Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-28T11:23:03Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 795430 bytes, checksum: 6642533f621d46a9a7502f063b45aeea (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T11:23:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 795430 bytes, checksum: 6642533f621d46a9a7502f063b45aeea (MD5) Previous issue date: 2009-05-08 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A diversidade de leveduras endofíticas e epifíticas em frutos de café cereja das cultivares Catuaí Vermelho, Catuaí Amarelo, Bourbon Vermelho e Bourbon Amarelo em lavouras situadas a diferentes altitudes na Zona da Mata Norte em Minas Gerais, Brasil, foi estudada por metodologias dependentes e independentes de cultivo. A densidade de leveduras epifíticas e endofíticas em frutos de café é variável, menos de 25 UFC.fruto -1 a 6,5 x 10 4 UFC.fruto -1 . As 36 leveduras isoladas foram agrupadas em doze morfotipos e a árvore filogenética reconstruída com dados de sequências de bases de rDNA 26S mostrou o agrupamento com as sequências de Candida smithsonii, Pichia guilliermondii, Cryptococcus flavescens, Meira geulakonigii, Pseudozyma sp e Sporobolomyces sp., já depositadas no National Center for Biotechnology Information (NCBI). O isolado LEM 647-9, proveniente de Bourbon Vermelho, 1101 m, foi o único com identidade correspondente a Meira geulakonigii, um fungo yeast-like classificado em Ustilaginales, a mesma ordem de Pseudozyma. A ocorrência de um só morfotipo de leveduras endofíticas cultiváveis em Malt yeast glucose peptone medium (MYGP), contendo cloranfenicol, em apenas 4 amostras de café cereja é considerada baixa. As endofíticas foram identificadas com base no perfil de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME), pelo sistema de identificação Sherlock ® (MIDI), e por análise filogenética de sequências de rDNA 26S. As sequencias parciais de rDNA destes isolados mostraram identidade entre 96 e 100 % com as correspondentes a Candida, Pichia e Brettanomyces. Pela análise filogenética a maior identidade foi com Candida e Pichia. A constatação de C. diddensiae P. guilliermondii e C. parapsilosis como endofíticas em frutos de café sadios no estádio cereja se configura como relato novo sobre nicho de ocorrência das espécies. Clones de uma biblioteca de rDNA 26S obtida por amplificação de DNA metagenômico de frutos cereja da C.Vermelho, coletada a 1189 m, foram sequenciados. Doze clones mostraram 98-99% de identidade com rDNAs de fungos filamentosos. Estes correspondem a Mycosphaerella, Glomerella, Microdiplodia e Phaeophaeria e a alguns fungos filamentosos potencialmente endofíticos e ainda não identificados, cujas sequências estão presentes no GenBank. A DGGE da sucessão de leveduras associadas aos grãos de C. arabica durante os 14 dias do período de secagem natural no terreiro de cimento revelou UTOs dominantes já nos 4 primeiros dias. A análise com o programa GelCompar II ® demonstrou que o perfil de UTOs da comunidade é alterado a cada dois dias, até o 12o dia de secagem. A determinação de ocorrência e diversidade de leveduras endofíticas nos frutos de café cereja se constitui em etapa fundamental para identificar a síntese de metabólitos produzidos por esses microrganismos e para desenvolver processo biotecnológico que assegure a qualidade superior da bebida do café. / Diversity among endophytic and epiphytic yeasts in coffee cherries (Coffea arabica L.) from the cultivars Catuaí Vermelho, Catuaí Amarelo, Bourbon Vermelho, and Bourbon Amarelo, sampled from plantations located at different altitudes in the Zona da Mata Norte, Minas Gerais State, Brazil, were studied using culture-dependent and culture-independent methods. Density of epiphytic and endophitic yeasts in coffee cherries varied from less than 25 CFU. cherries -1 to 6,5.10 4 CFU.cherries -1 . Thirty six isolated yeasts were grouped in 12 morphotypes. The reconstructed phylogenetic tree, obtained with 26S rDNA sequence data, grouped the sequences with those of Candida smithsonii, Pichia guilliermondii, Cryptococcus flavescens, Meira geulakonigii, Pseudozyma sp and Sporobolomyces sp. present in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database. The isolate LEM 647-9, from Bourbon Vermelho collected at 1101 m, was identified as Meira geulakonigii, a yeast-like fungus classified among the Ustilaginales, the same order of Pseudozyma. Five yeast colonies of the same morphotype were selected and identified using the fatty acid methyl ester profiling (FAME) by the Sherlock ® identification system (MIDI). The isolates were phylogenetically clustered using 26S rDNA sequences analyses. Partial 26S rDNA sequences showed 96 % and 100 % similarity to rDNA from yeast species belonging to Candida, Pichia, and Brettanomyces. However, phylogenetic cluster analyses showed that the rDNA sequences from the isolates were more closely related to rDNA sequences from the genera Candida and Pichia. The presence of C. diddensiae, P. guilliermondii e C. parapsilosis as endophytes in wholesome coffee cherries is reported here and thus a new niche for these species. Sequencing of clones obtained from a 26S rDNA library of amplified metagenomic DNA from Catuaí Vermelho coffee cherries, collected at 1189 m, yielded 12 clones with 98-99% identity with filamentous fungi. They corresponded to the genera Mycosphaerella, Glomerella, Microdiplodia e Phaeophaeria, and also to some potentially endophytic fungi yet to be identified and that have sequences already in GenBank. DGGE fingerprint of yeasts in C. arabica during 14 days of natural drying revealed dominant OTUs already in the four first days. GelComparII analysis demonstrated that the OTU profile is altered each two days up to the 12 th day. Knowledge on the occurrence and diversity of endophytic yeasts, as well as on the secondary metabolites that they produce should contribute to the development of biotechnological processes aimed at improving the quality of coffee beverages. / Tese antiga

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2846.pdf: 2305406 bytes, checksum: bdcfa4a73d44c510ec83c2cb9347cfaf (MD5) Previous issue date: 2009-12-11 / The need for new and useful compounds to provide assistance and relief in all aspects of human condition is ever-growing. Drug resistance in bacteria, the appearance of life-threatening viruses, and the increase in the incidence of fungal infections in the world s population all underscore our inadequacy to cope with these medical problems. Endophytic microorganisms that colonize internal tissues of plants without causing any negative effects are relatively unstudied as potential sources of novel natural products for medical and commercial exploitation. The Streptomycetes provide nearly 80% of all the world s antibiotics produced. The aim of this work was to investigate the Brazilian tropical savannah tree Solanum lycocarpum St. Hill (Lobeira) in São Carlos, in order to isolate the endophytic microorganisms associated with the plant, separating and purifying the bioactives substances produced by the endophytic microorganism. The bioactivity of S. tubercidicus against pathogenic microorganisms was analyzed. The obtained results point out the antagonistic potential of the endophytic isolated against microorganisms of interest in Public Health. The brute extract fresh produced by S. tubercidicus RND-C it presented antimicrobial potential maximum of 200 UA.mL-1 against Escherichia coli ATCC 25922 and Staphylococcus aureus ATCC 25923 after 48 h of cultivation; The bioactive substances produced by S. tubercidicus were submitted to different thermal and enzymatic treatments and pH variation to be determined the nature of the bioactive compounds. After it being submitted to enzymatic treatment with amylase and pepsin, the concentrated extract stayed bioactive, suggesting the lipidic and no-prothein nature of the bioactive substances. Already the active compounds against E. coli suggests the presence of a substance of glycidic and lipidic nature, due to resistance to the action of the enzyme invertase and lipase, respectively, suggesting that the substances contained in the brute extract of S. tubercidicus RND-C against E.coli can be a ´glycolipid. The concentrated extract stayed active biologically when exposed to lower (-20 and -80 ºC) and high (100 and 121 ºC) temperatures, suggesting that the bioactive compounds produced are not subject to spontaneous degradation. The extract stayed active against E. coli in acidity conditions (pH, 2,0 - 5,0) and it also presented bioactivity in pH 7,0 and 8,0. In conditions of high alkalinity (pH 9,0) bioactivity was not detected. Already against S. aureus, the extract stayed assets in the strip of pH 7,0. In conditions of acidity and alkalinity the bioactive substances produced by S. tubercidicus were inactivated. The molar mass of the substances was esteemed in minor than 3,0KDa. The bioactive molecules contained in the concentrated extract produced by S. tubercidicus RNC-C were purified and separated by bio monitoring analyzes, suggesting the presence of two different substances. The evaluation of the separation using a hight performance liquid chromatography (HPLC), suggests the existence of two different substances produced by S. tubercidicus, one being active against S. aureus and the other one active against E.coli and S. aureus. In the separation by using reverse-phase chromatography (Sep-Pak), were obtained four fractions (St. 1, St. 2, St. 3 and St. 4). The fractions St. 2 and St. 4 presented antimicrobial activity against bacteria and they were purified separately by Sephadex LH-20 Gel permeation chromatography obtaining the fractions St. 2-A; St. 2- B; St. 4-A and St. 4-B. The fractions St. 2-B was activity against S. aureus. Already the fractions St. 4-B was activity against S. aureus and E. coli. These results suggest the presence of two different substances. This work intends to contribute for understanding the interactions of endophitic and plants besides opening new perspectives on the biotechnological potential of the endophitics microorganisms of plants. The investigation of new composed assets biologically starting from microorganisms brings important contributions for the discovery of new drugs. / O aumento da incidência de doenças bacterianas, virais e fúngicas enfatiza a necessidade de investigar a produção microbiana de novos compostos bioativos. Microrganismos endofíticos que colonizam tecidos internos de plantas são relativamente pouco estudados como fontes potenciais de novos produtos naturais para a exploração médica e comercial. O gênero Streptomyces tem grande importância industrial devido à capacidade de produzir muitos metabólitos secundários, respondendo por 80% dos antibióticos utilizados atualmente. Com base neste contexto, o objetivo deste trabalho foi isolar Streptomyces spp., endofítico de plantas do Cerrado, da região de São Carlos, SP, separando e purificando as substâncias bioativas produzidas pelo isolado. O endofítico Streptomyces tubercidicus foi isolado de Solanum lycocarpum St. Hill (Lobeira) relatando, pela primeira vez, o endofitismo da bactéria isolada a partir de vegetação de Cerrado de São Carlos. A bioatividade de S. tubercidicus foi avaliada e os resultados obtidos ressaltam o potencial antagônico do endofítico isolado contra microrganismos de interesse em Saúde Pública, se constituindo em uma fonte promissora para a pesquisa de novos compostos bioativos. O extrato bruto fresco produzido por S. tubercidicus RND-C apresentou potencial antimicrobiano máximo de 200 UA.mL-1 contra Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 25923 após 48 h de cultivo; As substâncias bioativas produzidas por S. tubercidicus foram submetidas a diferentes tratamentos térmicos, enzimáticos e variação de pH para determinação da natureza dos compostos bioativos. Após ter sido submetido a tratamento enzimático com amilase e pepsina, o extrato concentrado manteve-se bioativo, sugerindo a natureza lipídica e nãoproteinácea das substâncias bioativas. Já o composto ativo contra E. coli sugere a presença de substância de natureza glicídica e lípidica, devido a resistência à ação da enzima invertase e lipase, respectivamente, sugerindo que as substâncias contidas no extrato bruto de S. tubercidicus RND-C contra E.coli pode ser um glicolipídio. O extrato concentrado manteve-se biologicamente ativo quando exposto a baixas (-20 e -80 ºC) e elevadas (100 e 121 ºC) temperaturas, sugerindo que os compostos bioativos produzidos não são sujeitos a degradação espontânea. O extrato manteve-se ativo contra E. coli em condições de acidez (pH, 2,0 5,0) e também apresentou bioatividade em pH 7,0 e 8,0. Em condições de alta alcalinidade (pH 9,0) não detectou-se bioatividade. Já contra S. aureus, o extrato manteve-se ativo apenas na faixa de pH 7,0. Em condições de acidez e acalinidade as substâncias bioativas produzidas por S. tubercidicus foram inativadas. A massa molar dos compostos bioativos produzidos por S. tubercidicus RND-C foram estimadas em menor que 3,0 kDa. As moléculas bioativas contidas no extrato concentrado produzidas por S. tubercidicus RND-C foram purificadas por separação biomonitorada, sugerindo a presença de duas substâncias diferentes. A avaliação da separação usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) sugere a existência de duas substâncias diferentes produzidas por S. tubercidicus, sendo duas ativas contra S. aureus e a outra ativa contra E.coli e S. aureus. Na separação por cromatografia em coluna pré-empacotada de fase reversa do tipo Sep-Pak, foram obtidas quatro frações (St. 1, St. 2, St. 3 e St. 4). As frações St. 2 e St. 4 apresentaram atividade antimicrobiana contra bactérias e foram purificadas separadamente por cromatografia de permeação em gel de Sephadex LH-20 obtendo as frações St. 2-A; St. 2-B; St. 4-A e St. 4-B. A fração St. 2-B foi ativa contra S. aureus. Já a fração St. 4-B foi ativa contra S. aureus e E. coli. Estes resultados sugerem a presença de duas substâncias diferentes. Este trabalho pretende contribuir para a compreensão das interações endófitos/plantas além de abrir novas perspectivas sobre o potencial biotecnológico dos microrganismos endofíticos de plantas. A investigação de novos compostos biologicamente ativos a partir de microrganismos traz importantes contribuições para a descoberta de novas drogas.

Muitos fatores, como variações sazonais, tipos de tecido vegetal, cultivares e espécies de hospedeiro, tipo de solo, interação com microrganismos benéficos ou patógenos entre outros, afetam a estrutura e a composição da comunidade bacteriana das plantas. A introdução de plantas geneticamente modificadas (PGM) foi somada ao conjunto desses fatores, podendo acarretar efeitos diretos e indiretos sobre a comunidade bacteriana. Cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância no Brasil; a área de cultivo está em expansão devido aos incentivos para a produção de álcool. Uma bactéria potencialmente importante para a cultura de cana-de-açúcar é a Methylobacterium, um importante endófito de diversas culturas de interesse econômico e que, em cana-de-açúcar, pode melhorar a germinação de sementes, promover um aumento do peso da planta e da área foliar, além do número de internódios. Dessa forma, o trabalho teve como objetivos: i) avaliar os efeitos da canade- açúcar transgênica resistente a insetos e a herbicida sobre a comunidade bacteriana associada; ii) avaliar se o suposto efeito causado pela cana-de-açúcar transgênica resistente a herbicida deriva diretamente do transgene ou dos tratos culturais diferenciados aos quais a planta transgênica é submetida; iii) avaliar a interação entre Methylobacterium spp. e cana-de-açúcar. Analisando a densidade bacteriana das plantas de cana-de-açúcar convencionais e transgênicas não foi possível constatar diferenças relacionadas à introdução dessas plantas. Analisando somente quanto ao manejo de ambos os experimentos, foi possível observar que diferenças em trato cultural ou manejo de plantas, decorrentes ou não da transgenia, podem influenciar a comunidade bacteriana. Por meio de ARDRA, foi possível observar distribuição diferenciada dos ribotipos com a introdução das PGMs. No experimento realizado somente com plantas transgênicas para resistência a Imazapyr, foi possível notar que, em 17 meses, a presença da planta transgênica e a aplicação do herbicida Imazapyr podem ter resultado na redução da densidade bacteriana associada à rizosfera de cana-de-açúcar. Por meio de DGGE, foi visto que o estado fisiológico da planta foi a maior fonte de variação. Novamente por meio de ARDRA, foram observados ribotipos cuja presença foi afetada pelo cultivo da planta transgênica. Esses ribotipos diferentemente distribuídos poderiam resultar em alterações na atividade bacteriana dessas plantas, uma vez que esses ribotipos podem representar grupos funcionais importantes. A colonização de Methylobacterium spp. em cana-de-açúcar foi analisada por meio de microscopia eletrônica de varredura, reisolamento e microscopia óptica de fluorescência. Foi visto que as linhagens utilizadas colonizam cana-de-açúcar, sendo que os pontos de maior colonização são os flanges cuticulares e as regiões pilosas da raiz. Outros estudos são necessários para o melhor aproveitamento dessa bactéria na cultura de cana-de-açúcar. / Many factors, such as seasonal variations, kinds of vegetal tissue, cultivares and host species, kind of soil, interaction with beneficial or pathogen microorganisms, among others, affect the structure and composition of plants bacterial community. The introduction of genetically modified plants (GMP) was added to the set of these factors, making it possible to cause direct and indirect effects on the bacterial community. Sugarcane is a very important crop in Brazil; the cultivation area is expanding due to incentives to alcohol production. A potentially important bacterium for sugar cane cultivation is the Methylobacterium, which is an important endophyte for several cultures of economic interest and which can improve seed germination in sugar cane, promote an increase of plant weight and foliar area, and also the internodes. Thus, the work had as objectives: i) to assess the effects of transgenic sugarcane resistant to insects and herbicide on the associated bacterial community; ii) to assess if the presumed effect caused by transgenic sugarcane resistant to herbicides derives directly from the transgene or differentiated cultural handlings to which the genetically modified plant is undertaken; iii) to assess the interaction between Methylobacterium ssp. and sugarcane. Analyzing the bacterial density of conventional and transgenic sugarcane plants it was not possible to see differences related to the introduction of these plants. Analyzing only in relation to the handling of both experiments, it was possible to see that differences in cultural wielding or handling of plants derived or not from transgenia can influence the bacterial community. By means of ARDRA, it was possible to see a differentiated distribution of ribotypes with the introduction of GMPs. In the experiment made only with transgenic plants for Imazapyr resistance, it was possible to see that in 17 months, the presence of the transgenic plant and the application of Imazapyr herbicide can bring result regarding the bacterial density reduction associated to sugarcane rizosphere. By means of DGGE, it was seen that the physiological status of the plant was the greatest variation source. Again, by means of ARDRA, ribotypes whose presence was affected by transgenic plant cultivation were observed. If distributed differently, these ribotypes can represent important functional groups. The Methylobacterium ssp. Colonization in sugarcane was analyzed and by means of scanning electronic microscopy, re-isolation, and fluorescence optical microscopy. It was observed that the utilized lineages colonize sugarcane being cuticle flange and perilous regions of root the highest colonization points. Other studies are needed to a better good use of this bacterium in sugarcane culture.

A cana-de-açúcar (Saccharum sp.) chegou ao Brasil com a implementação das primeiras capitanias. Hoje ela é cultivada em praticamente todos os estados brasileiros, sendo processada para a produção de açúcar e álcool combustível. Para suprir este mercado crescente com plantas de alta qualidade é necessária a utilização da técnica de cultura de tecidos aplicada à microprogação in vitro para produzir mudas livres de doenças e em larga escala. Porém a contaminação microbiana é um fator determinante no sucesso da produção de plantas micropropagadas, sendo responsável por grandes perdas no processo. Dentro deste contexto, o presente trabalho teve como principal objetivo encontrar antibióticos capazes de reduzir as perdas por contaminação bacteriana no processo produtivo de plantas micropropagadas de cana-deaçúcar sem afetar o desenvolvimento vegetal. Para tanto, foram realizados o isolamento e identificação dos contaminantes bacterianos presentes no material micropropagado, a seleção dos principais antibióticos capazes de inibir o crescimento destes contaminantes e posteriormente um processo de antibioticoterapia foi estabelecido. Os resultados obtidos através da identificação evidenciaram que a maioria dos contaminantes bacterianos é composta por microrganismos endofíticos, sendo o gênero Gluconacetobacter o contaminante encontrado com mais frequência. Os resultados dos testes de suscetibilidade mostraram que nenhum antibiótico é 100% eficaz no controle geral do crescimento bacteriano, porém o antibiótico rifampicina se mostrou mais eficiente quando usado na concentração mínima de 50 g/mL e quando realizada a antibioticoterapia não afetou o crescimento das plantas micropropagadas. / Sugarcane (Saccharum sp.) arrived in Brazil with the first captaincy implementation. Nowadays, it is cultivated in almost all Brazilian states, processed to produce sugar and alcohol as fuel. In order to supply this growing market with high quality plants, it is necessary to use the technique of tissue culture applied to in vitro micropropagation to produce seedlings free of disease in large scale. But the microbial contamination is a determinant factor for the success of micropropagated plants production; it is responsible for great losses in the process. Within this context, the present work aimed to find antibiotics that can reduce losses by bacterial contamination in the production process of sugarcane micropropagated plants without affecting its development. Therefore, we have performed the isolation and identification of bacterial contaminants present in micropropagated material, the selection of the main antibiotics capable of inhibiting the growth of these contaminants and then a process of antibiotic therapy was established. The results obtained through the identification evidenced that most of the bacteria contaminants is composed of endophytic microorganisms, and the genus Gluconacetobacter was the contaminant found more often. The results of susceptibility tests showed that no antibiotic is 100% effective in the general control of bacterial growth, but the antibiotic rifampicin was more efficient when used at the minimum concentration of 50 g/mL and when performed with antibiotic therapy did not affect the growth of micropropagated plants.

A cana-de-açúcar é uma das mais importantes culturas para o Brasil e vem recebendo significativa atenção devido à crescente substituição de combustíveis fósseis por fontes renováveis e menos poluentes de energia como o etanol. Consequentemente, os aspectos biotecnológicos oriundos da interação de bactérias e cana-de-açúcar devem ser mais bem avaliados, além disso, estudos de interação planta-microrganismo desenvolvidos em países tropicais são ainda incipientes. As bactérias interagindo com as plantas de interesse agronômico podem acarretar os mais diversos benefícios, com ênfase na promoção do crescimento vegetal e da fitossanidade. Dentre essas bactérias, diversas linhagens de Pantoea agglomerans têm sido isoladas intimamente associadas a várias espécies vegetais. As bactérias pertencentes ao gênero Pseudomonas também têm sido exploradas biotecnologicamente, pois produzem uma vasta gama de antimicrobianos que podem ser utilizados no controle de pragas e fitopatógenos. A partir desses fatos, uma linhagem de P. agglomerans, 33.1, previamente isolada endofiticamente de Eucalyptus grandis e promotora de crescimento dessa cultura, foi avaliada quanto aos aspectos biotecnológicos durante associação com cana-de-açúcar. A linhagem 33.1 foi capaz de promover o crescimento de cana-de-açúcar e também induziu a produção de proteínas de resistência pelas plantas inoculadas. Dentre os mecanismos avaliados na promoção de crescimento vegetal, a linhagem apresentou alta produção de fitormônio e fosfatases. Foi também confirmado que a interação planta-bactéria afetou o metabolismo da linhagem 33.1. Um plasmidio integrativo, pNKGFP, foi desenvolvido e inserido na linhagem 33.1. A linhagem bacteriana marcada foi monitorada durante interação com cana-de-açúcar. Por microscopia de fluorescência, re-isolamento e PCR quantitativo (qPCR) foi confirmada a capacidade de colonização cruzada de cana-deaçúcar pela linhagem 33.1:pNKGFP, abrindo assim precedentes para utilização dessa linhagem em outras culturas. Posteriormente, a linhagem 33.1 foi geneticamente modificada para produção da proteína Cry. Por meio de bioensaios em dieta artificial e colmos de cana-de-açucar foi provado o parcial controle de Diatraea saccharalis, uma importante praga de cana-de-açúcar, pela linhagem endofítica expressando heterologamente o gene cry1a7c. Vários antibióticos e sideróforos produzidos pela bactéria P. fluorescens, linhagem Pf-5, foram avaliados quanto ao controle de Fusarium spp., incluindo isolados de F. verticillioides causadores de Pokkah boeng em cana-deaçúcar. Por mutações sitio-dirigido em genes envolvidos na biossíntese de antimicrobianos foi provado que os compostos 2,4-diacetil-floroglucinol e rizoxina são os principais responsáveis no controle Fusarium spp. Por HPLC e RT-qPCR foi também provado que ácido fusárico afeta a produção de antibióticos pela Pf-5. / Sugarcane is one of the most important Brazilian crops. Its importance is increasing due to the gradual substitution of fossil fuel for renewable and cleaner energy sources, such as ethanol Consequently, the biotechnological aspects that mediate sugarcane-bacterium interactions must be evaluated; studies from tropical countries are incipiente Bacterium-plant interactions can often improve the growth and fitness of associated plants. One of these beneficial bacteria, Pantoea agglomerans, has been isolated from many vegetal species. The Pseudomonas genus also has a record of biotechnological exploration due to its wide range of antibiotic production. These compounds can be used on pest and plant-pathogen control. For these reasons, P. agglomerans, strain 33.1, previously isolated from Eucalyptus grandis and a known eucalyptus growth-promoter, was evaluated about regarding the biotechnological aspects of sugarcane-bacterial association. 33.1 strain was able to promote sugarcane growth and also to induce the production of resistance proteins for inoculated plants. The plant-hormone and phosphatase production by 33.1 were associated with sugarcane growth-promotion bacterial mechanisms. An integrative plasmid, pNKGFP, was constructed and used to transform 33.1. The marked strain was monitored during sugarcane association. The sugarcane cross-colonization by 33.1:pNKGFP was confirmed by fluorescence microscopy, re-isolation and quantitative PCR (qPCR), suggesting that 33.1 should be used in association with other crops. 33.1 was genetically modified to produce the Cry protein. The partial biocontrol of Diatraea saccharalis, the sugarcane borer, by the endophytic strain expressing heterologously the cry1a7c gene, was confirmed in bioassays using artificial diet and sugarcane stalks. Several antibiotics and siderophores produced by P. fluorescens Pf-5 were tested against Fusarium spp.; including isolates of F. verticillioides responsible for the sugarcane Pokkah boeng disease. By deriving site-directed mutants of Pf-5, with single and multiple mutations, in the bio-synthetic gene clusters of the antifungal compounds, it was proved that 2,4-diacetyl-phoroglucinol and rhizoxin are the major compounds responsible for the Fusarium spp. suppression. The fusaric acid effects on Pf-5 antibiotic production was proved by HPLC and RT-qPCR.

A cana-de-açúcar (Saccharum sp.) chegou ao Brasil com a implementação das primeiras capitanias. Hoje ela é cultivada em praticamente todos os estados brasileiros, sendo processada para a produção de açúcar e álcool combustível. Para suprir este mercado crescente com plantas de alta qualidade é necessária a utilização da técnica de cultura de tecidos aplicada à microprogação in vitro para produzir mudas livres de doenças e em larga escala. Porém a contaminação microbiana é um fator determinante no sucesso da produção de plantas micropropagadas, sendo responsável por grandes perdas no processo. Dentro deste contexto, o presente trabalho teve como principal objetivo encontrar antibióticos capazes de reduzir as perdas por contaminação bacteriana no processo produtivo de plantas micropropagadas de cana-deaçúcar sem afetar o desenvolvimento vegetal. Para tanto, foram realizados o isolamento e identificação dos contaminantes bacterianos presentes no material micropropagado, a seleção dos principais antibióticos capazes de inibir o crescimento destes contaminantes e posteriormente um processo de antibioticoterapia foi estabelecido. Os resultados obtidos através da identificação evidenciaram que a maioria dos contaminantes bacterianos é composta por microrganismos endofíticos, sendo o gênero Gluconacetobacter o contaminante encontrado com mais frequência. Os resultados dos testes de suscetibilidade mostraram que nenhum antibiótico é 100% eficaz no controle geral do crescimento bacteriano, porém o antibiótico rifampicina se mostrou mais eficiente quando usado na concentração mínima de 50 g/mL e quando realizada a antibioticoterapia não afetou o crescimento das plantas micropropagadas. / Sugarcane (Saccharum sp.) arrived in Brazil with the first captaincy implementation. Nowadays, it is cultivated in almost all Brazilian states, processed to produce sugar and alcohol as fuel. In order to supply this growing market with high quality plants, it is necessary to use the technique of tissue culture applied to in vitro micropropagation to produce seedlings free of disease in large scale. But the microbial contamination is a determinant factor for the success of micropropagated plants production; it is responsible for great losses in the process. Within this context, the present work aimed to find antibiotics that can reduce losses by bacterial contamination in the production process of sugarcane micropropagated plants without affecting its development. Therefore, we have performed the isolation and identification of bacterial contaminants present in micropropagated material, the selection of the main antibiotics capable of inhibiting the growth of these contaminants and then a process of antibiotic therapy was established. The results obtained through the identification evidenced that most of the bacteria contaminants is composed of endophytic microorganisms, and the genus Gluconacetobacter was the contaminant found more often. The results of susceptibility tests showed that no antibiotic is 100% effective in the general control of bacterial growth, but the antibiotic rifampicin was more efficient when used at the minimum concentration of 50 g/mL and when performed with antibiotic therapy did not affect the growth of micropropagated plants.

A cultura de cana-de-açúcar ocupa posição de destaque nos cenários nacional e internacional devido principalmente a produção de etanol como fonte de energia renovável e menos nociva ao ambiente. Entretanto um dos obstáculos à produtividade é a ocorrência de várias doenças dentre elas a escaldadura das folhas causada por Xanthomonas albilineans. Bactérias endofíticas e rizosféricas pertencentes ao gênero Burkholderia tem sido isoladas com alta frequência em diferentes culturas como, por exemplo, a cana-de-açúcar. Nas últimas décadas, estas bactérias têm recebido especial atenção devido ao seu potencial como promotoras de crescimento vegetal, como agentes de biorremediação, mas muito pouco é explorado quanto ao potencial biotecnológico dessas bactérias como agentes de biocontrole de doenças. Visto que essas bactérias vivem em um ambiente altamente competitivo e sujeito a flutuações ambientais, representam uma fonte altamente significativa de metabólitos secundários bioativos, como as bacteriocinas sintetizadas ribossomicamente e outros peptídeos não ribossomais. Portanto, os objetivos principais deste trabalho foram determinar a frequência de linhagens de Burkholderia spp. endofíticas e da rizosfera de cana-deaçúcar capazes de produzir bacteriocinas e outros metabólitos secundários e por meio de mutagênese aleatória por transposon, identificar genes associados a produção desses metabólitos. Os resultados de caracterização permitiram concluir que as bactérias endofíticas e rizosféricas pertencentes ao gênero Burkholderia avaliadas apresentaram grande potencial em produzir metabólitos com atividade antibacteriana in vitro; sendo capazes de controlar X. albilineans importante patógeno da cultura de cana-de-açúcar. Para uma das linhagens foi obtida uma biblioteca de mutantes, a qual foi parcialmente caracterizada quanto à alteração da atividade antibacteriana. Foram identificados doze mutantes que apresentaram perda da atividade antibacteriana. A análise das sequências flanqueadoras do transposon para os doze mutantes permitiu a identificação de genes associados a produção de bacteriocinas, a regulação da expressão gênica, a enzimas possivelmente associadas ao metabolismo secundário, ao metabolismo geral da célula e a proteínas hipotéticas. A identificação e clonagem de tais genes permitirão uma maior compreensão da produção desses compostos e futuras aplicações biotecnológicas. / The sugarcane crop has an important role in international and national scenery mainly because the ethanol production as a sustainable energy source and less harmful to the environment. However one of the obstacles to the productivity is the occurrence of several diseases among them leaf scald caused by Xanthomonas albilineans. Endophytic and rhizospheric bacteria that belong to the Burkholderia genus have been isolated in high frequency in different cultures, such as sugarcane. In the last decades, these bacteria have been receiving attention due their potential as plant growth promoters, bioremediation agents. However, the biotechnological potential of these bacteria as agents of diseases biocontrol is very poorly evaluated. Since these bacteria live in a highly competitive environment and subject to environmental fluctuations, they may represent a highly significant source of bioactive secondary metabolites, as ribosomal synthesized bacteriocins and other nonribosomal peptides. Therefore, the main aim of this work was to determine the frequency of bacteriocin and secondary metabolites production by endophytic and rhizospheric isolates of Burkholderia spp. from sugarcane. Also, the genes associated to synthesis of these metabolites were identified by random mutagenesis based on Tn5 transposon. The results showed that endophytic and rhizospheric Burkholderia spp. present in vitro potential to production of metabolites with antibacterial activity; being inhibited X. albilineans, an important pathogen of sugarcane crops. For one of the Burkholderia strain it was obtained a mutant library, which was partially characterized according to antibacterial activity. Twelve mutants that showed the loss of antibacterial activity were identified and further evaluated. Also, the analysis of the transposon flanking sequences for these mutants indicated that genes associated to the bacteriocin production, regulation of gene expression, enzymes possibly associated to the secondary metabolism, general metabolism of the cell and hypothetical proteins are related to loss of inhibition ability. The identification and cloning of such genes will allow a better understanding of the production of theses compounds and further biotechnological applications.

Os fungos endofíticos são microrganismos que vivem no interior de tecidos ou órgãos dos vegetais, sem causar danos aos seus hospedeiros. Dentre as inúmeras características desses microrganismos está o seu potencial biorremediador Este trabalho teve como objetivo a avaliação do potencial biorremediador do endófito Mucor sp. isolado de Eichhornia crassipes (Mart.) (Pontederiaceae), verificando a tolerância e capacidade de absorção do metal pesado cádmio (Cd), os efeitos desse metal na morfologia celular e no sistema de defesa antioxidante do fungo, e também o comportamento da planta modelo Solanum lycopersicum cultivar Calabash Rouge, inoculada com o endófito na presença do metal cádmio. Os resultados apresentados indicaram que um fungo endofítico do gênero Mucor, isolado da macrófita aquática E. crassipes, oriunda de uma lagoa contaminada com metais pesados, apresentou resistência a altas concentrações do metal cádmio. Este fungo apresentou uma modificação na sua morfologia em altas concentrações do metal, além de possuir a capacidade de reter este metal, tanto no interior do seu citoplasma, quanto em sua parede celular, o que pode estar ligada a mecanismos de desintoxicação e sequestro de metais relacionados à formação de complexos Cd-GSH. O mesmo fungo também apresentou um aumento na relação GSH/GSSG nos tratamentos com o metal. Os resultados ainda demonstraram que o estresse causado pelo metal induziu a ativação de enzimas antioxidantes SOD, CAT e GR no isolado endofitico. Além disso, este endófito, quando inoculado em plantas de tomate (Solanum lycopersicum), aumentou a capacidade de absorção do metal na parte aérea desta planta, além de promover crescimento da mesma, nos tratamentos sem o metal, Desta forma o isolado endofítico (CM3) Mucor sp. mostrou um potencial biorremediador, podendo ser utilizado como ferramenta para diminuir os danos causados a saúde humana e ao meio ambiente pelos metais pesados, principalmente o metal cadmio, e também na promoção de crescimento de plantas / Endophytic fungi live in the interior of plant tissues or organs, without causing harm to their hosts. Among several interesting characteristics of these microorganisms, some of them present a good potential for bioremediation. This study aimed at assessing the bioremediation potential of endophytic fungus Mucor sp. isolated from a Eichhornia crassipes (Mart.) (Pontederiaceae), analyzing chemical absorption ability and fungal tolerance to the heavy metal cadmium (Cd), besides testing the effects of cadmium on the cell morphology, the antioxidant defense system of the fungus, and the behavior of model plant (Solanum lycopersicum) variety Calabash Rouge inoculated with a spore suspension of Mucor sp. in the presence of cadmium. The results indicated that the endophytic fungus isolated from a Eichhornia crassipes (Mart.) plant located in a lagoon contaminated with heavy metals showed resistance to high concentrations of cadmium. The isolated fungus was identified as Mucor sp. The morphology studies demonstrated the occurrence of modifications on the fungus when in high concentrations of the metal. Furthermore, it was possible to verify that the fungus has a capacity to retain metal, both in the cytoplasm and cell wall. This aspect can be linked to detoxification and sequestration mechanisms of metals related to formation of Cd-GSH complexes, since this fungus also presented increase of GSH/GSSG ratio in the treatments with metal. The results also demonstrated that the stress caused by cadmium induces the activation of antioxidant enzymes SOD, CAT and GR in Mucor sp.. Moreover, the inoculation of this fungus in tomato plants increased the biosorption capacity of the cadmium in aerial parts of the plant, besides promoting its growth in the treatments without the metal. Thus the endophytic isolate (CM3) Mucor sp. presented a promising potential as a bioremediator, which can be used as a tool for reducing the damage caused by heavy metals, especially cadmium, to human health and environment

Os fungos endofíticos são microrganismos que vivem no interior de tecidos ou órgãos dos vegetais, sem causar danos aos seus hospedeiros. Dentre as inúmeras características desses microrganismos está o seu potencial biorremediador Este trabalho teve como objetivo a avaliação do potencial biorremediador do endófito Mucor sp. isolado de Eichhornia crassipes (Mart.) (Pontederiaceae), verificando a tolerância e capacidade de absorção do metal pesado cádmio (Cd), os efeitos desse metal na morfologia celular e no sistema de defesa antioxidante do fungo, e também o comportamento da planta modelo Solanum lycopersicum cultivar Calabash Rouge, inoculada com o endófito na presença do metal cádmio. Os resultados apresentados indicaram que um fungo endofítico do gênero Mucor, isolado da macrófita aquática E. crassipes, oriunda de uma lagoa contaminada com metais pesados, apresentou resistência a altas concentrações do metal cádmio. Este fungo apresentou uma modificação na sua morfologia em altas concentrações do metal, além de possuir a capacidade de reter este metal, tanto no interior do seu citoplasma, quanto em sua parede celular, o que pode estar ligada a mecanismos de desintoxicação e sequestro de metais relacionados à formação de complexos Cd-GSH. O mesmo fungo também apresentou um aumento na relação GSH/GSSG nos tratamentos com o metal. Os resultados ainda demonstraram que o estresse causado pelo metal induziu a ativação de enzimas antioxidantes SOD, CAT e GR no isolado endofitico. Além disso, este endófito, quando inoculado em plantas de tomate (Solanum lycopersicum), aumentou a capacidade de absorção do metal na parte aérea desta planta, além de promover crescimento da mesma, nos tratamentos sem o metal, Desta forma o isolado endofítico (CM3) Mucor sp. mostrou um potencial biorremediador, podendo ser utilizado como ferramenta para diminuir os danos causados a saúde humana e ao meio ambiente pelos metais pesados, principalmente o metal cadmio, e também na promoção de crescimento de plantas / Endophytic fungi live in the interior of plant tissues or organs, without causing harm to their hosts. Among several interesting characteristics of these microorganisms, some of them present a good potential for bioremediation. This study aimed at assessing the bioremediation potential of endophytic fungus Mucor sp. isolated from a Eichhornia crassipes (Mart.) (Pontederiaceae), analyzing chemical absorption ability and fungal tolerance to the heavy metal cadmium (Cd), besides testing the effects of cadmium on the cell morphology, the antioxidant defense system of the fungus, and the behavior of model plant (Solanum lycopersicum) variety Calabash Rouge inoculated with a spore suspension of Mucor sp. in the presence of cadmium. The results indicated that the endophytic fungus isolated from a Eichhornia crassipes (Mart.) plant located in a lagoon contaminated with heavy metals showed resistance to high concentrations of cadmium. The isolated fungus was identified as Mucor sp. The morphology studies demonstrated the occurrence of modifications on the fungus when in high concentrations of the metal. Furthermore, it was possible to verify that the fungus has a capacity to retain metal, both in the cytoplasm and cell wall. This aspect can be linked to detoxification and sequestration mechanisms of metals related to formation of Cd-GSH complexes, since this fungus also presented increase of GSH/GSSG ratio in the treatments with metal. The results also demonstrated that the stress caused by cadmium induces the activation of antioxidant enzymes SOD, CAT and GR in Mucor sp.. Moreover, the inoculation of this fungus in tomato plants increased the biosorption capacity of the cadmium in aerial parts of the plant, besides promoting its growth in the treatments without the metal. Thus the endophytic isolate (CM3) Mucor sp. presented a promising potential as a bioremediator, which can be used as a tool for reducing the damage caused by heavy metals, especially cadmium, to human health and environment

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3694.pdf: 1040825 bytes, checksum: 07255db3fd1638e75419879ee51ac8ab (MD5) Previous issue date: 2009-09-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / Endophytic microorganisms lives in symbiotic association with plants and in one unique biological niche, and they are potential producers of natural bioactive substances with different chemical structure and biological activity. This study aimed to isolate and characterize endophytic microorganisms from Miconia albicans from Cerrado of São Carlos - SP. Samples were characterized phenotypically from typical features of colony morphology and macroscopic measurements, physiological, biochemical and morphodyeing and genotypically by 16S rRNA analysis. We evaluated the antagonistic potential of the isolates against Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Serratia marcensis IAL 1475, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Shigella sonnei ATCC 10231 and Candida albicans ATCC 10231. Two samples (1 and 3) showed bioactivity against E. faecalis, with inhibition halos of 1.30 and 1.90 cm in diameter, respectively. A single sample (2) showed activity against S. marcensis (3.60 cm) with no significant bioactivity against the other microorganisms tested. In one sample (4) showed activity against four of the six microorganisms tested: E. faecalis (3,15 cm) , S. aureus (3,50 cm), C. albicans (3,35 cm) e S. sonnei (3,20 cm). In another sample (6) was detected bioactivity against E. faecalis and S. aureus, with inhibition zones of 1.80 and 1.50 cm, respectively. One of the samples (8) showed bioactivity against the greatest number of indicator microorganisms with inhibitory halos of 2.60 cm against E. faecalis, 1.50 cm against S. aureus, 2.40 cm against C. albicans, 2.10 cm against E. coli and 2.50 cm against S. sonnei. In two samples (5 and 7) there was no evidence the bioactive ability against indicator microorganisms tested. Phenotypic analysis of 8 endophytic microorganisms isolated allowed us to classify 50% of these (samples 4, 6, 7 and 8) in the Actinomyces group and the others were classified in the genus Streptomyces (samples 1, 2, 3 and 5). In the genotypic analysis of two isolates with bioactivity were identified as Nocardiopsis Dassonville (sample 3) and Amycolatopsis orientalis (sample 8), reporting for the first time his association with endophytic aerial parts of Miconia albicans from Cerrado of São Carlos, SP. / Microrganismos endofíticos vivem em associação simbiótica com plantas e habitam nichos biológicos únicos, além de serem potenciais produtores de substâncias naturais bioativas com estrutura química e atividade biológica diversas. Este trabalho objetivou isolar e caracterizar microrganismos endofíticos a partir de Miconia albicans do Cerrado de São Carlos SP. Amostras foram caracterizadas fenotipicamente a partir de tipicidade de morfologia colonial e determinações macroscópicas, fisiológicas, bioquímicas e morfo-tintoriais e genotipicamente através de análises de RNAr 16S. Foi avaliado o potencial antagônico dos isolados contra Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Serratia marcensis IAL 1475, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Shigella sonnei ATCC 10231 e Candida albicans ATCC 10231. Duas amostras (1 e 3) apresentaram bioatividade contra E. faecalis, com halos de inibição de 1,30 e 1,90 cm de diâmetro, respectivamente. Uma única amostra (2) apresentou atividade contra S. marcensis (3,60 cm), não apresentando bioatividade contra os demais microrganismos testados. Em uma amostra (4) observou-se atividade contra quatro dos seis microrganismos testados: E. faecalis (3,15 cm) , S. aureus (3,50 cm), C. albicans (3,35 cm) e S. sonnei (3,20 cm). Em outra amostra (6) detectou-se bioatividade contra E. faecalis e S. aureus, com halos de inibição de 1,80 e 1,50 cm, respectivamente. Uma das amostras (8) apresentou bioatividade contra o maior número de microrganismos indicadores, com halos inibitórios de 2,60 cm contra E. faecalis, 1,50 cm contra S. aureus, 2,40 cm contra C. albicans, 2,10 cm contra E. coli e 2,50 cm contra S. sonnei. Em duas amostras (5 e 7) não foi evidenciada habilidade bioativa contra os microrganismos indicadores testados. Análises fenotípicas dos 8 microrganismos endofíticos isolados permitiram classificar 50% destes (amostras 4, 6, 7 e 8) no grupo Actinomyces e os outros foram classificados no gênero Streptomyces (amostras 1, 2, 3 e 5). Na análise genotípica dois dos isolados apresentando bioatividade foram caracterizados como Nocardiopsis dassonvillei (amostra 3) e Amycolatopsis orientalis (amostra 8), relatando pela primeira vez sua associação endofitica com partes aéreas de Miconia albicans do Cerrado de São Carlos, SP.