Orientador : Sonia Presa Caggiani de Salzberg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-16T16:24:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hirooka_ElisaYoko_D.pdf: 4696505 bytes, checksum: 1200698a43df3235d6efdac9fd96b67b (MD5) Previous issue date: 1984 / Resumo: O presente trabalho foi desenvolvido com a finalidade de estudar o efeito da concentração dos íons magnésio e ferro, assim como da proteína conalbumina no desenvolvimento da linhagem Staphylococus aureus S-6 . As outras propriedades estudadas foram a produção do proteínas extracelulares congulase, nuclease e as enterotoxinas A ( EEA ) o B ( EEB ) e a estrutura de parede celular. A remoção de íons do hidrolisado de caseína, meio NAK ( 2,5 µg/mL de íons ferro e magnésio ) com alumina deu origem ao meio denominado NAKSA ( 0,4 ug/mL de forro 0,1 ug/ml de magnésio) . Este tratamento afetou o desenvolvimento de S.aureus S-6 , obtendo-se células com morfologia alterada, diminuição do peso seco e modificações na produção das proteínas extracelularas DNAse, coagulase e as enterotoxinas A e B, assim como a enzima intracelular desidrogenase lática. A adição de 1,11 µg/mL de Mg2+ ao meio NAKSA levou a recuperação do peso seco, porém não houve restabelecimento total da morfologia celular. Para este valor de magnésio, o nível de DNAse aumentou 3,5 vezes em relação ao meio NAK, enquanto que a concentração das proteínas extracelulares restantes, assim como intracelulares analisadas, não atingiu os valores obtidos no meio NAK. Foi constatado que este aumento da atividade nucleásica não se deve a um dano da célula ao nível de membrana, nem ao efeito do íon magnésio ou de componentes da parede celular na atividade enzimática, mas devido a uma maior produção e liberação da enzima pelo microrganismo. A quantidade de enterotoxina B produzida foi afetada por variações na concentração de magnésio, enquanto que a de enterotoxina A permaneceu constante. A adição de ferro em concentrações superiores a 1,19 ug/mL, ao meio NAKSA mais 1,11 µg/mL do Mg2+ teve como consequência efeitos adversos , tanto para o desenvolvimento do microrganismo, quanto sobre a liberação de DNAse e EEB, indicando que o equilíbrio iônico desempenha um papel importante no desenvolvimento normal das células. A adição de conalbumina ao meio NAKSA mais 1,11 µg/mL de Mg2+ não apresentou efeitos inibitórios nas propriedades estudadas, ocorrendo inclusive um ligeiro estímulo na produção das proteínas extracelulares no meio NAKSA. Em relação à fração das enzimas extracelulares associadas à célula, verificou-se que a DKAse superficial liberada pela ação da lisostafina foi aproximadamente 200 vezes inferior a concentração da mesma enzima presente no sobrenadante da cultura. A quantidade de DNAse presente na parede celular foi aproximadamente igual aquela presente nos protoplastos. A linhagem S. aureus S-6 apresentou variações durante o armazenamento e transferências sucessivas, tais como aumento ou diminuição na produção das proteínas extracelulares em estudo. A analise por difração de raios X mostrou que as paredes celulares do microrganismo desenvolvido nos meios NAK e NAKSA , não apresentam diferenças ao nível da estrutura tridimensional, embora tenham sido observadas alterações morfológicas marcantes, através de microscopia ótica / Abstract: This research was developed to study the effect of the ions magnesium and iron and the protein conalbumin in the development of the strain Staphylococus aureus S-6. Other properties studied were the production of extracellular proteins coagulase, nuclease and entorotoxins A (SEA) and B (SEB) and cell wall structure. The ion remotion from the ca-sein hidrolysate (NAK medium) containing iron and magnesium at the concentration of 2.5 pg/mL each, originated the NAKSA medium containing 0.4 µg/mL of iron and 0.1 ug/mL of magnesium, This treatment affected the development of S. aureus S-6 when compared to the one obtained using the NAK medium. The cells showed altered morphology, dry weight decrease and modification of the extracellular proteins production DNAse, coagulase and the enterotoxins A-and B, as well as the intracellular enzyme lactic de hydrogenase. The addition of 1.11 µg/mL of Mg2+ to the NAKSA medium produced complete recovery of the cell dry weight, but only partial recovery of the ceil morphology. At this magnesium level the DNAse concentration increased 3.5 times as related to the concentration in the. NAK medium. On the other hand the remainder of the exoproteins under study did not achieve the values obtained in the NAK medium. It was verified that the increase in nuclease activity was not due to cell injury at the membrane level, either to the effect of the magnesium ion or the cell wall components on the enzyme activity, but to a higher production and releasing of the enzyme by the microorganism. The production of enterotoxin B was affected by differences in the magnesium concentration, although enterotoxin A remained constant. The addition of iron at. concentration 1.19 µg/ml. to the NAKSA medium plus 1.11 µg/mL of Mg2+ had a negative effect on the growth of the microorganism, as well as the releasing of DNAse and SEB, indicating that the ionic equilibrium is important for the adequate cell development.The addition of conaibumin to the NAKSA plus 1.11 ug/mL of Kg^+ medium did not show inhibitory effects on the properties under study. On the other hand, the addition of this protein to the NAKSA medium promoted the production of the extracellular proteins. With respect to the cell associated extracellular enzymes fraction, it was verified that the surface DNAse re leased by lysGS taphin act ion was about 200 times lower than the fraction of the same enzyme present in the culture supernatant. The DNAse present at the cell wall was approximately the 'same present in the cell protoplasts. The strain S. aureus S-6 showed variations during the storage and transference period such as increase or decrease in the production of the extracellular proteins under study. The X-ray diffraction analysis indicated that the cell wall of the microorganism growing in the NAK and NAKSA medium have no differences at the structural level, even though strong morphological differences v/ere observed by optical microscopy / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

INTRODUCCION: Staphylococcus lugdunensis es una especie de estafilococo coagulasa negativo, inicialmente relacionado con endocarditis, posteriormente, se ha asociado a un amplio espectro de infecciones en su mayoría leves, pero más habituales que la endocarditis, siendo las más frecuentemente descritas las infecciones de la piel y de tejidos blandos. Teniendo como objetivo, identificar S. lugdunensis en aislados y establecer su relación patógena asociada a procesos infecciosos, y establecer un sistema de detección, que sea factible de realizar por los laboratorios de microbiología del país. MATERIAL Y METODOS: Se presenta un estudio descriptivo, observacional de corte transversal. Se estudiaron los aislamientos de S. lugdunensis del Hospital Nacional Daniel Alcides Carrión, Callao; durante 7 meses (junio-diciembre, 2005). Para la identificación del S. lugdunensis, se realizó el factor de afinidad para el fibrinógeno, la coagulasa libre en tubo, la acidificación del manitol, así como las características del cultivo que presenta el S. lugdunensis. Como prueba de tamizaje se utilizó la descarboxilación de la ornitina, y como prueba confirmatoria se utilizaron carbohidratos de trehalosa y manosa. El antibiograma se realizó mediante el Método de Difusión en Agar (Bauer y Kirby), según las normas de la CLSI-NCCLS del año 2005. Se revisaron las historias clínicas de los pacientes con aislamiento de S. lugdunensis. RESULTADOS: Se obtuvieron 6 aislamientos de S. lugdunensis de las siguientes muestras: hemocultivo (3), abscesos (2) y herida quirúrgica (1). En 5 casos el cultivo fue puro y en un caso mixto. La localización de las lesiones fue: cuero cabelludo (1), pie (1) y región lumbosacra (1). Tres de los seis aislamientos (50%) presentaban factor de afinidad para el fibrinógeno. Dos de los seis aislamientos (33.3%) fueron sensibles a la penicilina. En 4 casos las cepas eran productoras de betalactamasas (66.6%) y en 2 casos resistente a la meticilina (33.3%). CONCLUSIONES: La frecuencia del S. lugdunensis en nuestro hospital es del 5% de todas las cepas de estafilococos coagulasa negativo aislado en el laboratorio. Existe una elevada resistencia a los antimicrobianos en comparación a estudios realizados en Europa y EEUU. Este estudio establece un sistema de detección que sea factible de realizar por otros laboratorios de microbiología.

Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), es una bacteria multirresistente gram positiva, considerada como patógeno crítico en medicina humana. Es una de las causas que lideran las infecciones asociadas a hospitales (SARM-AH), así mismo ha emergido como causa de enfermedades en personas de la comunidad (SARM-AC). La mayoría de cepas de SARM son resistentes a un amplio rango de agentes antimicrobianos. En los últimos años, nuevas cepas de SARM emergieron dentro del reino animal, causando infección en humanos; habiéndose identificado a la crianza porcina como factor de riesgo en el incremento de portadores de Staphylococcus aureus a nivel nasal. Estudios previos en países europeos demostraron prevalencias de SARM del 81% y 23% en granjas porcinas. En este estudio se buscó determinar la presencia de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) en granjas tecnificadas del departamento de Lima. Para realizar este estudio se seleccionaron al azar seis granjas porcinas tecnificadas; de cada una de ellas se seleccionaron a 20 cerdos. A cada grupo experimental se le realizó hisopados nasales de ambas narinas, las muestras fueron aisladas en medios no selectivos para SARM y se les sometió a pruebas bioquímicas y métodos selectivos para la detección de resistencia a meticilina. La prueba de Látex aglutinación confirmó a 3 aislamientos como SARM. Los resultados de este estudio demostraron una presencia de 17% en granjas porcinas tecnificadas; confirmando así la persistencia de Staphylococcus aureus resistente a meticilina en granjas porcinas tecnificadas del departamento de Lima. Palabras Claves: Staphylococcus aureus, SARM, bacterias resistentes, agentes betalactámicos / --- Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), is a gram positive multiresistant bacteria, considered to be a critical pathogen in human medicine. It is one of the leading causes of hospital-acquired infections (HA-MRSA). It has also emerged as a cause of illnesses in the community (CA-MRSA). The majority of strains of MRSA are resistant to a wide range of antibacterial agents. In recent years, new strains of MRSA have appeared in the animal kingdom, causing infections in humans; pig rearing has been identified as a risk factor in the increase in carriers of Staphylococcus aureus in the nose. Earlier studies in Europe show that MRSA is present on 81% and 23% of pig farms. This study seeks to determine the presence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in industrial pig farms in the department of Lima. Six industrial pig farms were selected at random for this study; and 20 pigs were from each one. Nasal swabs were taken from both nostrils of animals from each group and the samples were isolated in selective media before being subject to biochemical and selective tests to detect resistance to methicillin. The latex agglutination test confirmed 3 isolates as MRSA. The results of this study show a presence of 17% in industrial pig farms; thus the persistence of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in industrial pig farms in the department of Lima has been confirmed. Key Words: Staphylococcus aureus, MRSA, resistant bacteria, beta-lactamic agents / Tesis

Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), es una bacteria multirresistente gram positiva, considerada como patógeno crítico en medicina humana. Es una de las causas que lideran las infecciones asociadas a hospitales (SARM-AH), así mismo ha emergido como causa de enfermedades en personas de la comunidad (SARM-AC). La mayoría de cepas de SARM son resistentes a un amplio rango de agentes antimicrobianos. En los últimos años, nuevas cepas de SARM emergieron dentro del reino animal, causando infección en humanos; habiéndose identificado a la crianza porcina como factor de riesgo en el incremento de portadores de Staphylococcus aureus a nivel nasal. Estudios previos en países europeos demostraron prevalencias de SARM del 81% y 23% en granjas porcinas. En este estudio se buscó determinar la presencia de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) en granjas tecnificadas del departamento de Lima. Para realizar este estudio se seleccionaron al azar seis granjas porcinas tecnificadas; de cada una de ellas se seleccionaron a 20 cerdos. A cada grupo experimental se le realizó hisopados nasales de ambas narinas, las muestras fueron aisladas en medios no selectivos para SARM y se les sometió a pruebas bioquímicas y métodos selectivos para la detección de resistencia a meticilina. La prueba de Látex aglutinación confirmó a 3 aislamientos como SARM. Los resultados de este estudio demostraron una presencia de 17% en granjas porcinas tecnificadas; confirmando así la persistencia de Staphylococcus aureus resistente a meticilina en granjas porcinas tecnificadas del departamento de Lima. Palabras Claves: Staphylococcus aureus, SARM, bacterias resistentes, agentes betalactámicos / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), is a gram positive multiresistant bacteria, considered to be a critical pathogen in human medicine. It is one of the leading causes of hospital-acquired infections (HA-MRSA). It has also emerged as a cause of illnesses in the community (CA-MRSA). The majority of strains of MRSA are resistant to a wide range of antibacterial agents. In recent years, new strains of MRSA have appeared in the animal kingdom, causing infections in humans; pig rearing has been identified as a risk factor in the increase in carriers of Staphylococcus aureus in the nose. Earlier studies in Europe show that MRSA is present on 81% and 23% of pig farms. This study seeks to determine the presence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in industrial pig farms in the department of Lima. Six industrial pig farms were selected at random for this study; and 20 pigs were from each one. Nasal swabs were taken from both nostrils of animals from each group and the samples were isolated in selective media before being subject to biochemical and selective tests to detect resistance to methicillin. The latex agglutination test confirmed 3 isolates as MRSA. The results of this study show a presence of 17% in industrial pig farms; thus the persistence of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in industrial pig farms in the department of Lima has been confirmed. Key Words: Staphylococcus aureus, MRSA, resistant bacteria, beta-lactamic agents

INTRODUCCION: Staphylococcus lugdunensis es una especie de estafilococo coagulasa negativo, inicialmente relacionado con endocarditis, posteriormente, se ha asociado a un amplio espectro de infecciones en su mayoría leves, pero más habituales que la endocarditis, siendo las más frecuentemente descritas las infecciones de la piel y de tejidos blandos. Teniendo como objetivo, identificar S. lugdunensis en aislados y establecer su relación patógena asociada a procesos infecciosos, y establecer un sistema de detección, que sea factible de realizar por los laboratorios de microbiología del país. MATERIAL Y METODOS: Se presenta un estudio descriptivo, observacional de corte transversal. Se estudiaron los aislamientos de S. lugdunensis del Hospital Nacional Daniel Alcides Carrión, Callao; durante 7 meses (junio-diciembre, 2005). Para la identificación del S. lugdunensis, se realizó el factor de afinidad para el fibrinógeno, la coagulasa libre en tubo, la acidificación del manitol, así como las características del cultivo que presenta el S. lugdunensis. Como prueba de tamizaje se utilizó la descarboxilación de la ornitina, y como prueba confirmatoria se utilizaron carbohidratos de trehalosa y manosa. El antibiograma se realizó mediante el Método de Difusión en Agar (Bauer y Kirby), según las normas de la CLSI-NCCLS del año 2005. Se revisaron las historias clínicas de los pacientes con aislamiento de S. lugdunensis. RESULTADOS: Se obtuvieron 6 aislamientos de S. lugdunensis de las siguientes muestras: hemocultivo (3), abscesos (2) y herida quirúrgica (1). En 5 casos el cultivo fue puro y en un caso mixto. La localización de las lesiones fue: cuero cabelludo (1), pie (1) y región lumbosacra (1). Tres de los seis aislamientos (50%) presentaban factor de afinidad para el fibrinógeno. Dos de los seis aislamientos (33.3%) fueron sensibles a la penicilina. En 4 casos las cepas eran productoras de betalactamasas (66.6%) y en 2 casos resistente a la meticilina (33.3%). CONCLUSIONES: La frecuencia del S. lugdunensis en nuestro hospital es del 5% de todas las cepas de estafilococos coagulasa negativo aislado en el laboratorio. Existe una elevada resistencia a los antimicrobianos en comparación a estudios realizados en Europa y EEUU. Este estudio establece un sistema de detección que sea factible de realizar por otros laboratorios de microbiología.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-11-14T03:23:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348747.pdf: 2500699 bytes, checksum: 37158baf64bce270811a31f04240c949 (MD5) Previous issue date: 2017 / Nas últimas décadas, a disseminação de bactérias patogênicas e resistentes, tornou-se uma preocupação a nível mundial. As metodologias fenotípicas e moleculares tradicionais são laboriosas, requerem muito treinamento técnico e possuem altos custos. O sistema MALDI-TOF/MS, metodologia emergente da espectrometria de massas aplicada à microbiologia, é utilizado na rotina como método de identificação por inoculação direta de bactérias e mostrou-se promissor na determinação precoce da relação epidemiológica de isolados. Os Staphylococcus spp. resistentes à meticilina (MRS) e Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) são importantes patógenos oportunistas que causam Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS). Assim sendo, o nosso trabalho tem como objetivo analisar biomarcadores proteicos para estudos de identificação, resistência e variabilidade de isolados de MRS e VRE. Os isolados são provenientes do Hospital Universitário (HU/UFSC, Florianópolis/SC, Brasil), coletados entre abril de 2015 e março de 2016 de pacientes, profissionais da saúde, e ambiente hospitalar de cinco alas do hospital: Emergência (EMG), Unidade de Terapia Intensiva (UTI), Centro Cirúrgico (CCR), Clínica Médica I (CMI) e Clínica Cirúrgica I (CRI). Das 1.759 amostras coletadas, foram isolados 17 VRE e 72 MRS. Desses, catorze foram identificados como S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) e quinze como E. faecium resistentes à vancomicina. Nossos resultados apontam que o protocolo de MALDI-TOF validado neste trabalho para análises microbiológicas mostrou poder discriminatório para identificação dos isolados a nível de gênero, tanto para VRE quanto para MRS, analisando-se proteínas na faixa de 2.000 a 20.000 Da. Para Staphylococcus spp., os biomarcadores proteicos identificados permitiram uma análise robusta para identificação das espécies, mas não mostraram poder discriminatório suficiente para análises de marcadores de resistência à oxacilina e vancomicina ou de variabilidade e clonalidade. Para a identificação dos Staphylococcus coagulase negativa (SCoN) foram encontrados quatro picos exclusivos para S. sciuri resistentes à oxacilina (MRSCi), quatro para S. haemolyticus resistentes à oxacilina (MRSH) e dezessete para S. warneri resistentes à oxacilina (MRSW). Na tentativa de diferenciar MRSA dos MSSA, foram obtidos nove picos com especificidade e sensibilidade consideráveis, mas somente dois, m/z 2302±2 Da e 3073±2 Da possuem valores relevantes da área sob a curva (AUC) para futuras pesquisas. No caso do VRE, o pico m/z 4430±3 Da foi comum para todas as amostras, entretanto não foi possível identificar picos comuns para identificação das espécies nem para estudos de prospecção de resistência bacteriana. Finalmente, apesar de bem estabelecido para identificação bacteriana, nossos dados sugerem cautela na interpretação dos resultados de MALDI-TOF/MS para estudos de resistência e variabilidade até que modelos computacionais estejam bem validados. / Abstract : Within the last decade, the characterization of pathogenic and resistant bacteria has become a worldwide concern. The conventional microbiology and molecular biology methods are time-consuming, require technical skills training and are costly. Matrix-assisted laser-desorption-ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), an emerging methodology of mass spectrometry applied to microbiology, is a method routinely used for bacterial identification using a whole cell of bacteria and has shown promise in the prompt determination of epidemiological relatedness of clinical isolates. Methicillin-resistant Staphylococcus spp. (MRS) and vancomycin-resistant Enterococci (VRE) are important opportunistic pathogens that cause Healthcare-associated Infections (HAI). The aim of this study was to analyze protein biomarkers for bacterial identification, resistance and variability of MRS and VRE isolates compared to standard strains and control strains. The isolates were collected from the University Hospital (HU/UFSC, Florianópolis/SC, Brazil), between April 2015 and March 2016 from patients, health workers and the hospital environment of five hospital units: Emergency Department (ED), Intensive Care Unit (ICU), Surgical Center (SC), Medical Clinical Unit (MCU) and Surgical Clinical Unit (SCU). From the 1,759 samples that were obtained, 17 VRE and 72 MRS were isolated. Among then, fourteen were identified as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and seventeen as vancomycin-resistant Enterococcus faecium. Here we show that the MALDI-TOF protocol validated in the study conditions for microbiological analysis showed discriminatory power for the identification of the isolates at the genus level, for both VRE and MRS, analyzing proteins in the range of 2,000 to 20,000 Da. The identified protein biomarkers to Staphylococcus spp. allowed a robust analysis for species identification. However, they did not show sufficient discriminatory power for analyzes of oxacillin and vancomycin resistance markers or of variability and clonality. For the identification of coagulase-negative staphylococci (CoNS), four unique peaks were found for methicillin-resistant S. sciuri (MRSCi), four for methicillin-resistant S. haemolyticus (MRSH) and seventeen for methicillin-resistant S. warneri (MRSW). In an attempt to differentiate MRSA from MSSA, nine peaks with considerable specificity and sensitivity were obtained, but only two, m/z 2302±2 and 3073±2 have relevant area under the curve (AUC) values for future research. In the case of VRE, the peak m/z 4430±3 was common for all samples; however it was not possible to identify common peaks for identification of the species or for prospective studies of bacterial resistance. Finally, although well established for bacterial identification, our data suggest caution in the interpretation of MALDI-TOF/MS results for studies of resistance and variability until computational models are well validated.

Orientador : Sonia Presa Caggiani de Salzberg / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-15T12:59:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ueno_Mariko_M.pdf: 40336742 bytes, checksum: cf07c0e0941be2d7d54bd24cf2f08fe1 (MD5) Previous issue date: 1987 / Resumo: O principal objetivo deste trabalho foi a produção, purificação e obtenção de anti-soro da enterotoxina estafilocócica tipo B (EEB). Com os reagentes obtidos (antígeno e anticorpo) procedeu-se ao levantamento de S. aureus produtores de enterotoxina B em portadores assintomáticos. A enterotoxina foi produzida pela linhagem S. aureus S-6, conhecida como altamente produtora de EEB. O método de purificação foi o de SCHANTZ e colaboradores, e para a produção de anti-soro, utilizou-se o esquema de imunização de coelhos, otimizado pelo Food Research Institute (FRI), Wisconsin, USA. O processo de purificação foi avaliado pela difusão dupla em gel "Optimal Sensitivity Plate", OSP (Ouchterlony modificado) para a identificação da toxina, o método de difusão simples em gel de "Oudin" para a dosagem da toxina, e a dosagem de proteína total foi realizada pelo método de Lowry. Na produção de toxina foi utilizado como meio de cultura o hidrolisado de caseína N-Z-Amine NAK suplementado com tiamina (0,00005%) e niacina (0,001%). A quantidade de toxina produzida neste meio foi de 0,33mg/mL. Na primeira cromatografia em Amberlite CG-50 obteve-se um rendimento de 79,9% em relação à quantidade total adsorvida, na segunda cromatografia em Amberlite CG-50 obteve-se um rendimento de 73,3% em relação à primeira cromatografia e na terceira cromatografia em carboximetil celulose o rendimento foi de 80% era relação à segunda cromatografia. O rendimento através de todo o processo de purificação, ou seja toxina total produzida no meio de cultura e toxina total após a terceira cromatografia foi de 44,2%. A toxina purificada apresentou um alto grau de pureza já que houve formação de apenas uma linha de precipitação quando ensaiada contra anti-soro polivalente. Para a produção de anti-soro utilizou-se um lote de cinco coelhos, sendo um inoculado com toxina bruta, sem purificar e quatro com toxina purificada. Para a inoculação seguiu-se o esquema de imunização utilizado no FRI, que abrange um período de 70 dias e doses compreendidas entre 1 e 300 µg administradas em oito seções. O soro foi retirado entre uma e oito semanas após a última injeção através de punção cardíaca. O soro do animal imunizado com preparação bruta de enterotoxina apresentou, através do método de ÜSP, maior variedade de anticorpos, evidenciados através das linhas de precipitação formadas, que os soros dos animais inoculados com enterotoxina purificada. Estes últimos apresentaram ainda alguns interferentes, porém as linhas de precipitação correspondentes foram tênues em relação à linha principal de enterotoxina B. O número de portadores humanos assintomáticos de S. aureus 53% está dentro dos valores apresentados na literatura, 18 a 82%. O valor encontrado para as linhagens produtoras de enterotoxina B, 70,8%, foi ligeiramente superior aos valores apresentados na literatura norte americana / Abstract: The principal goal of this work was the production, purification and antiserum production of Staphylococcal enterotoxin B (SEB). With these reagents, antigen and antiserum, a survey of enterotoxin B producing S. aureus strains in assintomatic carriers was conducted. The enterotoxin was produced by the S-6 strain of S. aureus, a well-known enterotoxin B producer. The purification procedure was that of SCHANTZ and co-workers and for the antiserum production, the Food Research Institute (FRI), Wisconsin, USA immunization schedule was followed. The purification procedure was monitored through the Lowry method for total protein, double diffusion in gel Optimal Sensitivity Plate, OSP (a double diffusion Ouchterlony modification) for toxin identification and single gel diffusion of Oudin for toxin quantification. The casein hydrolysate N-Z-Amine NAK supplemented with thiamine (0,00005%) and niacin (0,001%) was used for toxin production. The enterotoxin concentration in the supernatant was 0,33mg/mL. The toxin yield in the first chromatography using the resin Amberlite CG-50 was 79,9% of the total adsorbed in the resin. In the second chromatography, using the same resin, the yield was 73,3% with respect to the first chromatography and in the third chromatography, using Carboximethyl Celulose; the yield was 80% with respect to the second chromatography. The yield for the entire purification procedure, total toxin after the third chromatography and and total toxin in the broth culture, was 44,2%. The purified enterotoxin showed high purity since only one precipitin line was formed against polivalent antiserum. Five animals were used for the antiserum production, one inoculated with the crude toxin and four with the purified toxin. For inoculation, the FRI recommended schedule was used, with doses ranging between 1 and 300 µg given in eight different sections during a 70 day period. The animals were bled through cardiac puncture after one to eight weeks following the last injection. The antisera obtained from the crude extract immunized animals showed higher number of antibodies, by the OSP method as displayed through precipitin lines, than the antisera from rabbits inoculated with the purified toxin, the latter showed a few very weak secondary lines related to the main line due to enterotoxin B. The number of S. aureus assyntomatic carriers 53% was within the range of values found in the literature, between 18 to 82%. Among them, the number of enterotoxin B producers 70,8% was slightly higher than the 68% reported by North American literature / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-01Bitstream added on 2014-12-02T11:21:05Z : No. of bitstreams: 1 000777381_20151101.pdf: 335580 bytes, checksum: 320f77e5c5865613fa8703a80223014c (MD5) Bitstreams deleted on 2015-11-03T14:39:13Z: 000777381_20151101.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-11-03T14:40:15Z : No. of bitstreams: 1 000777381.pdf: 3018222 bytes, checksum: d974504f28696fef1888197540e512b4 (MD5) / Cefamicina C é um antibiótico produzido por Streptomyces clavuligerus de grande interesse, em virtude de seu maior grau de resistência a enzimas do tipo β-lactamases comparativamente a outros antibióticos beta-lactâmicos. Cefamcina C é produzida em pequenas concentrações na natureza assim como acontece com todos os metabólitos secundários. Assim, investimentos em programas de melhoria de linhagens e de otimização de meios de cultura e operação de biorreatores são aspectos-chave para o aumento da produção industrial. Porém, a eficácia de tais estratégias pode ser limitada, o que requer o uso de novas abordagens. Neste sentido, a engenharia metabólica é uma área importante que alia ferramentas de quantificação de fluxos metabólicos e de técnicas de biologia molecular para melhoria de linhagens. O estudo dos fluxos metabólicos permite, por meio de análise criteriosa do metabolismo do micro-organismo, identificar gargalos metabólicos na rota biossintética de um produto de interesse para, posteriormente, propor possíveis soluções para o aumento da produção. No presente projeto realizou-se o estudo dos fluxos metabólicos de S. clavuligerus com vistas a encontrar formas de operação do metabolismo que conduzam a aumentos da produção de cefamicina C. Para isto, primeiramente foi desenvolvido um meio de cultivo quimicamente definido contendo maltose como fonte de carbono e lisina como fonte de nitrogênio, para que análises do caldo fermentado não tivessem interferência de componentes desconhecidos. Tal meio possibilitou a obtenção de biomassa em torno de 9 g.L-1 e cefamicina C ao redor de 200 mg.L-1 em processo contínuo. Este modo de operação foi possível somente em biorreator devido ao controle de pH, pois em shaker as variações deste parâmetro inviabilizaram o processo. Paralelamente, foi construído um modelo metabólico com 78 reações e 81 metabólitos, sendo 10 externos e 71 internos, que ... / Cephamycin C is an antibiotic produced by Streptomyces clavuligerus of great interest due to its higher degree of resistance to β-lactamases as compared to other beta- lactam antibiotics. Cephamycin C is produced in small concentrations in nature as with all secondary metabolites. Therefore, investments in improvement of strains and optimization, of culture media and operation of bioreactors are key aspects to increase the production. However, the effectiveness of such strategies may be limited, requiring the use of new approaches. In this aspect, the metabolic engineering is an important field that combines quantification of metabolic fluxes and molecular techniques for improving strains. The study of metabolic fluxes enables one to identify metabolic bottlenecks through careful analysis of metabolism of the microorganism, and to suggest ways to increase production. In this project we carried out the study of metabolic fluxes in S. clavuligerus aiming to find ways to increase the production of cephamycin C. For this, first we developed a chemically defined culture medium because this kind of media does not cause interference in the analyses. The developed medium contained maltose as carbon source and lysine as nitrogen source and resulted in 9 g.L-1 of biomass and 200 mg.L-1 of cephamycin C in the continuous process. This mode of operation was only possible in the bioreactor due to its pH control. Due to variations in the pH, the continuous process in shaken-flasks became unviable. The metabolic model was constructed with 78 reactions and 81 metabolites (10 external and 71 internal) which suitably described the metabolism of S. clavuligerus. This model was simulated with the aid of Optflux, a multi-task software developed for this purpose. The profiles of maltose, lysine, biomass, cephamycin C, clavulanic acid, external protein and CO2 evolution were monitored. These data were used for the model simulations. The results allowed...

Orientador:Maria Lucia Gonsales da Costa Araujo / Banca: José Roberto Ernandes / Banca: Ruy de Souza Junior / Banca: Alberto Colli Badino Junior / Banca: José Gregório Cabrera Gomez / Resumo: Cefamicina C é um antibiótico produzido por Streptomyces clavuligerus de grande interesse, em virtude de seu maior grau de resistência a enzimas do tipo β-lactamases comparativamente a outros antibióticos beta-lactâmicos. Cefamcina C é produzida em pequenas concentrações na natureza assim como acontece com todos os metabólitos secundários. Assim, investimentos em programas de melhoria de linhagens e de otimização de meios de cultura e operação de biorreatores são aspectos-chave para o aumento da produção industrial. Porém, a eficácia de tais estratégias pode ser limitada, o que requer o uso de novas abordagens. Neste sentido, a engenharia metabólica é uma área importante que alia ferramentas de quantificação de fluxos metabólicos e de técnicas de biologia molecular para melhoria de linhagens. O estudo dos fluxos metabólicos permite, por meio de análise criteriosa do metabolismo do micro-organismo, identificar gargalos metabólicos na rota biossintética de um produto de interesse para, posteriormente, propor possíveis soluções para o aumento da produção. No presente projeto realizou-se o estudo dos fluxos metabólicos de S. clavuligerus com vistas a encontrar formas de operação do metabolismo que conduzam a aumentos da produção de cefamicina C. Para isto, primeiramente foi desenvolvido um meio de cultivo quimicamente definido contendo maltose como fonte de carbono e lisina como fonte de nitrogênio, para que análises do caldo fermentado não tivessem interferência de componentes desconhecidos. Tal meio possibilitou a obtenção de biomassa em torno de 9 g.L-1 e cefamicina C ao redor de 200 mg.L-1 em processo contínuo. Este modo de operação foi possível somente em biorreator devido ao controle de pH, pois em shaker as variações deste parâmetro inviabilizaram o processo. Paralelamente, foi construído um modelo metabólico com 78 reações e 81 metabólitos, sendo 10 externos e 71 internos, que ... / Abstract: Cephamycin C is an antibiotic produced by Streptomyces clavuligerus of great interest due to its higher degree of resistance to β-lactamases as compared to other beta- lactam antibiotics. Cephamycin C is produced in small concentrations in nature as with all secondary metabolites. Therefore, investments in improvement of strains and optimization, of culture media and operation of bioreactors are key aspects to increase the production. However, the effectiveness of such strategies may be limited, requiring the use of new approaches. In this aspect, the metabolic engineering is an important field that combines quantification of metabolic fluxes and molecular techniques for improving strains. The study of metabolic fluxes enables one to identify metabolic bottlenecks through careful analysis of metabolism of the microorganism, and to suggest ways to increase production. In this project we carried out the study of metabolic fluxes in S. clavuligerus aiming to find ways to increase the production of cephamycin C. For this, first we developed a chemically defined culture medium because this kind of media does not cause interference in the analyses. The developed medium contained maltose as carbon source and lysine as nitrogen source and resulted in 9 g.L-1 of biomass and 200 mg.L-1 of cephamycin C in the continuous process. This mode of operation was only possible in the bioreactor due to its pH control. Due to variations in the pH, the continuous process in shaken-flasks became unviable. The metabolic model was constructed with 78 reactions and 81 metabolites (10 external and 71 internal) which suitably described the metabolism of S. clavuligerus. This model was simulated with the aid of Optflux, a multi-task software developed for this purpose. The profiles of maltose, lysine, biomass, cephamycin C, clavulanic acid, external protein and CO2 evolution were monitored. These data were used for the model simulations. The results allowed... / Doutor

Orientador: Jose Luiz Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-25T03:10:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mollo_VeraMariadeHollanda_M.pdf: 2189708 bytes, checksum: cd5a44e5b3fc31fbc6f925bc2ee28906 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Métodos de detecção de enterotoxinas estafilocócicas, sensíveis, rápidos e específicos obtidos diretamente de extrato de alimentos são importantes para a diminuição no tempo de diagnostico de intoxicações alimentares e no controle sanitário de alimentos. O trabalho visou 'a produção, purificação de enterotoxina estafilocócica do tipo B (EEB) para obtenção de respectiva anti imunoglobulina (lgG anti-EEB) e padronização da metodologia ELlSA "Duplo Sanduíche" para detecção de enterotoxina B em alimentos.A enterotoxina B foi purificada através de três etapas utilizando-se resina de troca iônica AMBERLlTE CG-50 e CM-Sepharose e coluna de exclusão molecular Sephadex G-75. A purificação de enterotoxina foi determinada através de eletroforese SDS - PAGE. A enterotoxina estafilocócica do tipo B purificada foi utiliza~a para imunização de coelhos e cobaias. Os anti-soros policlonais antitoxina B foram utilizados para padronização de método imunoenzimático (EIE) duplo sanduíche visando a detecção de enterotoxina estafilocócica do tipo B em alimentos. A fração IgG foi purificada por fraCionamento com sulfato de amônia e posteriormente foi feita a cromatografia em coluna de exclusão molecular Sephacryl S-200. No método imunoenzimático duplo sanduíche utilizou-se como anticorpo de captura a imunoglobulina de coelho imunizado anti-enterotoxina 8 e como anticorpo detetor o anti-soro obtido de cobaia imunizada. o ensaio imunoenzimático foi padronizado utilizando-se como antígeno a enterotoxina 8 purificada. A técnica do ELlSA mostrou-se bastante sensível sendo detectado 1 ng/ml de enterotoxina estafilocócica B. / Abstract: Methods of detection of staphylococci enterotoxin, which are sensitive, fast and specifc when obtained directly from the extract of food are important for the decrease in time of diagnose of foodborne intoxications and in the sanitary control of foods. This work intended to produce and purificate staphylococci type B (EEB) for obtaining the respective anti imunoglobulina (lgG anti-EEB) and standardization of the ELlSA "Double Sandwich" methodology for detection of enterotoxin B from food. The enterotoxin-B was purified through three stages. For this purpose, ionic change AMBERLlTE CG - 50 resin, CM-Sepharose and molecular exclusion Sephadex G -75 column more used. The enterotoxin purification was determined through eletroforese SDS - PAGE. The stafilococci purified enterotoxin type B was used for immuniz~tion of rabbits and guinea-pig. The policlonals antiserums antitoxin B was used for standarlization of double sandwich imunoenzimatic (EIE) seeking the detection of stafilococci enterotoxin type B in food. The fraction IgG was purified by precipitation with ammonia sulfate followed by molecularexclusion Sephacryl S-200 collumn chromatography. The imunoglobulin antienterotoxin B of immunized rabbit was used as capture antibody and the antiserums of immunized guinea-pig was used as detector antibody in the double sandwich ELlSA. The ELlSA standardized by using the purified enterotoxin B as antigen ELlSA technique, revealed to be sensitive, being able to detect 1 ng/ml of staphylococci B enterotoxin. / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos