Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.

Os gliomas são os tumores primários mais comuns e devastadores que atingem o sistema nervoso central. O prognóstico para pacientes com estes tumores é ruim, e apesar de intensos esforços para o desenvolvimento de novas terapias, agentes efetivos ainda não estão disponíveis. A ecto-5‟-nucleotidase/CD73 (ecto-5‟-NT/CD73) regula os níveis extracelulares de AMP e adenosina, a qual tem sido amplamente descrita como fator indutor de proliferação celular. A ecto-5‟-NT/CD73 per se tem sido relatada como proteína envolvida no controle dos processos de crescimento, maturação, diferenciação, invasão e migração celular, além do processo de formação de metástases. No presente estudo nós avaliamos a atividade enzimática e as funções da ecto-5‟-NT/CD73 durante o processo proliferativo em linhagens de glioma C6 e U138-MG. Os resultados obtidos demonstram que ocorre um aumento da atividade da ecto-5‟-NT/CD73 com o aumento da confluência celular, quer seja esta obtida por semeadura de crescentes densidades celulares ou por crescentes dias de cultivo, em ambas as linhagens estudadas. As análises por RT-PCR e citometria de fluxo revelaram um aumento dos níveis de mRNA e proteína da ecto-5‟-NT/CD73, respectivamente quando comparadas culturas confluentes com culturas subconfluentes em linhagem de glioma humano U138-MG. Nesta mesma linhagem, o tratamento com 1 M de APCP, inibidor competitivo da ecto-5‟-NT/CD73 causou uma significativa redução de 20% na proliferação celular, enquanto a adenosina aumentou este processo em 25%. Por outro lado, 1 mM e 3 mM de AMP reduziram a proliferação em 29% e 42% respectivamente. Além disso, o silenciamento estável da ecto-5‟-NT/CD73 pela técnica do RNAi reduziu o processo de migração celular na linhagem de glioma humano U138-MG. Em conjunto, Estes resultados sugerem a participação da ecto-5‟-NT/CD73 na proliferação celular, sendo este processo desencadeado pela geração de adenosina (fator proliferativo), pela remoção dos níveis citotóxicos de AMP e pela participação per se da ecto-5‟-NT/CD73 como proteína de adesão. / Malignant gliomas are the most common and devastating primary tumors in the central nervous system. Despite treatment, patients with these tumors have a poor prognosis. Ecto-5‟-nucleotidase/CD73 (ecto-5‟-NT/CD73) may regulate the extracellular AMP and adenosine levels, which have been described as proliferation factor. The participation of ecto-5‟-NT/CD73 per se has been proposed as a proliferative factor, being involved in the control of cell growth, maturation, differentiation, invasion, migration and metastases processes. In the present study, we evaluate the ecto-5‟-NT/CD73 activity and functions in rat C6 and human U138-MG glioma cell lines proliferation process. Crescent confluences and culture times leads to an increase on ecto-5‟-NT/CD73 activity in both C6 and U138-MG glioma cells. RT-PCR analysis and flow cytometry showed a significant increase on ecto-5‟-NT/CD73 mRNA and protein levels respectively, when compared confluent cultures with subconfluent one in human U138-MG glioma cells. Treatment with 1 M APCP, a competitive ecto-5‟-NT inhibitor, caused a significant reduction in glioma cell proliferation of 20% for U138-MG glioma cell line. In addition, 100 M adenosine increases cell proliferation in 25% and AMP 1m M and 3 mM decrease U138-MG glioma cells proliferation in 29% and 42% respectively. The stable silencement of ecto-5‟-NT/CD73 by RNAi technique reduces cell migration in human U138-MG glioma cell line. Taken together these results suggest the participation of ecto-5‟-NT/CD73 in cell proliferation, being this process dependent of enzymatic activity generating adenosine, a proliferative factor and removing toxic levels of AMP, as well as a function as adhesive molecule.

Glioblastoma multiforme é a forma mais comum e agressiva de tumor cerebral que apresenta um severo crescimento e um comportamento altamente invasivo. Linhagens de células de glioma em cultura apresentam alta atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase que metaboliza AMP em adenosina. Em adição, ela também interage com componentes da matriz extracelular como molécula adesiva. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito de diferentes componentes da matriz extracelular sobre a atividade da ecto-5’-nucleotidase, proliferação, adesão e migração celular na linhagem de células de glioma humano U138-MG. Os resultados obtidos mostraram uma inibição da atividade enzimática da ecto-5’- nucleotidase quando tratada com laminina sozinha e com fibronectina ou laminina em co-tratamento com dextran sulfato. O dextran sulfato mostrou reduzir a proliferação em 37%. O mesmo efeito foi observado para os co-tratamentos entre dextran/laminina (29%) e dextran/colágeno (28%). A presença de adenosina diminuiu a adesão celular em torno de 40% e o APCP aumentou a adesão em 75%. Laminina inibiu a adesão celular, já a condroitina sulfato aumentou em 70%. As células U138 apresentaram uma redução da adesão e migração celular quando tratadas apenas com dextran e também no co-tratamento deste com adenosina e APCP. Diante dos resultados podemos sugerir a modulação da atividade da ecto5’-nucleotidase e assim uma modulação da produção de adenosina por moléculas da matriz extracelular, afetando assim eventos celulares envolvidos no comportamento invasivo destas células tumorais. / Glioblastoma multiforme is the most aggressive form of brain tumor that shows a severe growth and highly invasiveness behavior. Glioma cell lines in culture present a high activity of the ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT/CD73) which metabolizes AMP to adenosine. In addition, ecto-5’-NT/CD73 also has contact with extracellular matrix components like adhesive molecule. In the present paper, we evaluate the effect of distinct extracellular matrix components on the ecto-5’- NT/CD73 activity, proliferation, adhesion and migration in U138-MG human glioma cell line. The results showed an inhibition of enzymatic activity of ecto-5’NT/CD73 in the presence of laminin, fibronectin plus dextran sulfate and laminin plus dextran sulfate. In the proliferation assay it was observed that dextran sulfate reduced the proliferation in 37% and in association with collagen type I or laminin, the proliferation was reduced too (28% and 29%, respectively). The presence of adenosina decreased of adhesion at about 40% and when treated with APCP increased in 75%. Laminin inhibited the cell adhesion and chondroitin sulfate increased in 70%. U138 cells presented reduction of adhesion and cell migration in the presence of dextran sulfate alone and in the presence of adenosine and APCP. Taken together these results suggest the modulation of ecto-5’-NT/CD73 activity and production of adenosin by extracellular matrix molecules, affecting cell events involved in the invasiveness behavior this tumor cells.

Os gliomas são os tumores primários mais comuns e devastadores que atingem o sistema nervoso central. O prognóstico para pacientes com estes tumores é ruim, e apesar de intensos esforços para o desenvolvimento de novas terapias, agentes efetivos ainda não estão disponíveis. A ecto-5‟-nucleotidase/CD73 (ecto-5‟-NT/CD73) regula os níveis extracelulares de AMP e adenosina, a qual tem sido amplamente descrita como fator indutor de proliferação celular. A ecto-5‟-NT/CD73 per se tem sido relatada como proteína envolvida no controle dos processos de crescimento, maturação, diferenciação, invasão e migração celular, além do processo de formação de metástases. No presente estudo nós avaliamos a atividade enzimática e as funções da ecto-5‟-NT/CD73 durante o processo proliferativo em linhagens de glioma C6 e U138-MG. Os resultados obtidos demonstram que ocorre um aumento da atividade da ecto-5‟-NT/CD73 com o aumento da confluência celular, quer seja esta obtida por semeadura de crescentes densidades celulares ou por crescentes dias de cultivo, em ambas as linhagens estudadas. As análises por RT-PCR e citometria de fluxo revelaram um aumento dos níveis de mRNA e proteína da ecto-5‟-NT/CD73, respectivamente quando comparadas culturas confluentes com culturas subconfluentes em linhagem de glioma humano U138-MG. Nesta mesma linhagem, o tratamento com 1 M de APCP, inibidor competitivo da ecto-5‟-NT/CD73 causou uma significativa redução de 20% na proliferação celular, enquanto a adenosina aumentou este processo em 25%. Por outro lado, 1 mM e 3 mM de AMP reduziram a proliferação em 29% e 42% respectivamente. Além disso, o silenciamento estável da ecto-5‟-NT/CD73 pela técnica do RNAi reduziu o processo de migração celular na linhagem de glioma humano U138-MG. Em conjunto, Estes resultados sugerem a participação da ecto-5‟-NT/CD73 na proliferação celular, sendo este processo desencadeado pela geração de adenosina (fator proliferativo), pela remoção dos níveis citotóxicos de AMP e pela participação per se da ecto-5‟-NT/CD73 como proteína de adesão. / Malignant gliomas are the most common and devastating primary tumors in the central nervous system. Despite treatment, patients with these tumors have a poor prognosis. Ecto-5‟-nucleotidase/CD73 (ecto-5‟-NT/CD73) may regulate the extracellular AMP and adenosine levels, which have been described as proliferation factor. The participation of ecto-5‟-NT/CD73 per se has been proposed as a proliferative factor, being involved in the control of cell growth, maturation, differentiation, invasion, migration and metastases processes. In the present study, we evaluate the ecto-5‟-NT/CD73 activity and functions in rat C6 and human U138-MG glioma cell lines proliferation process. Crescent confluences and culture times leads to an increase on ecto-5‟-NT/CD73 activity in both C6 and U138-MG glioma cells. RT-PCR analysis and flow cytometry showed a significant increase on ecto-5‟-NT/CD73 mRNA and protein levels respectively, when compared confluent cultures with subconfluent one in human U138-MG glioma cells. Treatment with 1 M APCP, a competitive ecto-5‟-NT inhibitor, caused a significant reduction in glioma cell proliferation of 20% for U138-MG glioma cell line. In addition, 100 M adenosine increases cell proliferation in 25% and AMP 1m M and 3 mM decrease U138-MG glioma cells proliferation in 29% and 42% respectively. The stable silencement of ecto-5‟-NT/CD73 by RNAi technique reduces cell migration in human U138-MG glioma cell line. Taken together these results suggest the participation of ecto-5‟-NT/CD73 in cell proliferation, being this process dependent of enzymatic activity generating adenosine, a proliferative factor and removing toxic levels of AMP, as well as a function as adhesive molecule.

Glioblastoma multiforme é a forma mais comum e agressiva de tumor cerebral que apresenta um severo crescimento e um comportamento altamente invasivo. Linhagens de células de glioma em cultura apresentam alta atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase que metaboliza AMP em adenosina. Em adição, ela também interage com componentes da matriz extracelular como molécula adesiva. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito de diferentes componentes da matriz extracelular sobre a atividade da ecto-5’-nucleotidase, proliferação, adesão e migração celular na linhagem de células de glioma humano U138-MG. Os resultados obtidos mostraram uma inibição da atividade enzimática da ecto-5’- nucleotidase quando tratada com laminina sozinha e com fibronectina ou laminina em co-tratamento com dextran sulfato. O dextran sulfato mostrou reduzir a proliferação em 37%. O mesmo efeito foi observado para os co-tratamentos entre dextran/laminina (29%) e dextran/colágeno (28%). A presença de adenosina diminuiu a adesão celular em torno de 40% e o APCP aumentou a adesão em 75%. Laminina inibiu a adesão celular, já a condroitina sulfato aumentou em 70%. As células U138 apresentaram uma redução da adesão e migração celular quando tratadas apenas com dextran e também no co-tratamento deste com adenosina e APCP. Diante dos resultados podemos sugerir a modulação da atividade da ecto5’-nucleotidase e assim uma modulação da produção de adenosina por moléculas da matriz extracelular, afetando assim eventos celulares envolvidos no comportamento invasivo destas células tumorais. / Glioblastoma multiforme is the most aggressive form of brain tumor that shows a severe growth and highly invasiveness behavior. Glioma cell lines in culture present a high activity of the ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT/CD73) which metabolizes AMP to adenosine. In addition, ecto-5’-NT/CD73 also has contact with extracellular matrix components like adhesive molecule. In the present paper, we evaluate the effect of distinct extracellular matrix components on the ecto-5’- NT/CD73 activity, proliferation, adhesion and migration in U138-MG human glioma cell line. The results showed an inhibition of enzymatic activity of ecto-5’NT/CD73 in the presence of laminin, fibronectin plus dextran sulfate and laminin plus dextran sulfate. In the proliferation assay it was observed that dextran sulfate reduced the proliferation in 37% and in association with collagen type I or laminin, the proliferation was reduced too (28% and 29%, respectively). The presence of adenosina decreased of adhesion at about 40% and when treated with APCP increased in 75%. Laminin inhibited the cell adhesion and chondroitin sulfate increased in 70%. U138 cells presented reduction of adhesion and cell migration in the presence of dextran sulfate alone and in the presence of adenosine and APCP. Taken together these results suggest the modulation of ecto-5’-NT/CD73 activity and production of adenosin by extracellular matrix molecules, affecting cell events involved in the invasiveness behavior this tumor cells.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Nas células imunes, o ATP pode atuar como uma molécula sinalizadora de perigo enquanto a adenosina, um produto da degradação do ATP, serve como um mecanismo que controla/limita a inflamação. Já, no sistema vascular, o ADP é um agonista fisiológico envolvido na hemostasia normal e na trombose. Considerando que os macrófagos são elementos chave para processos inflamatórios e quando estímulados exibibem um fenótipo pró-inflamatório/defesa (clássico/M1) ou antiinflamatório/reparatório (alterantivo/M2). O objetivo foi investigar a atividade e expressão das ectonuclotidases em diferentes fenótipos de macrófago e avaliar o efeito da homocisteína sobre essas enzimas em macrófagos e plaquetas.. As análises da diferenciação de macrófagos em fenótipo próinflamatório/ M1 e antiinflamatório/M2 revelaram presença igual de receptores purinérgicos. Entretanto, mudança no perfil das ectonucleotidases como E-NTPDase1, E-NTPDase3 e ecto-5’- nucleotidase foram encontradas, sugerindo que os macrófagos devem alterar a casacata purinérgica durante a ativação fenotípica. No fenótipo pró-inflamatório/M1 houve uma diminuição na hidrólise de ATP, sugerindo um acúmulo do mesmo, enquanto no fenótipo antiinflamatório/M2 as enzimas conduzem para uma progressiva diminuição nas concentrações de nucleotídeos (ATP) e aumento na disponibilidade de adenosina. Já os macrófagos expostos a homocisteína apresentaram uma polarização para o fenótipo pro-inflamatório (M1) e nossos achados sugerem o envolvimento da ENTPDase3 e da ecto-5’-nucleotidase em macrófagos nas complicações inflamatórias associadas a homocisteína. Nas plaquetas, as quais são elementos fundamentais no processo de trombogênese, a homocisteína causou uma diminuição na hifrólise de ADP. Essa elevação no nível de ADP ao redor das plaquetas devido a inativação das ectonucleotidases, causada pela homocisteína, deve estar contribuindo para o aumento do risco trombótico descrito em pacientes com hiperhomocisteinemia. Além disso, os animais que receberam homocisteína tiveram um aumento na agregação plaquetária induzida por ADP. Em conclusão, os resultados do presente estudo reforçam o envolvimento do sistema purinérgico em processos inflamatórios/trombóticos e apontam parar o desenvolvimeto de tratamentos para doenças inflamatórias/trobóticas. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´- NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. In the cells of the immune system, the ATP can act as danger signaling whereas adenosine, the ATP breakdown product, serves as a negative feedback mechanism to limit inflammation. Already, in the vasculare system, the ADP is a physiological agonist involved in normal hemostasis and thrombosis. Since, macrophages are key to inflammatory process, that depending on the microenvironmental stimulation exhibit proinflammatory/ defense (classical/M1) and antiinflammatory/reparatory (alternative/M2) phenotype. The objective of this study was investigate the activity and expression of the ectonuclotidases in differential macrophage phenotype and evaluate the homocysteine (Hcy) effects on theses enzymes in macrophages and platelets. . The analysis of differential macrophages in phenotype proinflamatory/ M1 and antiinflamatory/M2 showed the same expression to P1 and P2 purinoreceptors. However, change profile of the ectonucleotidases as E-NTPDase1, E-NTPDase3 and ecto-5’- nucleotidase enzymes in macrophages during phenotypic differentiation were found, suggesting that macrophages must alter the purinergic cascade during macrophages differentiation phenotypic. In the pro-inflamatory/M1 phenotype the ATP hydrolysis decreased, suggesting ATP accumulation. On the other hand, the antiinflamatory/M2 phenotype the enzymes lead to a progressive decrease in nucleotides (ATP) concentrations and an increase the adenosine availability. Already, the macrophages exposed to Hcy present a polarized pro-inflammatory profile (M1) and our findings suggest the involvement of the E-NTPDase3 and ecto-5’-nucleotidase in the inflammatory complications associates to homocysteine. In the Platelets, which are fundamental elements to the thrombogenesis process, the homocysteine decreased ADP hydrolysis. This elevation of ADP around of the platelets due inactivating of ectonucleotidase, probably by the indirect action of Hcy, may be contributing to increase thrombotic risk described in individuals with hyperhomocysteinemia. In addition, the animals that received Hcy treatment potentiate platelet aggregation induced by ADP. In conclusion, in the present study the results reinforce purinergic signaling involvement in inflammatory/thrombosis process and point to development of treatments to inflammatory/thrombotic diseases.

Os gliomas são os tumores primários mais comuns e devastadores que atingem o sistema nervoso central. O prognóstico para pacientes com estes tumores é ruim, e apesar de intensos esforços para o desenvolvimento de novas terapias, agentes efetivos ainda não estão disponíveis. A ecto-5‟-nucleotidase/CD73 (ecto-5‟-NT/CD73) regula os níveis extracelulares de AMP e adenosina, a qual tem sido amplamente descrita como fator indutor de proliferação celular. A ecto-5‟-NT/CD73 per se tem sido relatada como proteína envolvida no controle dos processos de crescimento, maturação, diferenciação, invasão e migração celular, além do processo de formação de metástases. No presente estudo nós avaliamos a atividade enzimática e as funções da ecto-5‟-NT/CD73 durante o processo proliferativo em linhagens de glioma C6 e U138-MG. Os resultados obtidos demonstram que ocorre um aumento da atividade da ecto-5‟-NT/CD73 com o aumento da confluência celular, quer seja esta obtida por semeadura de crescentes densidades celulares ou por crescentes dias de cultivo, em ambas as linhagens estudadas. As análises por RT-PCR e citometria de fluxo revelaram um aumento dos níveis de mRNA e proteína da ecto-5‟-NT/CD73, respectivamente quando comparadas culturas confluentes com culturas subconfluentes em linhagem de glioma humano U138-MG. Nesta mesma linhagem, o tratamento com 1 M de APCP, inibidor competitivo da ecto-5‟-NT/CD73 causou uma significativa redução de 20% na proliferação celular, enquanto a adenosina aumentou este processo em 25%. Por outro lado, 1 mM e 3 mM de AMP reduziram a proliferação em 29% e 42% respectivamente. Além disso, o silenciamento estável da ecto-5‟-NT/CD73 pela técnica do RNAi reduziu o processo de migração celular na linhagem de glioma humano U138-MG. Em conjunto, Estes resultados sugerem a participação da ecto-5‟-NT/CD73 na proliferação celular, sendo este processo desencadeado pela geração de adenosina (fator proliferativo), pela remoção dos níveis citotóxicos de AMP e pela participação per se da ecto-5‟-NT/CD73 como proteína de adesão. / Malignant gliomas are the most common and devastating primary tumors in the central nervous system. Despite treatment, patients with these tumors have a poor prognosis. Ecto-5‟-nucleotidase/CD73 (ecto-5‟-NT/CD73) may regulate the extracellular AMP and adenosine levels, which have been described as proliferation factor. The participation of ecto-5‟-NT/CD73 per se has been proposed as a proliferative factor, being involved in the control of cell growth, maturation, differentiation, invasion, migration and metastases processes. In the present study, we evaluate the ecto-5‟-NT/CD73 activity and functions in rat C6 and human U138-MG glioma cell lines proliferation process. Crescent confluences and culture times leads to an increase on ecto-5‟-NT/CD73 activity in both C6 and U138-MG glioma cells. RT-PCR analysis and flow cytometry showed a significant increase on ecto-5‟-NT/CD73 mRNA and protein levels respectively, when compared confluent cultures with subconfluent one in human U138-MG glioma cells. Treatment with 1 M APCP, a competitive ecto-5‟-NT inhibitor, caused a significant reduction in glioma cell proliferation of 20% for U138-MG glioma cell line. In addition, 100 M adenosine increases cell proliferation in 25% and AMP 1m M and 3 mM decrease U138-MG glioma cells proliferation in 29% and 42% respectively. The stable silencement of ecto-5‟-NT/CD73 by RNAi technique reduces cell migration in human U138-MG glioma cell line. Taken together these results suggest the participation of ecto-5‟-NT/CD73 in cell proliferation, being this process dependent of enzymatic activity generating adenosine, a proliferative factor and removing toxic levels of AMP, as well as a function as adhesive molecule.

Glioblastoma multiforme é a forma mais comum e agressiva de tumor cerebral que apresenta um severo crescimento e um comportamento altamente invasivo. Linhagens de células de glioma em cultura apresentam alta atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase que metaboliza AMP em adenosina. Em adição, ela também interage com componentes da matriz extracelular como molécula adesiva. Neste trabalho, nós avaliamos o efeito de diferentes componentes da matriz extracelular sobre a atividade da ecto-5’-nucleotidase, proliferação, adesão e migração celular na linhagem de células de glioma humano U138-MG. Os resultados obtidos mostraram uma inibição da atividade enzimática da ecto-5’- nucleotidase quando tratada com laminina sozinha e com fibronectina ou laminina em co-tratamento com dextran sulfato. O dextran sulfato mostrou reduzir a proliferação em 37%. O mesmo efeito foi observado para os co-tratamentos entre dextran/laminina (29%) e dextran/colágeno (28%). A presença de adenosina diminuiu a adesão celular em torno de 40% e o APCP aumentou a adesão em 75%. Laminina inibiu a adesão celular, já a condroitina sulfato aumentou em 70%. As células U138 apresentaram uma redução da adesão e migração celular quando tratadas apenas com dextran e também no co-tratamento deste com adenosina e APCP. Diante dos resultados podemos sugerir a modulação da atividade da ecto5’-nucleotidase e assim uma modulação da produção de adenosina por moléculas da matriz extracelular, afetando assim eventos celulares envolvidos no comportamento invasivo destas células tumorais. / Glioblastoma multiforme is the most aggressive form of brain tumor that shows a severe growth and highly invasiveness behavior. Glioma cell lines in culture present a high activity of the ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT/CD73) which metabolizes AMP to adenosine. In addition, ecto-5’-NT/CD73 also has contact with extracellular matrix components like adhesive molecule. In the present paper, we evaluate the effect of distinct extracellular matrix components on the ecto-5’- NT/CD73 activity, proliferation, adhesion and migration in U138-MG human glioma cell line. The results showed an inhibition of enzymatic activity of ecto-5’NT/CD73 in the presence of laminin, fibronectin plus dextran sulfate and laminin plus dextran sulfate. In the proliferation assay it was observed that dextran sulfate reduced the proliferation in 37% and in association with collagen type I or laminin, the proliferation was reduced too (28% and 29%, respectively). The presence of adenosina decreased of adhesion at about 40% and when treated with APCP increased in 75%. Laminin inhibited the cell adhesion and chondroitin sulfate increased in 70%. U138 cells presented reduction of adhesion and cell migration in the presence of dextran sulfate alone and in the presence of adenosine and APCP. Taken together these results suggest the modulation of ecto-5’-NT/CD73 activity and production of adenosin by extracellular matrix molecules, affecting cell events involved in the invasiveness behavior this tumor cells.

Diversas neoplasias podem atingir o sistema nervoso central e dentre elas, os tumores cerebrais são os mais prevalentes. Dentre todos os tumores cerebrais, dois merecem especial atenção: gliomas e meduloblastomas, por serem os mais recorrentes em adultos e crianças, respectivamente. O alfa-bisabolol é um pequeno álcool sesquiterpeno oleoso, que apresenta diversas atividades biológicas dentre elas, citotoxicidade. Apesar dos diversos estudos com essa molécula, pouco se sabe das atividades biológicas de seu análogo natural, o óxido de bisabolol A. Além disso, o sistema purinérgico tem sido relacionado com progressão e desenvolvimento tumoral. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de dois promissores novos agentes quimioterápicos (alfa-bisabolol e óxido de bisabolol A) e correlacionar esses efeitos com possíveis modulações do sistema purinérgico, que é considerado um novo alvo terapêutico em linhagens de glioma e meduloblastoma. Nós observamos que a atividade da ecto-5’-nucleotidase, importante enzima do sistema purinérgico, é aumentada tanto em linhagens de glioma quanto de meduloblastoma quando estas são tratadas com alfa-bisabolol. Vimos também que esse aumento na atividade deu-se por um efeito direto do tratamento sob a enzima, com uma redução da expressão do mRNA da ecto-5’-nucleotidase em linhagem de glioma e sem alteração no imunoconteúdo dessa enzima em linhagens de meduloblastoma. Em linhagens de glioma, adicionalmente, a atividade citotóxica do alfa-bisabolol foi correlacionada com estímulo ao receptor de adenosina A3. Ainda, as linhagens estudadas foram sensíveis aos tratamentos com alfa-bisabolol e óxido de bisabolol A. Em conclusão, os dados obtidos nesse trabalho demonstram que tanto o alfabisabolol quanto o óxido de bisabolol A são interesseantes novas possibilidades terapêuticas para os tumores cerebrais e que a atividade citotóxica do primeiro composto envolve modulação do sistema purinérgico. Mais estudos são necessários para entender a efetividade desses tratamentos in vivo e se o tratamento com o óxido de bisabolol A também modula o sistema purinérgico. / Among all the cancers that can affect the central nervous system, the brais tumors are the most prevalent. Two of this tumors deserve special attention: glioma and medulloblastoma once they are the most prevalent in adults and children respectively. Alpha-bisabolol is a small oily sesquiterphene alcohol that presents diverse biological activities, among them, citotoxicity. In despite of the diverse studies using this molecule, little is known about the biological activities of its natural analogue bisabolol oxide A. Besides, the purinergic system has been related to tumor development and progression. Therefore, the objective of this work was to evaluate the effect of two new promising chemotherapic agents (alpha-bisabolol and bisabolol oxide A) and correlate this effects with possible modulations of the purinergic system which is considered an interesting therapeutical target to glioma and medulloblastomas. We observed that the activity of ecto-5’-nucleotidase, an important enzyme of the purinergic system, is increased in both glioma and medulloblastoma cell lines when the cells are treated with alpha-bisabolol. It was also observed that this increase on activity was due to and direct effect of this treatment in the enzyme. Also, the treatment lead to a reduction on mRNA level of ecto-5’- nucleotidase on glioma cell line and no alterations on the imunocontent of the enzyme was observed on medulloblastoma cell lines. Additionally, the citotoxic activity of alpha-bisabolol on glioma cell line was correlated with modulation on A3 adenosine receptor. Moreover, the cell lines used in this work were sensible to the treatments with alpha-bisabolol and bisabolol oxide A. In a conclusion, the data obtained in this work demonstrate that alpha-bisabolol and bisabolol oxide A are both interesting new therapeutical possibilities to brain tumors and the citotoxic activity of the first compound is related with modulations on the purinergic system. More studies are needed to better understand the effectiveness of these treatments in vivo and if the compound bisabolol oxide A also promotes a modulation on the purinergic system.