L’objectif de ce travail est l’étude de l’impact du dioxyde de carbone (CO2) sur la physiologie et le métabolisme de la levure Saccharomyces cerevisiae, en particulier son impact sur le catabolisme oxydatif du glucose et son rôle dans le déclenchement de la transition respiro-fermentaire. Le CO2 est au coeur des interactions entre phénomènes biologiques et phénomènes physiques de transfert existant au sein d’un réacteur biologique. La compréhension de son impact sur la physiologie de la levure nécessite la connaissance de sa concentration en phase liquide et donc la maitrise des phénomènes de transfert interphasiques.Le transfert liquide / gaz du CO2 en fermenteur a été étudié par une approche couplant modélisation et expérimentation avec un effort particulier sur l’analyse intégrée des phénomènes biologiques et de transfert. En comparaison avec les hypothèses de transfert généralement admises une sursaturation du moût en CO2 dissous dans le moût a été observée lors de cultures de S.cerevisiae et attribuée à l‘existence d’une distribution asymétrique de tailles de bulles de la phase dispersée. Il a été démontré que le transfert liquide / gaz du CO2 lors d’une culture microbienne intensive ne peut être décrit par analogie avec le transfert gaz / liquide de l’oxygène et que la connaissance de la concentration en CO2 dissous ne peut être réalisée que par sa mesure directe.L’impact du CO2 sur le métabolisme oxydatif de la levure a été investigué par le suivi de la réponse dynamique de la réponse à différents incréments mesurés de la concentration en CO2 dissous en culture continue. Cette réponse est constituée d’une réponse transitoire et intense et d’une réponse à long-terme plus modérée Elle se caractérise par l’impact du CO2 sur l’énergétique cellulaire en augmentant la génération et la dissipation d’énergie ce qui est traduit à court-terme par une augmentation transitoire de +24 à +37 % des vitesses spécifiques de respiration lors d’échelons de la concentration en CO2 dissous de +2.96 et +5.29 mM et à long-terme par une diminution de 18% YATP de % lorsque la concentration en CO2 dissous augmente de 1.6 mM à 17 mM. L’effet du CO2 sur la transition respiro-fermentaire a été étudié en culture de type accélérostat en présence d’une concentration élevée en CO2 dissous. Dans ces conditions, la bascule vers le métabolisme réductif est obtenue pour un taux de croissance (0.122 h-1) et des vitesses spécifiques de respiration (5.2 mmoleO2.gX-1.h-1) inférieurs aux valeurs obtenues avec un accélérostat sans apport exogène de CO2 (0.256h-1 et 8.65 mmoleO2.gX-1.h-1) respectivement. Cette modification du métabolisme n’a pu être corrélée directement à un déficit de potentiel énergétique oxydatif et semble probablement liée à une perte de flexibilité d’adaptation à la dynamique de variation de l’environnement. / The aim of this work was to evaluate the impact of carbon dioxide (CO2) on the physiology of the yeast Saccharomyces cerevisiae, more precisely on the oxidative metabolism and on the onset of alcoholic fermentation. CO2 is involved in the interactions between transfer phenomena and biological phenomena in fermenters. The knowledge of the dissolved CO2 concentration and then of the CO2 liquid / gas mass transfer phenomena is required to assess the impact of this compound on the yeast physiology.Investigation of CO2 liquid / gas in biological reactors has been carried out using simulations and experiments taking into consideration both biological and transfer phenomena. CO2 supersaturation was observed in an intensive fed-batch culture of S.cerevisiae and may be caused by an asymmetric bubble size distribution of the gas phase. We demonstrated that CO2 liquid / gas transfer cannot be described based on O2 gas / liquid transfer and that CO2 concentration must be estimated through direct measurement.The impact of CO2 on the oxidative metabolism of S.cerevisiae was investigated using chemostat cultures submitted to different step-increases of the dissolved CO2 concentrations with direct measurement of the dissolved CO2 concentration. The yeast culture showed a transient response with an increase of the specific respiration rates ranging from with a +24 to +37 % during + 2.96 mM and+5.29 mM dissolved CO2 step-increases. This transient response was followed by a long-term response characterized by a decrease of the YATP value with increasing dissolved CO2 concentrations (down to -18% when the CO2 concentration increased from 1.6 mM to 17 mM).The impact of CO2 on the onset of the Crabtree effect in S.cerevisiae was investigated using the accelerostat technique with and without CO2 enrichment. The onset of alcoholic fermentation occurred at a much lower specific growth rate (0.122 h-1) and specific oxygen consumption rate (5.2 mmoleO2.gX-1.h-1) in CO2 enriched conditions than without CO2 enrichment (0.256h-1 and 8.65 mmoleO2.gX-1.h-1 respectively). These modifications may be linked with a decreased cellular adaptability to changing environment

Lorsque la levure Saccharomyces cerevisiae pousse en aérobiose, la respiration est immédiatement réprimée après l’addition de glucose au milieu de culture. Ce phénomène est appellé ”l’effet Crabtree”. Il a été rapporté que l’inhibition du flux respiratoire est concomitant avec l’accumulation cytoplasmique des hexoses phosphates provenant de la glycolyse. Dans ce travail, la levure Saccharomyces cerevisiae a été utilisée pour chercher à identifier les événements regulatoires à court terme qui sont associés à l’effet Crabtree ainsi que le possible rôle des hexoses phosphates dans l’inhibition de la respiration. En utilisant des mitochondries isolées il a été trouvé que le glucose 6-phosphate et le fructose 6-phosphate stimulent le flux respiratoire. Cet effet est compensé par des niveaux physiologiques de fructose 1,6-biphosphate, lequel inhibe la respiration en absence des autres hexoses phosphates. Cet effet est aussi observé in situ puisqu’il est obtenu en utiisant des sphéroplastes perméabilisés de levure. La répression du flux respiratoire induite par le fructose 1,6-biphosphate est due à une inhibition de l’activité des complexes respiratoires III et IV. Les résultats suggérent que le fructose 1,6-biphosphate pourrait être un des inducteurs de l’effet Crabtree chez la levure. Il est également possible que aussi chez les cellules mammifières cet hexose phosphate puisse réguler le metabolisme des tumeurs, où l’effet Crabtree a aussi été observé. / When the yeast Saccharomyces cerevisiae grows aerobically, its respiration is immediately repressed when adding glucose to the culture media. This phenomenon has been termed ”the Crabtree effect”. It has been reported that the respiratory flux inhibition is concomitant with the cytoplasmic accumulation of the glycolysis-derived hexoses phosphates. In this work, S. cerevisiae was used to investigate the short-term regulatory events associated to the Crabtree effect and the role of the hexoses phosphates during the respiratory inhibition. Using yeast isolated mitochondria it was found that glucose 6-phosphate and fructose 6-phosphate stimulate the respiratory flux. This was counteracted by physiological concentrations of fructose 1,6-biphosphate, which also inhibits respiration in the absence of the other two hexoses phosphate. This occurs in situ, as the effect mediated by the fructose biphosphate was also observed in yeast permeabilized spheroplasts. The respiratory flux repression mediated by fructose 1,6-biphosphate is due to an inhibition of the activity of respiratory complexes III and IV. The results suggest that fructose 1,6-biphosphate could be one of the Crabtree effect inducers in yeast. In mammals, this hexose phosphate might regulate as well tumour cell metabolism, where the Crabtree effect has also been observed.

L’objectif de ces travaux de thèse était de rechercher un potentiel effet inhibiteur de l’acide acétique endogène sur le métabolisme oxydo réductif de Saccharomyces cerevisiae, afin d’évaluer la pertinence d’une stratégie d’amélioration des capacités de production d’éthanol par la modulation de la synthèse de cet acide. Ces travaux devaient également permettre d’approfondir la compréhension des principaux facteurs commandant la synthèse de l’acide acétique et plus largement des acides organiques. La stratégie de modulation de la synthèse d’acide acétique mise en place reposait sur des approches microbiologique et génétique, consistant en l’ajout d’acide oléique et / ou de carnitine dans le milieu de culture ainsi que la surexpression du gène CIT2 ou la suppression du gène ALD6.Cette démarche a permis de montrer que, contrairement à la version exogène, l’acide acétique endogène ne présentait pas d’effet inhibiteur du métabolisme oxydo réductif de Saccharomyces cerevisiae ou qu’il était négligeable par rapport au stress éthanol. En outre, la modulation de la production de cet acide ne semble pas être une stratégie envisageable en vue de l’amélioration des capacités de production d’éthanol de cette levure, bien qu’une corrélation ait été observée entre les titres finaux de ces deux molécules.En outre, il a été montré que l’isoforme 6 de l’acétaldéhyde déshydrogénase (Ald6p) était essentiel pour assurer la croissance cellulaire normale ainsi que les mécanismes de résistance au stress éthanol dans ces conditions de culture. Plus largement, l’interrelation entre les différents isoformes ne paraissait pas aussi flexible qu’en anaérobiose. Saccharomyces cerevisiae semblait également présenter un métabolisme flexible en réponse à une modulation de la synthèse d’acide acétique. La voie des pentoses phosphates serait ainsi capable de prendre le relais de l’Ald6p pour assurer la régénération du NADPH cytosolique, bien que le flux à travers cette voie semble avoir été limité par le ratio NADP+ / NADPH. Enfin, les cellules paraissaient capables de réguler la synthèse de l’acétyl coA à partir d’acide acétique en réaction à une évolution des besoins anaboliques lors de la fin de la phase de croissance. Elles seraient toutefois incapables de pallier le manque d’acétyl coA suite à la suppression du gène ALD6. La modulation de la synthèse des acides pyruvique et succinique a également fait l’objet de discussions. / The aim of this work was to investigate a potential inhibitory effect of endogenous acetic acid on the oxido-reductive metabolism of Saccharomyces cerevisiae, to assess the relevance of a strategy based of the modulation of the synthesis of this acid, to improve ethanol production capacities. This work should also help to broaden the understanding of the main factors controlling the synthesis of acetic acid, and more generally organic acids. The strategy to modulate the synthesis of acetic acid was based on microbiological and genetic approaches, consisting in the addition of oleic acid and / or carnitine in the medium as well as the overexpression of the gene CIT2 or the deletion of the gene ALD6.This approach has shown that, contrary to exogenous version, endogenous acetic acid did not induce inhibitory effects on the oxido-reductive metabolism of Saccharomyces cerevisiae, or was negligible compared to stress caused by ethanol. Moreover, the modulation of the synthesis of this acid appear to be not an attractive strategy to improve ethanol production capacities of the yeast, although a correlation was observed between the end-culture titer of these two molecules.In addition, it has been shown that the isoform 6 of acetaldehyde dehydrogenase (Ald6p) was essential to ensure regular growth and mechanisms of ethanol stress resistance under these conditions of culture. More broadly, the interrelation between the different isoforms did not seem as flexible as under anaerobic conditions. Saccharomyces cerevisiae also seemed to have a flexible metabolism in response to a modulation of the synthesis of acetic acid. The pentose-phosphate way would be able to take over from Ald6p for regeneration of cytosolic NADPH, although the ratio NADP+ / NADPH seemed to lessen the flux through this pathway. Finally, the cells appeared to be able to regulate the synthesis of acetyl-CoA from acetic acid in response to changing in anabolic needs at the end of the growth phase. However, yeasts would be unable to overcome the lack of acetyl-CoA following the suppression of the gene ALD6. The modulation of the synthesis of pyruvic and succinic acids has also been discussed.

Nous avons étudié les relations entre les différentes voies du métabolisme énergétique lors de la mise en place des effets Crabtree et Warburg. L’effet du glucose sur le métabolisme énergétique de S. cerevisiae se traduit dans un premier temps par une inhibition cinétique du métabolisme oxydatif (effet Crabtree). Après l’ajout de glucose aux cellules, nous avons mis en évidence l’accumulation d’un intermédiaire de la glycolyse, le F1,6bP. Ceci induit une diminution drastique du rapport G6P/F1,6bP. Or, il a été montré que le G6P stimule et le F1,6bP inhibe l’activité de la chaine respiratoire mitochondriale « in-situ ». L’utilisation de mutants et la modulation de ce rapport nous a permis de montrer que l’induction de l’effet Crabtree chez la levure Saccharomyces cerevisiae est dû à une diminution du rapport G6P/F1,6bP. Parallèlement, le glucose induit un réarrangement génétique qui à terme conduit à un effet Warburg. Nous avons mis en évidence une diminution, au cours du temps du contenu mitochondrial par effet de dilution, suite à un arrêt de la biogenèse mitochondriale (répression de HAP4). Nous avons pu montrer que cette diminution quantitative des OXPHOS est sans effet sur la synthèse d’ATP cellulaire. Ceci est dû à une augmentation du flux de synthèse d’ATP glycolytique. L’utilisation de mutants HAP4", nous a permis de montrer qu’il n’y a pas de lien simple entre prolifération et répression des OXPHOS. Bien que le flux glycolytique diminue dans les conditions de maintien des OXPHOS, ceci est sans effet notoire sur la vitesse de prolifération. Ceci est un rare exemple d’une situation biologique ou l’on observe un découplage entre métabolisme énergétique et prolifération. / We used the yeast Crabtree (+) model to study the relationships between the energy metabolism pathways during the implementation of the Warburg effect. The effect of glucose on S. cerevisiae energetic metabolism results initially in a kinetic inhibition of the oxidative metabolism (Crabtree effect). Rapidly after the addition of glucose, we found an accumulation of F1, 6bP. This induces a drastic reduction in the ratio G6P / F1,6bP. Moreover, it has been shown that G6P stimulates and F1,6bP inhibits the activity of the respiratory chain "in-vitro". Mutants and the modulation of this ratio allowed us to show that the induction of the Crabtree effect is due to a decrease in the G6P / F1,6bP ratio. In parallel with the implementation of the Crabtree effect, glucose induces a genetic rearrangement that leads to a Warburg effect. We showed a decrease over time of mitochondrial enzymatic equipment by dilution effect, due to a halt of mitochondrial biogenesis (transcriptional repression of HAP4). We have been able to show that this decrease in respiratory capacity has no effect on the cellular capacity for ATP synthesis. This is due to the increase in glycolytic ATP synthesis flux. Furthermore, the use of mutants where there is no repression of mitochondrial metabolism upon glucose addition allowed us to show that there is no simple link between OXPHOS activity and cell proliferation. i.e. Mitochondrial metabolism repression/high glycolytic flux is not mandatory to allow a rapid cell proliferation. This is a rare example where energetic metabolism and cell proliferation are uncoupled.