir la pressió arterial (PA) i per tant, evitar un d’aquests factors de risc. En aquesta tesi es revisen les últimes evidències sobre la influència dels polifenols sobre la PA i els mecanismes d'acció que explicarien aquest efecte. Aquests coneixements s'han aplicat en la població PREDIMED per demostrar que, efectivament, la disminució de la PA està mediada per l’increment dels nivells d’òxid nítric (NO) en plasma. Les begudes alcohòliques han estat tradicionalment una font de conflicte quan es tracta d’establir recomanacions nutricionals o dietètiques, ja que la línia entre el benefici i el risc és molt fina i els efectes dels excessos d’alcohol han suposat una mala publicitat per al sector. Volíem doncs, aportar més informació sobre el consum, sempre moderat, de vi i la síndrome metabòlica, un desordre metabòlic que resulta de la combinació dels principals factors de risc CV: obesitat, hipertensió, dislipèmia i hiperglucèmia. / According to the World Health Organization (WHO), more than a quarter of the world’s population suffers from a circulatory system-related disease. Nowadays, cardiovascular (CV) diseases are the leading cause of mortality and disability in developed countries. Our role as researchers is to study the risk factors of these diseases and how to reduce them. In this study, we focused on polyphenols, a large and heterogeneous group of compounds with proven benefits for our health. Such variety becomes a problem when studying their effects. This is the reason why usually only one polyphenol or a group of polyphenols is chosen to study in detail. However, this does not allow a global view and minor polyphenol groups have been systematically excluded from the studies. Therefore, this thesis aims, firstly, to estimate the total intake of polyphenols in the Spanish PREDIMED (PRevención con DIeta MEDiterránea) population and to evaluate the association of dietary polyphenols with a lower risk of CV disease or mortality. Food Frequency Questionnaires (FFQ) are widely used in nutritional studies. However, nutritional biomarkers are good complements because they cover the limitations of FFQ. This thesis reviews recent evidences on biomarkers of polyphenol intake. Moreover, a new, fast and simple method to determine polyphenols in urine is explained. This method was an adaptation of the colorimetric Folin-Ciocalteu (F-C) method. Hypertension is a very frequent and much studied CV risk factor. It is known that consumption of polyphenol-rich foods helps to decrease blood pressure (BP). We reviewed the last evidences about the influence of polyphenols on BP and the mechanisms of action that explain this effect. This knowledge has been applied to the PREDIMED population to demonstrate that, indeed, the BP decrease was mediated by the increase in plasma nitric oxide (NO). Alcoholic beverages have traditionally been a source of conflict when it comes to establishing dietary recommendations, since the consequences of excessive alcohol intake create a bad image for the products. Therefore, our aim was to provide more information about moderate wine consumption and metabolic syndrome, a disorder arising from a combination of the main CV risk factors: obesity, hypertension, dyslipidaemia and hyperglycaemia.