Induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie mit Laserablation (LA-ICP-MS) wird zunehmend für die Einzelzellanalyse eingesetzt, jedoch wird eine weitere verbreitete Verbreitung durch den geringen Durchsatz behindert. Daher wurde in dieser Arbeit der Durchsatz von Einzelzellen-LA-ICP-MS untersucht und verbessert. Zunächst werden die beiden möglichen Ablationsmodi, Bildgebung und Einzelpunktanalyse (SSA), hinsichtlich ihrer analytischen Gütezahlen (Signal-Rausch-Verhältnis, Präzision, Genauigkeit, Durchsatz) verglichen. Hierfür wurden adhärente 3T3-Fibroblastenzellen mit zwei Metallfarbstoffen angefärbt und mit beiden Methoden mehrere Dutzend Zellen vermessen. SSA zeigte überlegene Eigenschaften hinsichtlich Durchsatz und Nachweisgrenzen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass >400 Zellen analysiert werden müssen, um zufriedenstellende Statistiken für einen quantitativen Vergleich der Ergebnisse zu erhalten, was als zu mühsam befunden wurde. Daher wurde ein Einzelzellen-Arraying-Schritt integriert, um eine automatisierte LA-ICP-MS-Analyse zu ermöglichen. Hierfür wurden zwei Arrayingverfahren getestet: Zunächst wurde das mikrofluidische Arraying von Zellen getestet, jedoch verhinderte das Einklemmen von weichen PDMS-Chips eine erfolgreiche Anwendung, und eine Neugestaltung des Chips wäre erforderlich. Daraufhin wurde eine neuartige Technologie getestet, die auf dem Arraying von Tröpfchen in Verbindung mit der Bilderkennung von Zellen beruht, wobei ein Anordnungsdurchsatz von 550 Zellen pro Stunde und eine beispiellose Einzelzellengenauigkeit (> 99%) gefunden wurde. In einem Proof-of-Principle-Experiment wurde ein Zellarray von THP-1-Suspensionszellen mittels LA-ICP-TOF-MS analysiert und erstmals gleichzeitig endogene und exogene Isotope einzelner Zellen als Isotopen-Fingerabdrücke von Zellen mit Nachweisgrenzen von lediglich wenigen hundert attogramm. Schließlich wurden diese Ergebnisse mit der derzeit gebräuchlichsten Analysemethode Single-Cell (sc)-ICP-MS verglichen. / Laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) is increasingly used for single-cell analysis. However, a more widespread use of LA-ICP-MS in single cell analysis is hampered by its low throughput. Hence, in this work the throughput of single cell LA-ICP-MS was studied and improved. First, the two possible ablation modes, imaging and single spot analysis (SSA) of single cells using a large laser spot, are compared regarding their analytical figures of merit (signal to noise, precision, accuracy, throughput), as well as regarding ease of operation and data evaluation. For that, adherent 3T3 fibroblast cells were stained with two metal dyes and several dozen cells were measured using both modes. SSA showed superior characteristics regarding throughput and detection limits. Moreover, it was shown that >400 cells must be analyzed to reach satisfactory statistics for a quantitative comparison of results, which would have been too laborious. Thus, a single cell arraying step was integrated to enable automated LA-ICP-MS analysis. Two different arraying methods were evaluated: First, arraying via hydrodynamic front trapping of cells using a microfluidic device was tested, but clamping of soft PDMS-chips prevented successful arraying and it was concluded that a major redesign of the chip is necessary. Secondly, and a novel technology relying on a microdroplet arrayer in conjunction with image recognition of cells was tested and a moderate arraying throughput (550 cells per hour) and an unprecedented single-cell accuracy (>99%) was found. In a proof of principle experiment, a cell array of THP-1 suspension cells was analyzed using LA-ICP-TOF-MS and endogenic and exogenic isotopes of individual cells were detected for the first time simultaneously as isotopic fingerprints of cells with detection limits as low as hundred attogram. Finally, these results were compared to the currently more commonly used analysis method single-cell (sc)-ICP-MS.

Der TGFβ-Signalweg ist ein multifunktionales System, das zelluläre Prozesse reguliert, die von Proliferation und Migration bis zu Differenzierung und Zelltod reichen. Nach Ligandenbindung und Rezeptoraktivierung translozieren SMAD-Proteine zum Zellkern und induzieren die Expression zahlreicher Zielgene. Während viele Komponenten des TGFβ-Signalweges identifiziert wurden, verstehen wir noch nicht genau, wie die Aktivierung des Signalwegs in verschiedene zelluläre Antworten übersetzt wird. Da die zelluläre Antwort auf einen gegebenen Stimulus oft sogar in genetisch identischen Zellen variiert, konzentrierte ich mich auf die Messung der Signalwegaktivität auf der Einzelzellebene. Durch die Kombination fluoreszierender Reporterzelllinien mit Zeitraffer-Lebendzellmikroskopie und automatisierter Bildanalyse beobachtete ich die zytoplasmatische und nukleäre Translokation von SMADs mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in Hunderten einzelner Zellen. Unsere Experimente zeigten, dass die Signalwegaktivität in eine erste synchrone Phase der SMAD-Translokation, gefolgt von einer Adaption und einer zweiten Signalphase mit hoher Variabilität in Stärke und Dauer der nuklearen Akkumulation unterteilt werden kann. Darüber hinaus beobachtete ich, dass Zellen, die aufgrund ihrer dynamischen Eigenschaften in Subpopulationen gruppiert sind, unterschiedliche phänotypische Reaktionen zeigen. Ich war nun daran interessiert, die Netzwerkinteraktionen zu identifizieren, die diese Dynamiken formen und fokussierte mich auf den Crosstalk mit nicht-kanonischen Komponenten des TGFβ-Signalweges. Ich konnte zeigen, dass die Hemmung der MAP Kinasen p38 und ERK die zweite Signalphase spezifisch aufhebt. Diese dynamische Remodellierung führt zu Veränderungen in der Zielgenexpression und den Zellschicksalen. Dies wird zu einem tieferen Verständnis der molekularen Netzwerke führen, die die TGFβ-Signaltransduktion regulieren und Möglichkeiten eröffnen, es in erkrankten Zellen zu modulieren. / The TGFβ pathway is a multi-functional signaling system regulating cellular processes ranging from proliferation and migration to differentiation and cell death. Upon ligand binding and receptor activation, SMAD proteins translocate to the nucleus and induce expression of numerous target genes. While many components of the TGFβ pathway have been identified, we are still challenged to understand how pathway activation is translated into distinct cellular responses. As the cellular response to a given stimulus often varies even in genetically identical cells, I focused on measuring pathway activity on the single cell level. By combining fluorescent reporter cell lines with time-lapse live-cell microscopy and automated image analysis, I monitored the cytoplasmic to nuclear translocation of SMADs with high temporal and spatial resolution in hundreds of individual cells. Our experiments demonstrated that pathway activity can be divided into a first synchronous phase of SMAD translocation, followed by adaptation and a second signaling phase with high variability in the extent and duration of nuclear accumulation. Furthermore, I observed that cells clustered into subpopulations according to their dynamic features show different phenotypic responses. I was interested in identifying the network interactions that shape these dynamics and focus on crosstalk with non-canonical components of the TGFβ pathway. I could show that inhibition of the MAP kinases p38 and ERK specifically abrogates the second signaling phase. This dynamic remodeling led to changes in target gene expression and cell fate decisions. I explored the molecular mechanisms underlying this interaction of the canonical and non-canonical pathways. This will provide a deeper understanding of the molecular networks regulating TGFβ signaling and open opportunities to modulate it in diseased cells.