Orientador: Eunice Oba / Banca: Yeda Watanabe / Banca: Mayra D'Avila Assumpção / Banca: Fernanda Landim Alvarenga / Banca: Sony Dimas Bicudo / Resumo: Uma variedade de fatores extrinsecos como ions organicos, tampoes, composicao atmosferica gasosa, aminoacidos, fatores de crescimento, vitaminas, a acao de proteinas e macromoleculas desconhecidas podem afetar a viabilidade embrionaria. A implantacao de um sistema artificial de manutencao e desenvolvimento embrionario que simule um ambiente compativel com o fisiologico ainda e o objetivo de diversos grupos de pesquisa. O tamponamento dos meios e dependente da composicao gasosa da atmosfera de cultivo e o desenvolvimento embrionario, principalmente na fase de cultivo, sofre com as variacoes de pH verificadas durante as manipulacoes realizadas fora da estufa. Os experimentos desenvolvidos tiveram como objetivo avaliar diferentes sistemas de tamponamento para os meios de cultivo, comparando-os entre si quanto a capacidade de proporcionarem maior estabilidade de pH aos embrioes produzidos in vitro. As modificacoes propostas na composicao dos meios de cultivo foram avaliadas em duas atmosferas gasosas. Um total de 3200 ovocitos foram maturados em gotas de 100 ÊL cobertas com oleo mineral por periodo de 24 horas, agrupados em numero de 20 ovocitos por gota de meio TCM-199 com sais de Hankfs (Sigma Aldrich.), acrescido de 0,5 Êg/mL de FSH e 0,03 UI/mL de LH, 10% SFB, 20mM HEPES e antibioticos. Apos a fertilizacao, os possiveis zigotos foram submetidos ao cultivo e distribuidos de acordo com os seguintes tratamentos (T): T1: grupo controle com sistema tampao de bicarbonato de sodio do meio HTF Irvine Scientific. acrescido de aminoacidos; T2: meio SOFaa com sistema tampao composto de 25 mM de bicarbonato de sodio; T3: meio SOFaa modificado pela associacao do sistema tampao com 9 mM de bicarbonato de sodio e 4 mM de HEPES e T4: meio SOFaa modificado pela associacao do sistema tampao com 9 mM de bicarbonato de sodio e 12 mM de fosfato de sodio. Os embrioes dispostos nos (Resumo completo, clicar acesso eletronico abaixo) / Abstract: A variable interation of intrinsic and extrinsic factors such as organics ions, buffers, atmosphere composition, aminoacids, growth factors, vitamins, proteins and other unknown components may play an important role increasing the developmental potential of in vitro produced bovine embryos. The importance of the development of an artificial system to maintain embryo viability, similar and comparable with physiologic environment, has been the objective of several studies. Therefore, the majority of those studies that focus on culture media formulations were based on the physiology of in vivo produced embryo. However, the development of commercial protocols that ensure embryo quality after in vitro production (IVP) demands some adaptations while considering the differences between in vivo and in vitro produced embryos. Media buffering depends on the gaseous atmosphere utilized during culture and embryo development is sensitive to pH variation during culture, especially in manipulations in the bench. The aim of the present study was to investigate the effect of different buffer systems in the pH stability of culture medium and in the developmental capacity of IVP embryos. 3200 COCs were cultured for 24h, using 20 oocytes per 100£gL droplet in TCM 199 (with HanksLOEsalts: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), containing 10% fetal bovine serum, 20mM HEPES and antibiotics under sterile paraffin oil. After fertilization, the zygotes were cultivated according with treatments (T): T1- control group with NaHCO3 (sodium bicarbonate) in medium HTF Irvine ScientificãÊ; T2- group with 25 mM NaHCO3 in medium SOFaa; T3 LV group with 9mM NaHCO3 and 4 mM HEPES in medium SOFaa and T4 LV group with 9mM NaHCO3 and 12 mM sodium phosphate in medium SOFaa. The embryos were exposed in two ambient: atmosphere with 5% CO2 + 5% O2 + 90% N2 at 39ØX C ...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: César Roberto Esper / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação do meio de maturação com roscovitina, butirolactona I, cisteamina e b-mercaptoetanol na maturação oocitária e suas conseqüências na fecundação e desenvolvimento embrionário bovino in vitro, além da variabilidade da freqüência de danos ao DNA embrionário. Oócitos foram maturados a 38,8oC em atmosfera de 5% CO2 em ar em meio TCM-199 suplementado com 0,6% BSA, 0,5 mg FSH, 100 UI hCG e 1 mg estradiol/mL (controle - C), adicionado de 50 æM de cisteamina (CC) ou 50 æM de bmercaptoetanol (CM). O grupo padrão do laboratório (S) foi suplementado com 10% de SFB como fonte protéica. Os oócitos em meio suplementado com butirolactona I ou roscovitina foram pré-maturados por 24 horas em meio TCM-199 suplementado com 0,3% BSA, antibiótico e piruvato, de acordo com os grupos: 100 æM de butirolactona I (CB), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de cisteamina (CBC), 100 æM de butirolactona I + 50 æM de b-mercaptoetanol (CBM), 25 æM de roscovitina (CR), 25 æM de roscovitina + 50 æM de cisteamina (CRC) e 25 æM de roscovitina + 50 æM de b-mercaptoetanol (CRM). Após o cultivo de pré-maturação, foram transferidos para gotas com meio controle para maturação por 8, 16 e 24 horas, para avaliação da maturação nuclear e citoplasmática, e dosagem da [GSHi]. A fecundação foi realizada após 24 horas do início do cultivo de maturação (grupos sem inibidores), e 20 horas (grupos com inibidores). O cultivo de desenvolvimento foi realizado em meio SOF-Modificado suplementado com 0,5% de BSA e 2,5% de SFB à temperatura de 38,8ºC por 192 horas. Observou-se que a butirolactona I é capaz de bloquear a maturação meiótica de maneira reversível e mais eficiente que a roscovitina, e que os antioxidantes não interferiram na retomada da maturação nuclear...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this work was to evaluate the effects of maturation media supplementation with roscovitine, butyrolactone I, cysteamine and - mercaptoethanol on oocyte maturation and the consequences on fertilization and bovine embryo development in vitro, and also DNA damage frequency in embryos. Oocytes were matured at 38.8°C under a 5% CO2 in air environment, in TCM-199 medium supplemented with 0.6% BSA, 0.5 mg FSH, 100 IU hCG and 1 mg estradiol/mL (control group - C) and with either 50 æM cysteamine (CC group) or 50 æM b-mercaptoethanol (CM group). The standard group of the laboratory (S group) was supplemented with 10% FCS as protein source. The oocytes in which groups were pre-incubated for 24 hours with butyrolactone I and roscovitine in TCM-199 medium supplemented with 0.3% BSA, antibiotic and pyruvate were culturedaccording to the groups: 100 æM butyrolactone I (CB), 100 æM butyrolactone I + 50 æM cysteamine (CBC), 100 æM butyrolactone I + 50 æM b-mercaptoethanol (CBM), 25 æM roscovitine (CR), 25 æM roscovitine + 50 æM cysteamine (CRC) and 25 æM roscovitine + 50 æM bmercaptoethanol (CRM). After the pre-incubation, the oocytes were transferred to the control maturation medium for 8, 16 and 24 hours for evaluation of nuclear and cytoplasmic maturation and [GSHi] dosage. For IVF, the oocytes were fertilized at 24 hours after the beginning of maturation (groups without inhibition), or 20 hours (groups with inhibition). Embryo culture was in SOF-Modified medium supplemented with 0.5% BSA and 2.5% FCS at 38.8ºC for 192 hours. We observed that butyrolactone I is capable of reversibly blocking meiotic maturation more effectively than roscovitine, and that addition of antioxidants did not interferewith resumption of nuclear maturation...(Complete abstract, acess undermentioned eletronic address) / Doutor