Le récepteur à la transferrine (TfR1) est un récepteur très bien conservé au cours de l’évolution qui permet l’entrée du fer (Fe) lié à la transferrine (Fe-Tf) dans les cellules. Une fois internalisé, le fer se détache de la Tf et est exporté dans le cytoplasme tandis que le complexe Tf/TfR1 est recyclé à la membrane plasmique. Le TfR1 est internalisé par un mécanisme clathrine dépendant et peut être soit recyclé à la membrane plasmique par la voie rapide, soit être dirigé vers le compartiment endosomal de recyclage (ERC). Une fois dans l’ERC, le TfR1 peut être soit recyclé à la membrane plasmique par la voie lente, soit être dirigé vers les lysosomes. De nombreuses protéines régulent le routage des protéines internalisées comme les protéines Rab. Il s’agit de petites GTPases impliquées dans les échanges moléculaires entre les différents compartiments cellulaires.Etant la principale voie d’entrée du fer dans la cellule,le TfR1 est exprimé par la plupart des cellules et est surexprimé par les cellules hautement prolifératives dont certaines cellules cancéreuses. Le TfR1 est très étudié comme cible thérapeutique dans le développement de nouvelles stratégies anti-cancéreuses. A24 est un anticorps murin anti-TfR1 dont l’action anti-proliférative et pro-apoptotique ont été démontrées dans plusieurs hémopathies malignes.Nous nous sommes demandés comment la fixation de A24 sur le TfR1 peut produire des effets différents de la fixation de la Fe-Tf. En générant un fragment Fab, nous avons d’abord démontré que le routage du TfR1 dépend de la valence de son ligand. Nous avons ensuite démontré que la fixation monovalente du TfR1 par la Fe-Tf et le Fab induisent son recyclage sans passer par l’ERC. Nous avons également démontré que la fixation divalente du TfR1 par A24 induit son routage depuis l’ERC vers les lysosomes par une voie dépendante de Rab12. / The transferrin receptor (TfR1) is a highly conserved receptor that allows the entry of iron (Fe) linked to transferrin (Fe-Tf) into cells. Once internalized, Fe separates from the Tf and is exported in the cytoplasm whereas the complex Tf/TfR1 is recycled to the cell membrane. TfR1 is internalized by a clathrin mediated endocytosis and can be either recycled to the cell membrane through the rapid pathway or be routed towards the endosomal recycling compartment (ERC). Once in the ERC, the TfR1 can be either recycled to the cell membrane through the slow pathway or be routed towards lysosomes. Many proteins regulates the routing of internalized proteins such as Rab proteins. They are small GTPases involved in molecular exchanges between the different cellular compartments.Being the main mode of entry of iron into cells, TfR1is expressed by almost every cells and is overexpressed by highly proliferative cells including some cancer cells. TfR1 is extensively studied as a therapeutic target for the development of new anti-cancer strategies. A24 is a murine anti-TfR1 whose anti-proliferative and pro-apoptotic roles were demonstrated in several hematological malignancies.We wondered how A24 binding on TfR1 can produce different effects from Fe-Tf binding. By the manufacturing of a Fab fragment, we first demonstrated that TfR1 fate depends on its ligand’s valency. We then demonstrated that the monovalent binding of TfR1 with Fe-Tf or the Fab leads to its recycling without going through the ERC. We also showed that the divalent binding of the TfR1 by A24 leads to its routing from the ERC to lysosomes through a Rab12 dependent pathway.

Une multitude de voies endocytiques existent à la surface de la membrane plasmique, ce qui conduit à l'endocytose de la majeure partie des membranes ainsi que de leurs protéines associées, des molécules de signalisation, des facteurs de croissance et autres cargos (Smith et al. 2017). Pendant des décennies, la voie majeure dite clathrine dépendante a été la plus étudiée, Cette voie d’endocytose se caractérise par la polymérisation de molécules de clathrine et de protéines adaptatrices au niveau de récepteurs liés à leurs ligands, entrainant la courbure de la membrane, avant sa scission et son endocytose (Smith et al. 2017). Récemment, plusieurs mécanismes alternatifs ont été découverts facilitant l'absorption endocytique des protéines cargo et des récepteurs membranaires, même en l'absence de la voie clathrine dépendante (Mayor et al.2014). Un modèle d'endocytose qui ne requiert pas de clathrine mais à la place des galectines et des glycolipides a été proposé par le groupe de Ludger Johannes (Lakshminarayan et al. 2014). Les galectines sont des lectines qui se lient aux bêta-galactosides et qui, à ce jour, regroupent 15 membres (galectine-1 à galectine-15) chez les mammifères et sont retrouvées dans de nombreux types de cellules et tissus (Leffler et al., 2004). Les galectines sont probablement sécrétées extra-cellulairement par une voie inconnue et non-classique (Hughes, 1999). Les glycosphingolipides (GSL) sont des constituants membranaires ubiquitaires, divisés en fractions neutres ou acides. Le terme GSL s'applique aux composés contenant au moins un monosaccharide et une céramide. Il est à noter que l’enzyme UDP-glucose céramide glucosyltransférase (Ugcg) catalyse l’étape initiale de la biosynthèse de GSLs à base de glycosylcéramides.Notre modèle de travail actuel, impliquant les glycolipides et les lectines, a été qualifié d'hypothèse GL-Lect (Johannes et al. 2016), et préliminairement soutenu par des données expérimentales comme décrit par Lakshminarayan et al. en 2014. Il peut être décrit comme suit:i) le monomère Gal3 se lie aux glycoprotéinesii) Gal3 commence alors à oligomériseriii) Gal3 oligomérisé a la capacité de se lier aux glycosphingolipides, ce qui peut induire la formation de clusters de GSLsiv). Ces clusters Gal3-GSL induisent une invagination de la membrane plasmique, une endocytose des protéines cargo liées à Gal3 et la formation subséquente de CLIC (clathrin-independent carriers ), endosomes pré-précoces.Selon ce modèle, l’oligomère Gal3 est capable de se lier aux GSLs et d’induire une déformation de la membrane de la même manière qu’une autre lectine, la sous-unité pathogène shiga toxine-B (STxB). Par conséquent, les deux processus pourraient être résumés sous la même hypothèse GL-Lect, où GL représente les glycosphingolipides (Gb3 pour STxB et des GSLs non identifiés pour Gal3) et Lect corresponds aux lectines (STxB, Gal3 et éventuellement d'autres). Comprendre si les voies d'internalisation indépendantes de la clathrine, mais dépendantes de la galectine 3, sont conservées, non seulement pour les modèles in vitro mais également in vivo, est un défi majeur dans le domaine du trafic cellulaire.Nous avons caractérisé, pour la première fois, un nouveau mécanisme dans l’intestin facilitant le transport endocytique d’un cargo. Ce mécanisme est conduit par la Galectine 3 et agit dans les entérocytes intestinaux dans le processus analogue de transcytose et dépend des glycosphingolipides. En effet, nous avons découvert que la lactotransferrine (LTF), un cargo de Gal3 que nous avons identifié par Mass spec, dépendait fortement de la Galectine3 pour son endocytose efficace, et des GSLs pour son mode de distribution analogue à la transcytose. Sur la base de ces découvertes dans l'épithélium intestinal de souris, nous avons établi un système modèle in vivo fonctionnel dans lequel le mécanisme endocytique récemment proposé, appelé dans notre laboratoire GL-Lect, a été étudié physiologiquement. / A host of endocytic pathways exist at the surface of eukaryotic cells, which lead to the internalization of the bulk of membranes along with membrane proteins, signaling receptors, growth factors, and other cargoes (Smith et al. 2017). For decades, the clathrin-mediated pathway has been the major well characterized endocytic process where clathrin polymerizes along with the associated adaptor proteins to include ligand-bound receptors, leading to membrane bending, membrane scission, and endocytosis (Smith et al. 2017). Recently, multiple alternative mechanisms have been uncovered which facilitate the endocytic uptake of cargo molecules and membrane receptors even in the absence of clathrin machinery (Mayor et al.2014). A model of endocytosis that doesn’t require clathrin but rather sugar-binding galectins and glycolipids has been proposed by my host laboratory (Lakshminarayan et al. 2014). Galectins constitute a family of beta-galactoside–binding lectins, which to date consists of 15 members in mammals. Galectins are broadly distributed in a variety of cells and tissues (Leffler et al. 2004). They are translocated from the cytosol to the extracellular space by a process of non-classical secretion (Hughes 1999). Glycosphingolipids (GSLs) are ubiquitous membrane constituents that are subdivided in neutral or acidic fractions. The term GSLs applies to compounds that contain at least one monosaccharide and a ceramide. Of note, the enzyme UDP-glucose ceramide glucosyltransferase (Ugcg) catalyzes the initial step for the biosynthesis of glycosylceramide-based GSLs.Our current working model, which involves glycolipids and lectins, was termed the GL-Lect hypothesis (Johannes et al. 2016). It is backed up by experimental data as described in Ref. (Lakshminarayan et al. 2014) and can be described as follows:i) Monomeric Gal3 binds to glycoproteinsii) Gal3 then starts to oligomerizeiii) Oligomerized Gal3 has the capacity to bind to glycosphingolipids and this may induce clustering of GSLsiv) Gal3-GSL cluster are inducing the invagination of the plasma membrane to generate tubular endocytic pits from which clathrin-independent carriers (CLICs, which are pre-early endosomes) are generated.Oligomeric Gal3 is indeed able to bind to GSLs and to induce membrane deformation (Lakshminarayan et al. 2014) in a similar way the pathogenic lectin Shiga toxin-B subunit (STxB) does. Therefore, both processes could be summarized under the same hypothesis, the GL-Lect hypothesis, where GL stands for the glycosphingolipids (Gb3 for STxB and gangliosides for Gal3) and Lect summarizes the lectins (STxB, Gal3 and possibly others as well).Understanding if this clathrin-independent but Gal3-dependent internalization mechanism is conserved not only in vitro model systems but in vivo is a main challenge in the field of trafficking.We characterized for the first time that in the gut a new mechanism facilitates endocytic uptake of cargo. This mechanism is driven by Galectin3 and operates in intestinal enterocytes for transcytosis like process and is glycosphingolipid dependent. Indeed, we have found that the lactotransferrin (LTF), a Gal3 cargo that we have identified by Mass spec, strongly required Gal3 and GSLs for its efficient endocytosis and its transcytosis like distribution pattern, respectively. Based on these findings in mouse intestinal epithelium, we established a functional in vivo model system where the newly proposed endocytic mechanism termed in our lab as GL-Lect, was physiologically investigated.

La migration cellulaire est un processus fondamental au maintien des fonctions physiologiques de l’organisme. Elle est également centrale dans de nombreuses pathologies et entre notamment en jeu lors de la dissémination métastatique. Lorsqu’elles migrent, les cellules utilisent des structures d’adhésion afin de s’appuyer sur leur environnement. Nous avons récemment montré que les puits recouverts de clathrine, plus connus pour leur rôle dans l’endocytose, peuvent également servir de structures d’adhésion. Dans ce manuscrit, je démontre que certains ligands internalisés par la voie d’endocytose clathrine peuvent également se lier à la matrice et orienter la migration cellulaire en régulant les structures adhésives de clathrine.J’ai commencé par montrer que le collagène est associé à plus de structures de clathrine et a plus de protrusions lorsqu’il est recouvert par des ligands. J’ai ensuite montré que les cellules appliquaient plus de forces sur des fibres de collagènes décorées par des ligands et que ce surplus de force nécessite la présence de structures de clathrine. Enfin j’ai montré que les cellules suivent les ligands liés à des réseaux de collagène en 3D et que cette migration dirigée nécessite également la présence de structures de clathrine. Ce mécanisme de migration pourrait notamment permettre aux cellules de suivre des gradients de ligands liés à la matrice in vivo et ainsi de s’orienter dans l’organisme. / Cell migration is a fundamental process in the development and homeostasis of multicellular organisms. It is also central to many pathologies and it is especially important for metastatic dissemination. When migrating, cells use adhesion structures to push on their substrate in order to move forward. We recently showed that clathrin coated structures, primarily known as endocytic structures, can also serve as adhesion structures. In this manuscript, I show that some ligands internalized through clathrin mediated endocytosis can also bind to the extracellular matrix and orient cell migration using adhesive clathrin structures.I first showed that ligand-decorated collagen fibers are associated with more clathrin structures and more protrusions. I then showed that cells applied more forces to the ligand-decorated collagen fibers and this extra amount of forces requires the presence of clathrin structures. Finally, I showed that cells can migrate following collagen-bound ligands in 3D, this directed migration also requiring the presence of clathrin structures. Such migration mechanism could be used by cells to follow in vivo gradient of matrix-bound ligands and thus find their way when migrating inside the body.

La neurotransmission nécessite la fusion de vésicules synaptiques (VS) avec la membrane pré-synaptique pour libérer les neurotransmetteurs qui vont activer les récepteurs du neurone post-synaptique. Le nombre de VS dans le bouton pré-synaptique est limité, ce qui nécessite des mécanismes efficaces pour régénérer ces vésicules. Parmi ces mécanismes, il existe l’endocytose dépendante de la clathrine, l'endocytose ultra-rapide et l'endocytose de masse (ADBE), ces deux dernières étant indépendantes de la clathrine. Dans cette étude, il est montré que l'absence d'Alix (ALG-2 interacting protein-X) entraîne des modifications morphologiques et fonctionnelles des synapses qui pourraient être la conséquence d’un recyclage défectueux des VS. Nous avons récemment montré que Alix et l’un de ses partenaires, l'endophiline-A, sont essentiels pour l'endocytose indépendante de la clathrine dans les fibroblastes, ce qui nous amène à penser que Alix pourrait jouer le même rôle dans le bouton pré-synaptique. Au cours de ce travail, j’ai montré que Alix se concentre au niveau des boutons pré-synaptiques après une stimulation à haute fréquence des neurones. En utilisant des formes mutantes d’Alix, j’ai montré que le recrutement d’Alix à la membrane pré-synaptique était dépendant de son interaction avec ALG-2 (protéine de liaison au calcium). De même la relocalisation de l’endophiline-A à la synapse est dépendante de son interaction avec Alix. Par ailleurs, l’absence d'Alix dans les neurones conduit à une altération de l'ADBE, qui peut être restaurée par l'expression d'Alix, mais pas avec ses mutants incapables d'interagir avec ALG-2 ou l'endophiline-A.Les résultats de cette étude démontrent qu'Alix est important pour l'endocytose indépendante de la clathrine dans les synapses, processus indispensable au recyclage des vésicules synaptiques au cours d'une activité neuronale normale. / Neurotransmission involves the fusion of synaptic vesicles (SVs) to the presynaptic membrane to release neurotransmitters that will bind receptors on the postsynaptic neuron. The number of SVs in central nerve terminals is limited, necessitating a set of reliable mechanisms to regenerate SVs. Among such mechanisms are clathrin-mediated endocytosis, ultrafast endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis (ADBE), where the latter two are clathrin-independent. The present study reveals that the depletion of Alix (ALG-2 interacting protein-X) leads to morphological and functional changes of synapses that indicate defective SV recycling. Our recent finding that Alix and its major partner, endophilin-A, is crucial for clathrin-independent endocytosis in fibroblasts, led us to hypothesise that Alix may have such a role at the presynapse. The present study has allowed us to demonstrate that Alix concentrates at presynaptic boutons during intense stimulation. Using mutant forms of Alix, we demonstrate that this recruitment of Alix is depends on the ability of Alix to interact with the calcium binding protein, ALG-2. Endophilin-A is also recruited to presynaptic boutons and this recruitment is dependent on its capacity to interact with Alix. It is then revealed that the lack of Alix in neurons leads to impaired ADBE, suggesting the importance of Alix in ADBE. Such a role of Alix depends on its ability to interact with ALG-2 and endophilin since the impairment of ADBE was reversed upon rescuing the expression of wild-type Alix, but not with Alix mutants unable interact with ALG-2 or endophilin-A.The findings of this study demonstrate that Alix is important for clathrin-independent endocytosis at synapses, a process necessary for the recycling of synaptic vesicles during normal neuronal activity.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(薬科学) / 甲第21045号 / 薬科博第88号 / 新制||薬科||10(附属図書館) / 京都大学大学院薬学研究科薬科学専攻 / (主査)教授 髙倉 喜信, 教授 山下 富義, 教授 小野 正博 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Pharmaceutical Sciences / Kyoto University / DFAM

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化学シナプスにおいて、シナプス小胞内に蓄えられた神経伝達物質の開口放出によってシナプス伝達が起こる。開口放出後、シナプス小胞はエンドサイトーシスによって細胞内へ回収されて再利用される。膜容量測定法とpHイメージングを併用して、開口放出とエンドサイトーシスに伴う小胞膜および小胞タンパク質の動態を同時測定した。Ca2+-カルモジュリン-Munc13シグナリングが小胞タンパク質の回収に関与していることが示唆された。 / Neurotransmitter is released at synapses by fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane. To sustain synaptic transmission, membranes and vesicular proteins has to be retrieved for reuse. I have combined capacitance measurements and pH-imaging via a pH-sensitive vesicular protein marker, and compared the retrieval kinetics of membranes and synaptotagmin2 (Syt2) at the calyx of Held presynaptic terminal. Data in this thesis identifies a novel mechanism of stimulus- and Ca2+-dependent regulation of coordinated endocytosis of synaptic membranes and Syt2. / 博士(理学) / Doctor of Philosophy in Science / 同志社大学 / Doshisha University

Bovine Parvovirus (BPV) belongs to the genus Bocavirus, family Parvoviridae. BPV is the leading etiologic agent among the pathogens that cause primary gastroenteritis of cattle. Many of the intracellular events associated with virus replication are unknown. In this research project, we investigated BPV internalization into the host cell and trafficking in the cytosol. Preliminarily, EBTr cells had abundant clathrin, virus attached to purified clathrin, and EM micrographs revealed virus in endocytic vacuoles. Assays detecting virus infectivity (i.e. viral protein synthesis), virus production (completion of the replication cycle), and quantitative PCR (qPCR) to detect viral transcripts were used to evaluate virus uptake and subsequent trafficking events in the presence of selective inhibitors. Cell toxicity mediated by the drugs was evaluated by the MTT test. Virucidal effects of the drugs were assessed. A control virus was used to verify the inhibitor technology. Immunofluoresceinated virus particles were found in clathrin-rich early endosomes. Clathrin-mediated endocytosis (CME) was examined by clathrin polymerization inhibiting agent (chloropromazine), lysosomotropic agents (ammonium chloride and chloroquine), a vacuolar ATPase inhibitor (bafilomycin A1), and a blocker of transition between endosomes (brefeldin A). Caveosome pathway inhibitors included phorbol 12-myristate 13-acetate (a suppressor of caveolae formation), nystatin and methyl-beta-cyclodextrin (lipid raft blockers), and genistein (a tyrosine kinase phosphorylation inhibitor). Trafficking of BPV was investigated using specific inhibitors of proteasomal activity, actin-myosin function, and microtubule-dynein function. The proteasomal protease suppressor (lactacystin), and a proteasomal chymotrypsin inhibitor (epoxomicin) were used. The role of actin was probed by cytochlasin D, latrunculin A, and ML-7. The microtubule inhibitors nocodazole, vanadate, and EHNA were used to probe microtubule function. The inhibitors of CME reduced virus production and reduced infectivity, a result confirmed by qPCR. The blockers of caveolin-mediated entry did not interfere with virus production nor virus infectivity. Proteasome activity blockage did not affect the virus replication. But the virus cycle was affected by actin blockage and by microtubule blockage detected by qPCR. Taken together these data indicate that BPV uptake is mediated by clathrin coated pits and is acid-dependent. Further processing of BPV in the cytosol does not require proteasomal enzymes. Actin-associated vesicular transport appears to be essential to virus replication and trafficking to the nucleus appears to be mediated by microtubules.