Os fungos endofíticos têm sido reconhecidos pela sua grande importância para as plantas hospedeiras, pois podem conferir proteção contra insetos herbívoros e patógenos, promover o crescimento vegetal, além de produzir metabólitos secundários com atividades biológicas diversas, entre outros. A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância social e econômica no Brasil, especialmente para o estado de São Paulo. Ultimamente esta cultura vem recebendo especial atenção devido ao crescente aumento da demanda de matéria prima, principalmente em função do acréscimo no consumo de etanol como biocombustível. Fungos do gênero Penicillium habitam os tecidos e a rizosfera de cana-de-açúcar, onde podem estabelecer associações mutualísticas com a planta e conferir diversos benefícios. Dentro deste contexto, estudos que avaliem a interação de Penicillium spp. com cana-de-açúcar são bastante promissores para geração de conhecimentos que auxiliem na otimização da agricultura. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivos a avaliação do potencial biotecnológico dos endofíticos de raiz e da rizosfera, do gênero Penicillium, pertencentes à comunidade fúngica de cana-de-açúcar, por meio de ensaios de antagonismo, produção de enzimas, solubilização de fosfato inorgânico e produção de ácido indol acético; assim como o estudo da interação de um isolado de P. pinophilum com cana-de-açúcar a partir do desenvolvimento de um sistema de transformação genética mediada pela bactéria Agrobacterium tumefaciens. Tanto a análise da atividade antimicrobiana como a produção de metabólitos apresentaram extensa variação fisiológica entre os isolados avaliados. Um isolado da espécie P. pinophilum (linhagem 44) foi escolhido para ser usado na transformação genética por mostrar-se superior estatisticamente em relação aos demais isolados nos ensaios anteriores. Para aumento da eficiência deste sistema de transformação foram avaliados diferentes parâmetros, dentre eles: tempo de co-cultivo (24 e 48 horas), concentração do indutor acetoseringona (200 M e 400 M) e tipos de membrana (papel filtro e náilon). O sistema de agrotransformação apresentou alta eficiência (482 transformantes por 107 conídios), gerando uma elevada quantidade de transformantes resistentes à higromicina B e expressando GFP. Dentre os parâmetros avaliados, a combinação que deu origem aos melhores resultados de transformação envolveu o co-cultivo por 48 horas sobre membrana de náilon, em meio de cultura contendo 200 M de acetoseringona. A interação fungo-planta foi avaliada a partir da inoculação de P. pinophilum linhagem selvagem e transformantes, em plântulas de cana-de-açúcar, seguida da análise por microscopia óptica de epifluorescência e reisolamento. Os resultados revelaram a natureza não patogênica desse fungo, uma vez que ele foi capaz de colonizar endofiticamente cana-de-açúcar e persistir nas raízes desta planta, sem levar ao desenvolvimento de qualquer sintoma de doença. Além disso, os ensaios de agrotransformação deram origem a uma biblioteca com mil e cem transformantes insercionais, o que constitui uma ferramenta importante para o estudo molecular do metabolismo secundário desse fungo endofítico e poderá contribuir para o entendimento da interação do complexo fungo-cana-de-açúcar, possibilitando no futuro a sua aplicação no melhoramento vegetal e exploração do seu potencial biotecnológico. / Endophytic fungi have been recognized for its great importance for the host plants, they may provide protection against herbivores and pathogens, promote plant growth, and produce secondary metabolites with biological activity, among other benefits. Sugarcane is a socially and economically important crop in Brazil, especially for the state of São Paulo. Lately, this culture has received special attention due to the growing demand for raw materials, mainly due to the increase in consumption of ethanol as a biofuel. Fungi Penicillium inhabit the tissues and rhizosphere of sugarcane, where they can establish mutualistic associations with the plant and provide several benefits. Within this context, studies evaluating the interaction of Penicillium spp. with sugar cane are very promising to generate knowledge in order to assist in the agriculture optimization. Thus, this study aimed to evaluate the biotechnological potential of endophytic Penicillium from root and rhizosphere, belonging to the fungal community of sugarcane, through tests of antagonism, enzyme production, solubilization of inorganic phosphate and indole acetic acid production, as well as studying the interaction of an isolate of P. pinophilum with sugarcane using the development of a system for genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Both the analysis of antimicrobial activity and the production of metabolites showed extensive physiological variation among isolates. An isolate of the species P. pinophilum (strain 44) was chosen to be used in genetic transformation for being statistically superior than the other strains in previous trials. Different parameters were evaluated to increase the efficiency of this transformation system, among them: co-culture time (24 and 48 hours), concentration of the inducer acetosyringone (200 µM and 400 µM) and types of membrane (filter paper and nylon). Agrotransformation system showed high efficiency, generating a high amount of hygromycin B resistant transformants that expressed GFP. Among the factors evaluated, the combination that showed the best results involved the transformation with a co-cultivation for 48 hours on a nylon membrane, in culture medium containing 200 µM of acetosyringone. The plant-fungus interaction was assessed from the inoculation of wild type and transformants P. pinophilum in seedlings of sugarcane followed by analysis by epifluorescence microscopy and reisolation. Results revealed the non-pathogenic nature of this fungus, since it was capable of endophytically colonize sugarcane and persisted in the roots of this plant, without developing any symptoms of illness. In addition, agrotransformation tests gave rise to a library with a thousand and one hundred insertional transformants, which is an important tool for molecular study of secondary metabolism of endophytic fungus, and may contribute to the comprehension of the complex interaction of fungus-sugarcane, allowing its future application in plant breeding and exploitation of their biotechnological potential.

Os fungos endofíticos têm sido reconhecidos pela sua grande importância para as plantas hospedeiras, pois podem conferir proteção contra insetos herbívoros e patógenos, promover o crescimento vegetal, além de produzir metabólitos secundários com atividades biológicas diversas, entre outros. A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância social e econômica no Brasil, especialmente para o estado de São Paulo. Ultimamente esta cultura vem recebendo especial atenção devido ao crescente aumento da demanda de matéria prima, principalmente em função do acréscimo no consumo de etanol como biocombustível. Fungos do gênero Penicillium habitam os tecidos e a rizosfera de cana-de-açúcar, onde podem estabelecer associações mutualísticas com a planta e conferir diversos benefícios. Dentro deste contexto, estudos que avaliem a interação de Penicillium spp. com cana-de-açúcar são bastante promissores para geração de conhecimentos que auxiliem na otimização da agricultura. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivos a avaliação do potencial biotecnológico dos endofíticos de raiz e da rizosfera, do gênero Penicillium, pertencentes à comunidade fúngica de cana-de-açúcar, por meio de ensaios de antagonismo, produção de enzimas, solubilização de fosfato inorgânico e produção de ácido indol acético; assim como o estudo da interação de um isolado de P. pinophilum com cana-de-açúcar a partir do desenvolvimento de um sistema de transformação genética mediada pela bactéria Agrobacterium tumefaciens. Tanto a análise da atividade antimicrobiana como a produção de metabólitos apresentaram extensa variação fisiológica entre os isolados avaliados. Um isolado da espécie P. pinophilum (linhagem 44) foi escolhido para ser usado na transformação genética por mostrar-se superior estatisticamente em relação aos demais isolados nos ensaios anteriores. Para aumento da eficiência deste sistema de transformação foram avaliados diferentes parâmetros, dentre eles: tempo de co-cultivo (24 e 48 horas), concentração do indutor acetoseringona (200 M e 400 M) e tipos de membrana (papel filtro e náilon). O sistema de agrotransformação apresentou alta eficiência (482 transformantes por 107 conídios), gerando uma elevada quantidade de transformantes resistentes à higromicina B e expressando GFP. Dentre os parâmetros avaliados, a combinação que deu origem aos melhores resultados de transformação envolveu o co-cultivo por 48 horas sobre membrana de náilon, em meio de cultura contendo 200 M de acetoseringona. A interação fungo-planta foi avaliada a partir da inoculação de P. pinophilum linhagem selvagem e transformantes, em plântulas de cana-de-açúcar, seguida da análise por microscopia óptica de epifluorescência e reisolamento. Os resultados revelaram a natureza não patogênica desse fungo, uma vez que ele foi capaz de colonizar endofiticamente cana-de-açúcar e persistir nas raízes desta planta, sem levar ao desenvolvimento de qualquer sintoma de doença. Além disso, os ensaios de agrotransformação deram origem a uma biblioteca com mil e cem transformantes insercionais, o que constitui uma ferramenta importante para o estudo molecular do metabolismo secundário desse fungo endofítico e poderá contribuir para o entendimento da interação do complexo fungo-cana-de-açúcar, possibilitando no futuro a sua aplicação no melhoramento vegetal e exploração do seu potencial biotecnológico. / Endophytic fungi have been recognized for its great importance for the host plants, they may provide protection against herbivores and pathogens, promote plant growth, and produce secondary metabolites with biological activity, among other benefits. Sugarcane is a socially and economically important crop in Brazil, especially for the state of São Paulo. Lately, this culture has received special attention due to the growing demand for raw materials, mainly due to the increase in consumption of ethanol as a biofuel. Fungi Penicillium inhabit the tissues and rhizosphere of sugarcane, where they can establish mutualistic associations with the plant and provide several benefits. Within this context, studies evaluating the interaction of Penicillium spp. with sugar cane are very promising to generate knowledge in order to assist in the agriculture optimization. Thus, this study aimed to evaluate the biotechnological potential of endophytic Penicillium from root and rhizosphere, belonging to the fungal community of sugarcane, through tests of antagonism, enzyme production, solubilization of inorganic phosphate and indole acetic acid production, as well as studying the interaction of an isolate of P. pinophilum with sugarcane using the development of a system for genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Both the analysis of antimicrobial activity and the production of metabolites showed extensive physiological variation among isolates. An isolate of the species P. pinophilum (strain 44) was chosen to be used in genetic transformation for being statistically superior than the other strains in previous trials. Different parameters were evaluated to increase the efficiency of this transformation system, among them: co-culture time (24 and 48 hours), concentration of the inducer acetosyringone (200 µM and 400 µM) and types of membrane (filter paper and nylon). Agrotransformation system showed high efficiency, generating a high amount of hygromycin B resistant transformants that expressed GFP. Among the factors evaluated, the combination that showed the best results involved the transformation with a co-cultivation for 48 hours on a nylon membrane, in culture medium containing 200 µM of acetosyringone. The plant-fungus interaction was assessed from the inoculation of wild type and transformants P. pinophilum in seedlings of sugarcane followed by analysis by epifluorescence microscopy and reisolation. Results revealed the non-pathogenic nature of this fungus, since it was capable of endophytically colonize sugarcane and persisted in the roots of this plant, without developing any symptoms of illness. In addition, agrotransformation tests gave rise to a library with a thousand and one hundred insertional transformants, which is an important tool for molecular study of secondary metabolism of endophytic fungus, and may contribute to the comprehension of the complex interaction of fungus-sugarcane, allowing its future application in plant breeding and exploitation of their biotechnological potential.

O Brasil é líder absoluto no comércio internacional de suco de laranja concentrado congelado participando com 82% do volume comercializado no mundo. Guignardia citricarpa é um fungo Ascomiceto agente causal da Mancha Preta dos Citros (MPC), uma doença importante no contexto da Citricultura, causando lesões negras em frutos tornando-os impróprios para a exportação, já que não são aceitos na União Européia pois o patógeno é classificado como quarentenário. O presente trabalho teve como objetivo principal estabeler a metodologia de transformação genética de G. citricarpa para futuramente auxiliar no entendimento dos mecanismos de patogenicidade desta espécie, visando diminuir perdas na citricultura brasileira devido à MPC. Além disso, foi realizada uma análise do gene da enzima endopoligalacturonase, a qual está associada à capacidade de patógenos em colonizar plantas. Para elucidar esse fenômeno, foi realizada a busca de genes relacionados à patogenicidade em outros fungos fitopatogênicos previamente descritos e confirmados participarem no processo de doenças em diversas plantas. Considerando que esses genes possuem uma região conservada para esse fim, após o alinhamento dessas sequências foram construídos primers e o gene de endopoligalacturonase foi identificado no gênero Guignardia sp. Outra espécie pertencente a esse gênero é G. mangiferae, conhecida como endófito de citros, ou seja, coloniza os tecidos internos da planta hospedeira sem causar dano. Em análises enzimáticas foi observado que a quantidade de endopoligalacturonase produzida pela espécie patogênica é superior à da espécie endofítica, mostrando que essa enzima pode participar do processo de patogenicidade de G. citricarpa. Estudos para comprovar a participação de genes nos mecanismos de patogenicidade em diversas espécies utilizando reconhecimento de genes e genômica funcional, expressão e knockout de genes estão sendo realizados, permitindo uma visão geral da organização genômica do sistema patogênico. Pensando nisso, esse trabalho descreve pela primeira vez a metodologia de transformação genética de G. citricarpa via micélio e a obtenção de transformantes expressando a proteína verde fluorescente (GFP). Micélios do fungo foram transformados pelo sistema via Agrobacterium tumefaciens com o plasmídeo pFAT-gfp, contendo os genes de resistência à higromicina B (hgr) e da GFP. A otimização do protocolo de agrotransformação foi realizada a partir do teste de diferentes condições como: tipo de membrana, concentração de agente indutor e tempo de cocultivo. A melhor condição incluiu a utilização de membrana de éster de celulose; 200 PM de AS e 96 horas de co-cultivo. Os transformantes apresentaram alta estabilidade mitótica (82%) e tiveram a inserção do gene hgr confirmada por PCR e do gfp observada em microscopia óptica de epifluorescência. Além disso, foi acompanhado o desenvolvimento do fungo inoculado em frutos, mostrando a interação planta-patógeno. O estabelecimento do sistema de transformação por Agrobacterium para G. citricarpa possibilita o uso dessa ferramenta para estudos de mutagênese insercional e interrupção gênica visando a identificação de genes importantes, como os envolvidos com os mecanismos de patogenicidade utilizados por esse fungo. / Brazil is the world leader in the international trade of frozen orange juice concentrate, taking part with around 82% of the traded volume. Guignardia citricarpa (anamorph Phyllosticta citricarpa) is a fungal pathogen of citrus plants, being described as the causal agent of citrus black spot (CBS), one of the most important fungal diseases of citrus worldwide. Its symptoms are black lesions on fruit, making them unsuitable for the international fresh market, since they are included in the quarantine list of the European Plant Protection Organization (EPPO). Moreover, when the disease is severe it may cause extensive premature fruit drop that reduces yields of fruit for processing. Taking this into consideration, the current work aimed to improve the understanding on the pathogenic mechanisms of this fungus. Firstly, in an attempt to elucidate this phenomenon, it was performed a search for pathogenicity genes previously reported to some pathogenic fungi and confirmed to participate in the process of infection in many plants , especially endopolygalacturonase. Primers were designed using the conserved regions of the genes and allowed the identification of the Guignardia spp. endopolygalacturonase gene for the first time. This enzyme has been described as playing important role in the process of fungal diseases in plants. In the present work, enzymatic analysis showed that the pathogen G. citricarpa produced significantly greater amounts of endopolygalacturonase when compared to G. mangiferae, a closely related fungus described as a citrus endophyte. This result suggests that this enzyme may participate in the process of pathogenicity, characteristic of the pathogenic species. Genetic transformation methods have been used to prove the involvement of genes in pathogenic mechanisms, however, a suitable methodology for G. citricarpa has not been described yet. In this way, this study describes for the first time a methodology for genetic transformation of G. citricarpa via mycelia and the successful generation of transformants expressing the green fluorescent protein (GFP) and resistant to the hygromycin B antibiotic. Mycelia of the fungus were genetically transformed via Agrobacterium tumefaciens hosting the plasmid pFAT-gfp, which carries the genes for resistance to hygromycin B (hph) and for GFP (gfp). The protocol was optimized through different test conditions (type of membrane, concentration of the inducing agent acetosyringone and duration of the co-cultivation period). The higher transformation efficiencies were observed using cellulose ester membrane, 200 PM of acetosyringone and 96 hours of cocultivation. The transformants showed high mitotic stability (82%) and the insertion of the T-DNA was confirmed by PCR and GFP expression through epifluorescence microscopy observation. Moreover, it was observed the development of the fungus in inoculated oranges, showing the plant-pathogen interaction observed by epifluorescense microscopy. The establishment of the Agrobacterium-mediated transformation system for G. citricarpa represents an important step on the search for unveiling important genes of this fungus, such as those involved in the pathogenic mechanisms.

O Brasil é líder absoluto no comércio internacional de suco de laranja concentrado congelado participando com 82% do volume comercializado no mundo. Guignardia citricarpa é um fungo Ascomiceto agente causal da Mancha Preta dos Citros (MPC), uma doença importante no contexto da Citricultura, causando lesões negras em frutos tornando-os impróprios para a exportação, já que não são aceitos na União Européia pois o patógeno é classificado como quarentenário. O presente trabalho teve como objetivo principal estabeler a metodologia de transformação genética de G. citricarpa para futuramente auxiliar no entendimento dos mecanismos de patogenicidade desta espécie, visando diminuir perdas na citricultura brasileira devido à MPC. Além disso, foi realizada uma análise do gene da enzima endopoligalacturonase, a qual está associada à capacidade de patógenos em colonizar plantas. Para elucidar esse fenômeno, foi realizada a busca de genes relacionados à patogenicidade em outros fungos fitopatogênicos previamente descritos e confirmados participarem no processo de doenças em diversas plantas. Considerando que esses genes possuem uma região conservada para esse fim, após o alinhamento dessas sequências foram construídos primers e o gene de endopoligalacturonase foi identificado no gênero Guignardia sp. Outra espécie pertencente a esse gênero é G. mangiferae, conhecida como endófito de citros, ou seja, coloniza os tecidos internos da planta hospedeira sem causar dano. Em análises enzimáticas foi observado que a quantidade de endopoligalacturonase produzida pela espécie patogênica é superior à da espécie endofítica, mostrando que essa enzima pode participar do processo de patogenicidade de G. citricarpa. Estudos para comprovar a participação de genes nos mecanismos de patogenicidade em diversas espécies utilizando reconhecimento de genes e genômica funcional, expressão e knockout de genes estão sendo realizados, permitindo uma visão geral da organização genômica do sistema patogênico. Pensando nisso, esse trabalho descreve pela primeira vez a metodologia de transformação genética de G. citricarpa via micélio e a obtenção de transformantes expressando a proteína verde fluorescente (GFP). Micélios do fungo foram transformados pelo sistema via Agrobacterium tumefaciens com o plasmídeo pFAT-gfp, contendo os genes de resistência à higromicina B (hgr) e da GFP. A otimização do protocolo de agrotransformação foi realizada a partir do teste de diferentes condições como: tipo de membrana, concentração de agente indutor e tempo de cocultivo. A melhor condição incluiu a utilização de membrana de éster de celulose; 200 PM de AS e 96 horas de co-cultivo. Os transformantes apresentaram alta estabilidade mitótica (82%) e tiveram a inserção do gene hgr confirmada por PCR e do gfp observada em microscopia óptica de epifluorescência. Além disso, foi acompanhado o desenvolvimento do fungo inoculado em frutos, mostrando a interação planta-patógeno. O estabelecimento do sistema de transformação por Agrobacterium para G. citricarpa possibilita o uso dessa ferramenta para estudos de mutagênese insercional e interrupção gênica visando a identificação de genes importantes, como os envolvidos com os mecanismos de patogenicidade utilizados por esse fungo. / Brazil is the world leader in the international trade of frozen orange juice concentrate, taking part with around 82% of the traded volume. Guignardia citricarpa (anamorph Phyllosticta citricarpa) is a fungal pathogen of citrus plants, being described as the causal agent of citrus black spot (CBS), one of the most important fungal diseases of citrus worldwide. Its symptoms are black lesions on fruit, making them unsuitable for the international fresh market, since they are included in the quarantine list of the European Plant Protection Organization (EPPO). Moreover, when the disease is severe it may cause extensive premature fruit drop that reduces yields of fruit for processing. Taking this into consideration, the current work aimed to improve the understanding on the pathogenic mechanisms of this fungus. Firstly, in an attempt to elucidate this phenomenon, it was performed a search for pathogenicity genes previously reported to some pathogenic fungi and confirmed to participate in the process of infection in many plants , especially endopolygalacturonase. Primers were designed using the conserved regions of the genes and allowed the identification of the Guignardia spp. endopolygalacturonase gene for the first time. This enzyme has been described as playing important role in the process of fungal diseases in plants. In the present work, enzymatic analysis showed that the pathogen G. citricarpa produced significantly greater amounts of endopolygalacturonase when compared to G. mangiferae, a closely related fungus described as a citrus endophyte. This result suggests that this enzyme may participate in the process of pathogenicity, characteristic of the pathogenic species. Genetic transformation methods have been used to prove the involvement of genes in pathogenic mechanisms, however, a suitable methodology for G. citricarpa has not been described yet. In this way, this study describes for the first time a methodology for genetic transformation of G. citricarpa via mycelia and the successful generation of transformants expressing the green fluorescent protein (GFP) and resistant to the hygromycin B antibiotic. Mycelia of the fungus were genetically transformed via Agrobacterium tumefaciens hosting the plasmid pFAT-gfp, which carries the genes for resistance to hygromycin B (hph) and for GFP (gfp). The protocol was optimized through different test conditions (type of membrane, concentration of the inducing agent acetosyringone and duration of the co-cultivation period). The higher transformation efficiencies were observed using cellulose ester membrane, 200 PM of acetosyringone and 96 hours of cocultivation. The transformants showed high mitotic stability (82%) and the insertion of the T-DNA was confirmed by PCR and GFP expression through epifluorescence microscopy observation. Moreover, it was observed the development of the fungus in inoculated oranges, showing the plant-pathogen interaction observed by epifluorescense microscopy. The establishment of the Agrobacterium-mediated transformation system for G. citricarpa represents an important step on the search for unveiling important genes of this fungus, such as those involved in the pathogenic mechanisms.