Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-13T18:08:23Z No. of bitstreams: 1 carolinedesouzaalmeida.pdf: 1716960 bytes, checksum: 4e2f5cb727250f9b08b6d1633c2a22dc (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-10-22T12:58:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carolinedesouzaalmeida.pdf: 1716960 bytes, checksum: 4e2f5cb727250f9b08b6d1633c2a22dc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-22T12:58:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carolinedesouzaalmeida.pdf: 1716960 bytes, checksum: 4e2f5cb727250f9b08b6d1633c2a22dc (MD5) Previous issue date: 2008-04-11 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Um terço da população mundial está infectada com o Mycobacterium tuberculosis. Novos métodos de diagnóstico e a vacinação contra tuberculose (TB) são necessários para o controle da doença. A resposta imunológica contra o M. tuberculosis envolve a produção de várias citocinas e quimiocinas, porém suas interações durante a infecção são bastante complexas. O presente trabalho teve como objetivo o estudo da produção de citocinas e quimiocinas durante a tuberculose pulmonar, frente a estímulos de antígenos do M. tuberculosis. Através do método citométrico de esferas ordenadas (CBA-Cytometric Bead Array) foi possível avaliar os níveis plasmáticos das quimiocinas MIG, IP-10, IL-8, RANTES e MCP-1 em pacientes com tuberculose ativa não tratada (TBA), em pacientes sob tratamento (TBST), em pacientes tratados (TBT) e em indivíduos controles sadios (CS). Utilizando esse mesmo método também foi realizada a mensuração das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-10 e IL-4 e das quimiocinas MIG, IP-10, IL-8, RANTES e MCP-1, produzidas em cultura de células mononucleares do sangue periférico após estímulo com os antígenos ESAT-6/CFP-10 e 16kDa, nos grupos de pacientes com tuberculose ativa não tratada (TBA), de pacientes tratados (TBT), de indivíduos controles sadios (CS) e de indivíduos contatos de pacientes com tuberculose (CT). As quimiocinas plasmáticas MIG, IP-10 e IL-8 estavam elevadas no grupo TBA, em comparação aos demais grupos (CS, TBST e TBT); e ainda os níveis das quimiocinas analisadas no plasma diminuíram após o início do tratamento. Nos ensaios “in vitro” com PBMC humanas, as citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2 e as quimiocinas MIG, IP-10, IL-8 e RANTES foram estimuladas em níveis maiores, pelo ESAT-6/CFP-10, nos grupos TBA e CT em relação aos controles e pacientes tratados, enquanto que o estímulo com antígeno 16kDa não permitiu diferenciar entre os grupos estudados quanto a produção dessas citocinas e quimiocinas. Já as citocinas IL-10 e IL-4 e a quimiocina MCP-1 apresentaram níveis elevados nas culturas de PBMC de indivíduos controles e contatos quando estimuladas com os antígenos do M. tuberculosis estudados em relação aos pacientes com tuberculose. O antígeno ESAT-6/CFP-10 diferenciou a tuberculose ativa quanto à produção das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-6 e IL-2, e das quimiocinas MIG, IP-10, IL-8 e RANTES, as quais podem contribuir para uma resposta protetora na tuberculose. O antígeno 16kDa se mostrou um forte estimulador de IL-10 e MCP1, moléculas que podem atuar como reguladoras ou inibidoras da resposta imunológica contra a infecção por M. tuberculosis, sugerindo o papel importante deste antígeno em favorecer a persistência do bacilo no hospedeiro. Os níveis de quimiocinas plasmáticas podem ser eficazes em diferenciar os pacientes com tuberculose ativa de indivíduos controles e ainda pode ser útil em monitorar o efeito do tratamento quimioterápico anti-tuberculose. O entendimento da dinâmica resposta imunológica contra antígenos do M. tuberculosis pode auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias de combate à tuberculose. / One-third of the world's population is currently infected with Mycobacterium tuberculosis. The development of new methods of diagnosis and vaccines against tuberculosis (TB) are necessary for disease control. The immune response against M. tuberculosis involves the production of many cytokines and chemokines, but their interaction during the infection is complex. The objective of this work was to study the production of cytokines and chemokines in pulmonary TB under stimulation of M. tuberculosis antigens. The method of Cytometric Bead Array (CBA) was used to evaluate plasma levels of chemokines MIG, IP-10, IL-8, MCP-1 and RANTES in untreated patients with active TB (ATB), in patients during treatment (DTB) and in treated patients (TTB) and healthy controls individuals (HC). We also evaluated, by CBA, the levels of cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-10 and IL-4, and chemokines MIG, IP-10, IL-8, MCP-1 and RANTES, in culture of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) after stimulation with the antigens ESAT-6/CFP-10 and 16kDa, in groups of untreated patients with active TB (ATB), in treated patients (TTB), healthy controls individuals (HC) and in contact individuals of patients with TB (CT). The production of plasma chemokines, the levels of MIG, IP-10 and IL-8 were higher in the group ATB, compared to the other (HC, DTB and TTB), and the levels of chemokines analyzed in plasma decreased after the beginning of the treatment. In assays with human PBMC, the cytokine IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2 and chemokines MIG, IP-10, IL-8 and RANTES were stimulated at higher levels, by the fusion protein ESAT-6 / CFP-10, in groups ATB and CT in relation to the controls and treated patients. The stimulation with antigen 16kDa did not allow for differentiation of these cytokines and chemokines between the groups. IL-10, IL-4 and MCP-1 showed high levels in the cultures of PBMC from healthy control individuals and contacts when stimulated with the studied M. tuberculosis antigens compared to patients with TB. The antigen ESAT-6/CFP-10 differentiated active TB with regard to the production of cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-6 and IL-2 and chemokines MIG, IP-10, IL-8 and RANTES, which can contribute to a protective response in TB. The antigen 16kDa was a strong stimulator of IL-4, IL-10 and MCP-1 molecules that can regulate or inhibit the immune response against M. tuberculosis infection, demonstrating the important role of this antigen in promoting the persistence of the bacillus in the host. The plasma levels of chemokines can be effective in differentiating patients with active TB from the healthy control individuals, and can also be useful in monitoring the effect of anti-TB chemotherapy. The comprehension of the dynamics of the immune response against M. tuberculosis antigens can aid the development of new strategies to combat tuberculosis.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-03-16T19:41:01Z No. of bitstreams: 1 anamarciamenezesdemattos.pdf: 1900352 bytes, checksum: 4c5592f85b3e69efcd500c09d135cdcd (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-03-18T11:49:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 anamarciamenezesdemattos.pdf: 1900352 bytes, checksum: 4c5592f85b3e69efcd500c09d135cdcd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-18T11:49:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 anamarciamenezesdemattos.pdf: 1900352 bytes, checksum: 4c5592f85b3e69efcd500c09d135cdcd (MD5) Previous issue date: 2016-11-10 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A tuberculose (TB) permanece como um dos maiores problemas de saúde pública no mundo. A identificação de novos antígenos de Mycobacterium tuberculosis e de biomarcadores de infecção, capazes de auxiliar no diagnóstico da doença ativa e da infecção latente são metas importantes para o controle da TB. No presente trabalho foram estudados pacientes TB antes e após receberem o tratamento, e indivíduos contatos TB com diagnóstico de infecção latente (PPD+). Foram investigados os níveis séricos de IgG e IgG1 e a produção de citocinas e quimiocinas contra os seguintes antígenos: 1) antígenos da fase de infecção ativa (ESAT-6/CFP-10, Rv0717 e Rv3353); 2) infecção latente ou DosR (Rv1733, Rv2628, Rv2029 e Rv1737); e, 3) antígenos da fase de reativação da infecção ou Rpf (Rv0867 e Rv2389). A produção de IFN-ꝩ, TNF-α,IL-17, IL-10 e IL-4 foi avaliada em culturas de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) estimuladas com antígenos do M. tuberculosis, através de ELISA e/ou CBA-citometria. Níveis séricos de CCL-2, CXCL-8, CXCL-9 e CXCL10 foram mensurados em pacientes TB e controles. Nossos resultados mostram níveis séricos elevados de anticorpos IgG1 contra ESAT-6/CFP-10, Rv0717, Rv3353, Rv1733, Rv2029, Rv2628 e Rv0867 em pacientes com TB ativa em comparação ao grupo controle (p<0.001). Após completada a quimioterapia, a resposta de IgG1 frente aos antígenos ESAT-6/CFP-10, Rv3353, Rv2628, Rv2029, e Rv0867 foi reduzida a níveis de controle (p<0,01). A análise da curva ROC confirmou o bom desempenho dos antígenos Rv0717, Rv1733, Rv3353, Rv2628, Rv2029 e Rv0867 no diagnóstico da TB. Interessantemente, Rv0717 e Rv1733 induziram um pico de resposta de IgG1 após 1-3 meses de quimioterapia (p<0,01). Neste grupo de pacientes (1-3M), uma alta produção de IFN-ꝩ e TNF-α foi observada após estimulação de PBMC com ESAT6/CFP-10, Rv1733 e Rv2029. Os grupos não diferiram na produção de IL-17, IL-10 e IL-4, indicando uma predominante resposta com perfil Th1 nos pacientes estudados. Níveis elevados de CXCL-8, CXCL-9 e CXCL-10 foram detectados no soro de pacientes com TB ativa. Após 6 meses de tratamento os níveis séricos de CXCL-9 e CXCL-10 foram reduzidos a níveis de controle. Níveis séricos elevados de anticorpos IgG e IgG1 específicos para os antígenos ESAT-6/CFP-10 e Rv1733 foram observados em pacientes com TB ativa e em contatos TB, em comparação com o grupo controle (p< 0,05). De forma semelhante, pacientes TB e contatos TB também não diferiram quanto a produção de IFN-ꝩ em resposta ao antígeno ESAT-6/CFP-10, indicando haver dificuldade em diferenciar pacientes com TB ativa de indivíduos com TB latente. Interessantemente, em resposta ao antígeno DosR Rv1733, níveis elevados de IFN-ꝩ foram observados nas culturas de PBMC dos contatos TB, em comparação aos grupos TB ativa e controle sadio (p<0,05). Em conjunto, esses resultados sugerem a existência de biomarcadores da tuberculose, representados por: 1) detecção de níveis elevados de anticorpos IgG1 contra ESAT-6/CFP-10, Rv0717, Rv3353, Rv1733, Rv2628, Rv2029 e Rv0867; 2) alta produção de IFN-ꝩ e TNF-α em resposta a diferentes antígenos do M. tuberculosis; e, 3) níveis séricos aumentados de CXCL-9 e CXCL-10. Esse perfil de resposta imune pode auxiliar no diagnóstico da TB e no monitoramento do tratamento. Além disso, a detecção de níveis elevados de IFN-ꝩ em resposta ao antígeno Rv1733 pode contribuir no diagnóstico da doença em contatos TB que apresentam tuberculose assintomática. / Tuberculosis (TB) remains a major public health problem in the world. The identification of new Mycobacterium tuberculosis antigens and infection biomarkers capable of assisting in the diagnosis of active disease and latent infection are important targets for TB control. In the present study, TB patients before and after receiving treatment and contacts TB diagnosed with latent infection (PPD +), were studied. We investigated the levels of serum IgG and IgG1 and the production of cytokines and chemokines against the following antigens: 1) antigens from the active phase of infection (ESAT-6/CFP-10, Rv0717 and Rv3353); 2) latent infection antigens or DosR (Rv1733, Rv2628, Rv2029 and Rv1737); and 3) antigens from the reactivation phase of infection or Rpf (Rv0867 and Rv2389). The production of IFN-ꝩ, TNF-α, IL-17, IL-10 and IL-4 was evaluated in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) cultures stimulated with M. tuberculosis antigens, by using ELISA and/or CBA-cytometry. Serum levels of CCL-2, CXCL-8, CXCL-9 and CXCL-10 were measured in TB patients and controls. Our results show elevated serum levels of IgG1 antibodies against ESAT6/CFP-10, Rv0717, Rv3353, Rv1733, Rv2628, Rv2029 and Rv0867 in patients with active TB, in comparison with the control group (p<0.001). After completion of the chemotherapy, the IgG1 response to ESAT-6/CFP-10, Rv3353, Rv2628, Rv2029 and Rv0867 was reduced to control levels (p <0.01). The ROC curve analysis confirmed the good performance of Rv0717, Rv3353, Rv1733, Rv2628, Rv2029 and Rv0867, and antigens in the diagnosis of TB. Interestingly, Rv0717 and Rv1733 induced an IgG1 peak response after 1-3 months of chemotherapy (p<0.01). In this patient group (1-3m), a high IFN-ꝩ and TNF-α response was observed after stimulation of PBMC with ESAT-6/CFP-10, Rv1733 and Rv2029. The groups did not differ in IL-17, IL-10 and IL4, indicating a predominant Th1 response in the patients studied. High levels of CXCL8, CXCL-9 and CXCL-10 were detected in the serum of patients with active TB. After 6 months of treatment, levels of both CXCL-9 and CXCL-10 were reduced to control levels. Elevated serum levels of IgG and IgG1 specific for both ESAT-6/CFP-10 and Rv1733 were observed in patients with active TB and in TB contacts, in comparison with the control group (p<0.05). Similarly, TB patients and TB contacts also did not differ in the production of IFN-ꝩ in response to ESAT-6/CFP-10, indicating that the discrimination between patients with active TB and individuals with latent TB is difficult. Interestingly, in response to the DosR Rv1733 antigen, high levels of IFN-ꝩ were observed in PBMC cultures of TB contacts in comparison to both active TB and healthy control groups (p<0.05). Together, these results suggest the existence of tuberculosis biomarkers represented by: 1) elevated serum levels of IgG1 antibodies against ESAT6/CFP-10, Rv0717, Rv3353, Rv1733, Rv2628, Rv2029 and Rv0867; 2) high IFN-ꝩ and TNF-α production in response to different M. tuberculosis antigens; and 3) increased serum levels of CXCL-9 and CXCL-10. This profile of immune response may assist in the diagnosis of TB and monitoring drug therapy. Furthermore, detection of high levels of IFN-ꝩ in response to the Rv1733 antigen may contribute to the diagnosis of TB disease in contacts presenting asymptomatic tuberculosis.