A cana-de-açúcar é uma das principais culturas do Brasil e nos últimos anos está recebendo especial atenção devido ao crescente aumento da área cultivada e produção de etanol para uso como biocombustível. Considerando-se sua importância econômica e a possibilidade do uso de plantas geneticamente modificadas, essa cultura tem se tornado foco de pesquisas relacionadas à produtividade e sustentabilidade. Neste contexto, o estudo de comunidades microbianas associadas à cana-de-açúcar é de fundamental importância, pois além dessas comunidades desempenharem importante papel funcional na interação com a planta, os estudos realizados nas condições tropicais são limitados. Comunidades de fungos e bactérias associadas à cana-de-açúcar geneticamente modificada IMI-1 e sua isolinha convencional SP80-1842 foram sistematicamente isoladas de plantas cultivadas em área experimental em Piracicaba, SP, Brasil. Por meio de isolamento e PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) foi verificado que a transgenia não afeta a diversidade da comunidade fúngica associada à cana-deaçúcar. A diversidade dessas comunidades foi descrita e caracterizada molecularmente. O fungo Fusarium moniliforme apresentou alta freqüência de isolamento e também foi observado que o gene da endopoligalacturonase, pgIII, desempenha um importante papel no tipo de associação, endofítica ou patogênica, do F. moniliforme e a planta. O complexo Burkholderia cepacia constitui uma importante fração da comunidade de bactérias associada à cana-de-açúcar no Brasil e isolados deste complexo são capazes de inibir o crescimento do patógeno F. moniliforme. Análises filogenéticas indicaram que os isolados de bactérias endofíticas de Burkholderia são proximamente relacionados com linhagens-tipo do complexo B. cepacia isoladas de pacientes de fibrose cística. / In Brazil, the sugarcane is one of the most important cultivated crops. The sugarcane has received increased interest in the last years because of increase of the cultivated area and ethanol production to be used as biofuel. Considering its economical importance and the possibility of the use of the genetically modified plants; this crop has become the aim of current research for productivity and sustainability. In this context, the work on microbial communities associated with sugarcane is remarkable, because both, these communities play important functional role in the interaction with the plant, and studies performed in tropical conditions are limited as well. Fungal and bacterial communities associated with genetically modified sugarcane IMI-1 and its conventional isoline SP80-1842 were systematically isolated from plants cultivated in an experimental area in Piracicaba, SP, Brazil. The fungal communities associated with sugarcane were accessed by means of cultivation approach and PCR-denaturing gradient gel electrophoresis; the results revealed that these communities are not affected by transgeny. The microbial communities\' diversity was characterized and identified by using molecular tools. The fungus Fusarium moniliforme showed high frequency in association with the plant and it was observed that the endopolygalacturonase gene, pgIII, plays important role in order to determine the sort of association, either endophytic or pathogenic, between F. moniliforme and the host. The Burkholderia cepacia complex is an integral part of the endophytic bacterial community of sugarcane in Brazil and isolates of this complex are able to control F. moniliforme growth. Phylogenetic analyses indicated that the endophytic Burkholderia are closely related to clinical isolates of the B. cepacia complex isolated from cystic fibrosis patients.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karin Cristina.pdf: 1779954 bytes, checksum: fa7540fc1601cdb177d071d632782f2e (MD5) Previous issue date: 2009-10-05 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Chemical fertilizers and pesticides have become an important part of modern agriculture. The use of these chemical brought great benefits but also created new problems, such as disposal after use, persistence over time and accumulation in the environment, resulting significant bad consequences to public health and adverse impact on ecosystems. Maize culture deserves attention because the large amount of herbicides used. Mesotrione is a new selective herbicide developed for use in maize culture. Due it has not been used for a long time, there is little information available on the ecotoxicological risk. Only two mesotrione-degrading strains, from soil and water, both the genus Bacillus, were isolated and identified. The aim of this study was to isolate and characterize endophytic and epiphytic bacterial strains collected from maize leaves, able to biodegrade the herbicide mesotrione. Samples were collected in maize planting variety Penta without treatment with mesotrione and maize planting variety DKB 234 treated with mesotrione, at Fazenda Escola Capão da Onça, Ponta Grossa, PR. The microorganisms were isolated and cultured in mineral medium supplemented with mesotrione as sole carbon source. Of the twenty samples were isolated 347 tolerant and/or mesotrione-degrading strains. These were selected in increasing concentrations of the herbicide and had their degradation capability evalueted by VIS spectrophotometry. Ten strains were able to grow in the presence of high concentrations of mesotrione. Of these, 9 strains (7 epiphytic and 2 endophytic) were isolated from maize variety Penta without treatment with mesotrione and only 1 epiphytic strain was isolated from maize variety DKB 234 treated with mesotrione. Five strains had the ability to degrade the herbicide confirmed. One strain was identified as Acinetobacter baumanii and other as Micrococcus luteus. Just M. luteus is an endophytic strain, the others are maize epiphytics. Four mesotrione-degrading strains were isolated from maize untreated with mesotrione, only one strain of Gram-negative bacilli non fermenter was isolated from maize treated with the herbicide. The growth in high concentration of the strains that didn’t have the mesotrione degradation capability detected by spectrophotometry indicates the possibility of these strains degrade this herbicide when in association with other microorganisms consortia in the environment. The real quantitative capability of mesotrione degradation by the strains recorded by spectrophotometry may be underestimated due to the accumulation of degradation products which have the same wavelength as the mesotrione. This study reports the first isolation and characterization of mesotrione degrading strains endophytic and epiphytic from maize. / Os adubos químicos e pesticidas tornaram-se parte integral da agricultura moderna. O emprego destas substâncias químicas trouxe grandes vantagens, mas também criou novos problemas, como a eliminação após o uso, a persistência ao longo do tempo e o acúmulo no ambiente, acarretando conseqüências adversas consideráveis à saúde pública e um impacto negativo nos ecossistemas. A cultura do milho merece atenção pela elevada quantidade de herbicidas usados. O mesotrione é um novo herbicida seletivo utilizado na cultura do milho. Devido sua introdução recente, há pouca informação referente ao risco ecotoxicológico do mesotrione e de seus produtos de degradação. Apenas duas linhagens bacterianas do gênero Bacillus, degradadoras do mesotrione, provenientes do solo e da água, já foram isoladas e identificadas. O objetivo deste estudo foi isolar e caracterizar linhagens bacterianas endofíticas e epifíticas, isoladas das folhas de milho, com capacidade de biodegradar o herbicida mesotrione. As coletas foram realizadas em plantação de milho variedade Penta sem tratamento com o herbicida mesotrione e em plantação de milho variedade DKB 234 com tratamento com o herbicida, na Fazenda Escola Capão da Onça, Ponta Grossa, PR. Os microrganismos foram isolados e cultivados em meio mineral com mesotrione como única fonte de carbono. Das vinte coletas foram isoladas 347 linhagens bacterianas tolerantes e/ou degradadoras. Estas foram selecionadas em concentrações crescentes do herbicida e tiveram sua capacidade de degradação investigada por espectrofotometria visível. Dez linhagens capazes de crescer na presença de altas concentrações do herbicida foram avaliadas. Destas, 9 linhagens (7 epifíticas e 2 endofíticas) foram isoladas de milho variedade Penta sem tratamento com o herbicida mesotrione e 1 foi isolada de milho variedade DKB 234 com tratamento com mesotrione. Cinco linhagens tiveram a capacidade de degradar o herbicida comprovada. Uma linhagem foi identificada como Acinetobacter baumannii e outra como Micrococcus luteus. Somente Micrococcus luteus é uma linhagem endofítica, sendo as demais epifíticas do milho. Quatro linhagens degradadoras foram isoladas de plantação de milho sem tratamento prévio com mesotrione; apenas uma linhagem de bacilo Gram-negativo não fermentador foi isolada de plantação sob tratamento com o herbicida. O crescimento, em alta concentração, das linhagens que não tiveram a capacidade de degradação do mesotrione detectada pela espectrofotometria indica a possibilidade destas linhagens participarem da degradação deste herbicida quando associadas com outros microrganismos em consórcios no ambiente. A capacidade quantitativa real de degradação do mesotrione pelas linhagens investigadas registrada pela espectrofotometria pode estar subestimada devido ao acúmulo dos produtos de degradação que possuem o mesmo comprimento de onda no espectro de absorção que a molécula de mesotrione. Este trabalho é o primeiro relato de isolamento de linhagens bacterianas degradadoras do herbicida mesotrione epifíticas e endofíticas de milho.

A cultura do guaranazeiro, (Paullinia cupana var. sorbilis) espécie nativa da região amazônica, é de grande importância para o Brasil, tanto do ponto de vista econômico quanto social. Atualmente, a comercialização do guaraná em rama (sementes torradas) é a maneira mais comumente utilizada na produção de xaropes e extratos de guaraná utilizados principalmente pelas indústrias de bebidas. O Brasil é o único produtor de guaraná no mundo, com destaque para o Estado do Amazonas e a Bahia. Entretanto, a produção de guaraná na região amazônica, centro de origem da planta, vem sendo cada vez mais afetada por condições fitossanitárias desfavoráveis, como a presença da antracnose, doença causada pelo fungo Colletotrichum spp.., que não se constitui um problema na Bahia. A finalidade da presente pesquisa foi de comparar microbiota endofítica de sementes dos dois estados na detecção de possíveis causas que poderiam explicar as diferenças de sanidade, além de procurar uma alternativa sustentável para a utilização de microrganismos endofíticos, que vivem no interior dos tecidos vegetais, e tem sido descritos como agentes de controle biológico de doenças através de vários mecanismos, dentre eles a produção de enzimas líticas. Assim, o presente estudo teve por objetivo isolar e identificar bactérias e fungos endofíticos associados à sementes de guaranazeiros provenientes do Amazonas e da Bahia. Esses microrganismos foram também avaliados quanto ao potencial biotecnológico na produção de enzimas e controle da antracnose. Para o isolamento, as sementes passaram por um processo de desinfecção. A análise da produção enzimática foi detectada por meios de culturas específicos e para o estudo da atividade antagonística contra o Colletotrichum sp. (L1) foram realizados ensaios in vitro por meio de cultura pareada. A identificação dos isolados foi realizada por sequenciamento parcial do gene 16S rDNA para isolados bacterianos, e da região ITS do rDNA para isolados fúngicos. Não foram encontradas diferenças significativas no número de isolados bacterianos em sementes das duas procedências. Fungos em pequeno número (6) foram isolados apenas de sementes da Bahia. Desses isolados foram selecionadas 102 bactérias, sendo 48 provenientes do Amazonas e 54 da Bahia. Nos testes de antagonismo houve redução de 32% a 64% do crescimento do fungo patogênico Colletotrichum por bactérias endofíticas e 8% a 52% pelos fungos endofíticos. Com relação à atividade enzimática, 13 bactérias apresentaram atividade amilolítica, 5 celulolítica, 11 pectinolítica, e 24 proteolítica. Em relação aos fungos endofíticos, todos apresentaram pelo menos uma atividade das enzimas testadas, com exceção de atividade proteolítica. Bactérias dos gêneros Bacillus, Paenibacillus, Ochrobacterium, Rhizobium e Microbacterium foram isolados como endofíticos de sementes de guaraná. Em relação a isolados fúngicos foram encontrados representantes dos gêneros Lasiodiplodia e Fusarium. Embora não tenham sido encontradas diferenças substanciais com relação aos endófitos isolados, para explicar a incidência de antracnose no Amazonas em relação à Bahia, os resultados demonstram o potencial biotecnológico de microrganismos endofíticos de sementes de guaraná na produção de enzimas e para o controle biológico da antracnose / Guarana (Paullinia cupana var. sorbilis) a plant from the Amazon region is of great importance mainly from the Amazonas state both from economic and social points of view. Currently roast seed extracts have been used for the production of soft drinks and medicinal purposes. Brazil is the only guarana producer in the world, being the states of Amazonas and Bahia the main producers in the country. However, guarana production in Amazonas state has been increasingly affected by unfavorable conditions due the plant disease anthracnose caused by fungi from the genus Colletotrichum, which is not a problem in Bahia state. The aim of the present research was to compare the endophytic microbiota from seeds derived from the two states, to detect possible causes which could explain plant sanity differences in both regions and also to use endophytic microorganisms as biological controllers, a sustainable alternative to chemical products to control the disease. Endophytic bacteria and fungi from guarana seeds obtained from Bahia and Amazonas regions were isolated and studied as antagonists against Colletotrichum sp. strain L1 and also for enzymes production. The isolates identification was performed by partial sequencing the 16S rDNA region for bacterial isolates and rDNA ITS region for fungal isolates. Fungal morphological characterization was also done. We detect few differences between the number of bacteria isolated from Bahia and Amazonas seeds. Although only reduced number of seeds were analyzed, only six fungal isolates were obtained, all from Bahia. A total of 102 bacteria isolates, 48 from Amazonas and 54 from Bahia were selected. Antagonistic tests and enzymatic activities showed that from bacteria tested, 13, 5, 11 and 24 isolates were able to produce amylolytic, cellulolytic, pectinolytic and proteolytic activities respectively. All the six fungal isolates produced the tested enzymes with exception of proteases. From the positive tests, Bacillus, Paenibacillus, Ochrobacterium, Rhizobium and Microbacterium were the genera isolated from guarana seeds and the genera Lasiodiplodia and Fusarium were found among the endophytic fungi. Although no clear distinctions among isolated endophytes were found to explain anthracnose differences in Amazonas and Bahia, the results demonstrated the biotechnological potential of selected endophytic microbiota from guarana seeds for enzyme production and in vitro control of Colletotricum, the causal agent of guarana anthracnose

Os microrganismos endofíticos são aqueles, cultiváveis ou não, que habitam o interior da planta hospedeira sem causar danos aparentes ou estruturas externas visíveis. Essa interação microrganismos-planta é intrínseca a determinadas espécies de plantas e/ou bactérias. Nas últimas décadas os estudos de microrganismos endofíticos têm sido realizados em diversas plantas hospedeiras, sendo esses estudos direcionados principalmente para a diversidade e características benéficas induzidas, inclusive o controle biológico de doenças. A doença causada pelo fungo Ceratocystis fimbriata é considerada emergente no setor florestal. O Brasil está entre os maiores produtores mundiais de eucalipto e a expansão do setor juntamente com o cultivo clonal tem acarretado o aumento da incidência de patógenos. O surgimento de novas doenças exige estudos relacionados tanto a interação do agente patogênico com hospedeiro quanto de todos os componentes do patossistema. Neste contexto, os microrganismos endofíticos têm sido descritos como potenciais controladores biológicos de doenças. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivos avaliar a interação de C. fimbriata com a comunidade bacteriana associada à Eucalyptus sp. Adicionalmente, foi estudada a possível transferência desses endófitos via sementes e o padrão de colonização de Pantoea agglomerans em plântulas. Foi observado que plantas não infestadas por C. fimbriata apresentaram maior densidade bacteriana no rizoplano (20,66 x 104 UFC.cm2 -1 de raiz), enquanto que para a comunidade endofítica, a maior densidade foi observada em plantas infectadas pelo fungo (25,13 x 104 UFC.g-1 de raiz). As análises por ARDRA possibilitaram a obtenção de 8 e 13 ribotipos nas comunidades endofítica de raiz e do rizoplano, respectivamente. Os ribotipos mais freqüentes foram identificados como Bacillus cereus. As análises de diversidade por meio de DGGE das comunidades do rizoplano e endofítica de raiz mostraram que a infestação pelo fungo interfere na colonização de Eucalyptus. Foi observado também que bactérias endofíticas estão presentes no interior de sementes de Eucalyptus spp. em uma densidade de 0,33 a 1,83 X 102 UFC.g-1, para as espécies E. camandulensis e E. urophylla, respectivamente. A densidade bacteriana endofítica de plântulas obtidas de sementes desinfectadas superficialmente variaram entre 0,27 X 102 a 0,87 X 102 UFC.g-1, para E. citriodora e o híbrido E. robusta x E. grandis, respectivamente. Em algumas espécies de Eucalyptus não foram isoladas bactérias endofíticas das sementes e plântulas. Os resultados mostraram que algumas espécies de bactérias endofíticas podem ser transmitidas verticalmente por sementes. P. agglomerans inoculada nas sementes foi capaz de colonizar as plântulas após a germinação da semente, indicando que esta pode ser uma das formas utilizadas pelos microrganismos para colonizar e se estabelecer na planta hospedeira. Assim, os resultados obtidos neste trabalho mostram ainda que possa existir interação entre a presença de C. fimbriata e a comunidade bacteriana endofítica e do rizoplano de Eucalyptus. Foi possível observar também que estas bactérias endofíticas que são transmitidas por meio de sementes, permitindo que plântulas previamente inoculadas com bactérias benéficas possam ser produzidas antes de serem levadas a campo. / The endophytic microorganisms are those, cultivated or not, that inhabit the interior of the plant host without causing apparent damages or visible external structures. This interaction microorganisms-plant is specific to certain species of plants and/or bacteria. In the last few years studies of endophytic microorganisms have been carried out in several plant hosts, being these studies focused mainly to diversity and biotechnological potential, such as biological control of disease. The disease caused by the phytopathogenic fungi Ceratocystis fimbriata is considered emerging by the reforestation companies. Brazil is one of the largest world eucalyptus producers and the increasing of the eucalyptus production associated to clonal reproduction has allowed the increase in pathogen incidence. Studies that evaluate the interaction between pathogens and the microbial community associated to the host plant may allow understanding how disease symptoms come up. Endophytic microorganisms have been described as potential biological control of diseases and therefore, the aims of the present work were to i) study the interaction between C. fimbriata and the bacterial community associated to the Eucalyptus sp.; ii) evaluate the bacterial dissemination by seeds; iii) evaluate the colonization profile of Pantoea agglomerans in seedlings after seed inoculation. It was observed that the highest bacterial density on the rhizoplane (20.66 x 104 CFU.cm2 -1 of root) was observed in C. fimbriata uninfectedplants, while for endophytic community the highest density was observed in C. fimbriata infected plants (25.13 x 104 CFU.g-1 of root). The ARDRA analyses showed that the bacterial community of eucalyptus is composed by 8 and 13 ribotypes on rhizoplane and inside the roots (endophytic), respectively. The most frequent ribotypes were identified as Bacillus cereus. The DGGE analyses of diversity of endophytic and rhizoplane community showed that fungi infection shift the colonization of Eucalyptus associated bacteria. The bacterial community inside Eucalyptus spp. seeds ranged from 0.33 to 1.83 X 102 CFU.g-1, for E. camandulensis and E. urophylla, respectively. After seed germination the endophytic bacterial density in seedlings ranged from 0,27 X 102 to 0,87 X 102 CFU.g-1, for E. citriodora and the hybrid E. robusta x E. grandis, respectively. Although, endophytic bacteria have been isolated from seeds, for some plant species, bacteria were not isolated from seedlings. Also, some bacteria may be vertically transmitted from seed to seedlings, but some is specific for seeds. Seed inoculation of P. agglomerans resulted in seedlings colonized by these bacteria, suggesting that these bacteria could be seed transmitted. The results obtained in the present study show that the fungi C. fimbriata inside the Eucalyptus host can shift the endophytic and rhizoplane bacterial diversity. Also, these endophytic bacteria could be transmitted vertically by seeds, allowing that seeds previously inoculated with beneficial bacteria may result in protected plants before planting in the field.

A cana-de-açúcar é uma das principais culturas do Brasil e nos últimos anos está recebendo especial atenção devido ao crescente aumento da área cultivada e produção de etanol para uso como biocombustível. Considerando-se sua importância econômica e a possibilidade do uso de plantas geneticamente modificadas, essa cultura tem se tornado foco de pesquisas relacionadas à produtividade e sustentabilidade. Neste contexto, o estudo de comunidades microbianas associadas à cana-de-açúcar é de fundamental importância, pois além dessas comunidades desempenharem importante papel funcional na interação com a planta, os estudos realizados nas condições tropicais são limitados. Comunidades de fungos e bactérias associadas à cana-de-açúcar geneticamente modificada IMI-1 e sua isolinha convencional SP80-1842 foram sistematicamente isoladas de plantas cultivadas em área experimental em Piracicaba, SP, Brasil. Por meio de isolamento e PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) foi verificado que a transgenia não afeta a diversidade da comunidade fúngica associada à cana-deaçúcar. A diversidade dessas comunidades foi descrita e caracterizada molecularmente. O fungo Fusarium moniliforme apresentou alta freqüência de isolamento e também foi observado que o gene da endopoligalacturonase, pgIII, desempenha um importante papel no tipo de associação, endofítica ou patogênica, do F. moniliforme e a planta. O complexo Burkholderia cepacia constitui uma importante fração da comunidade de bactérias associada à cana-de-açúcar no Brasil e isolados deste complexo são capazes de inibir o crescimento do patógeno F. moniliforme. Análises filogenéticas indicaram que os isolados de bactérias endofíticas de Burkholderia são proximamente relacionados com linhagens-tipo do complexo B. cepacia isoladas de pacientes de fibrose cística. / In Brazil, the sugarcane is one of the most important cultivated crops. The sugarcane has received increased interest in the last years because of increase of the cultivated area and ethanol production to be used as biofuel. Considering its economical importance and the possibility of the use of the genetically modified plants; this crop has become the aim of current research for productivity and sustainability. In this context, the work on microbial communities associated with sugarcane is remarkable, because both, these communities play important functional role in the interaction with the plant, and studies performed in tropical conditions are limited as well. Fungal and bacterial communities associated with genetically modified sugarcane IMI-1 and its conventional isoline SP80-1842 were systematically isolated from plants cultivated in an experimental area in Piracicaba, SP, Brazil. The fungal communities associated with sugarcane were accessed by means of cultivation approach and PCR-denaturing gradient gel electrophoresis; the results revealed that these communities are not affected by transgeny. The microbial communities\' diversity was characterized and identified by using molecular tools. The fungus Fusarium moniliforme showed high frequency in association with the plant and it was observed that the endopolygalacturonase gene, pgIII, plays important role in order to determine the sort of association, either endophytic or pathogenic, between F. moniliforme and the host. The Burkholderia cepacia complex is an integral part of the endophytic bacterial community of sugarcane in Brazil and isolates of this complex are able to control F. moniliforme growth. Phylogenetic analyses indicated that the endophytic Burkholderia are closely related to clinical isolates of the B. cepacia complex isolated from cystic fibrosis patients.

Os fungos endofíticos têm sido reconhecidos pela sua grande importância para as plantas hospedeiras, pois podem conferir proteção contra insetos herbívoros e patógenos, promover o crescimento vegetal, além de produzir metabólitos secundários com atividades biológicas diversas, entre outros. A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância social e econômica no Brasil, especialmente para o estado de São Paulo. Ultimamente esta cultura vem recebendo especial atenção devido ao crescente aumento da demanda de matéria prima, principalmente em função do acréscimo no consumo de etanol como biocombustível. Fungos do gênero Penicillium habitam os tecidos e a rizosfera de cana-de-açúcar, onde podem estabelecer associações mutualísticas com a planta e conferir diversos benefícios. Dentro deste contexto, estudos que avaliem a interação de Penicillium spp. com cana-de-açúcar são bastante promissores para geração de conhecimentos que auxiliem na otimização da agricultura. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivos a avaliação do potencial biotecnológico dos endofíticos de raiz e da rizosfera, do gênero Penicillium, pertencentes à comunidade fúngica de cana-de-açúcar, por meio de ensaios de antagonismo, produção de enzimas, solubilização de fosfato inorgânico e produção de ácido indol acético; assim como o estudo da interação de um isolado de P. pinophilum com cana-de-açúcar a partir do desenvolvimento de um sistema de transformação genética mediada pela bactéria Agrobacterium tumefaciens. Tanto a análise da atividade antimicrobiana como a produção de metabólitos apresentaram extensa variação fisiológica entre os isolados avaliados. Um isolado da espécie P. pinophilum (linhagem 44) foi escolhido para ser usado na transformação genética por mostrar-se superior estatisticamente em relação aos demais isolados nos ensaios anteriores. Para aumento da eficiência deste sistema de transformação foram avaliados diferentes parâmetros, dentre eles: tempo de co-cultivo (24 e 48 horas), concentração do indutor acetoseringona (200 M e 400 M) e tipos de membrana (papel filtro e náilon). O sistema de agrotransformação apresentou alta eficiência (482 transformantes por 107 conídios), gerando uma elevada quantidade de transformantes resistentes à higromicina B e expressando GFP. Dentre os parâmetros avaliados, a combinação que deu origem aos melhores resultados de transformação envolveu o co-cultivo por 48 horas sobre membrana de náilon, em meio de cultura contendo 200 M de acetoseringona. A interação fungo-planta foi avaliada a partir da inoculação de P. pinophilum linhagem selvagem e transformantes, em plântulas de cana-de-açúcar, seguida da análise por microscopia óptica de epifluorescência e reisolamento. Os resultados revelaram a natureza não patogênica desse fungo, uma vez que ele foi capaz de colonizar endofiticamente cana-de-açúcar e persistir nas raízes desta planta, sem levar ao desenvolvimento de qualquer sintoma de doença. Além disso, os ensaios de agrotransformação deram origem a uma biblioteca com mil e cem transformantes insercionais, o que constitui uma ferramenta importante para o estudo molecular do metabolismo secundário desse fungo endofítico e poderá contribuir para o entendimento da interação do complexo fungo-cana-de-açúcar, possibilitando no futuro a sua aplicação no melhoramento vegetal e exploração do seu potencial biotecnológico. / Endophytic fungi have been recognized for its great importance for the host plants, they may provide protection against herbivores and pathogens, promote plant growth, and produce secondary metabolites with biological activity, among other benefits. Sugarcane is a socially and economically important crop in Brazil, especially for the state of São Paulo. Lately, this culture has received special attention due to the growing demand for raw materials, mainly due to the increase in consumption of ethanol as a biofuel. Fungi Penicillium inhabit the tissues and rhizosphere of sugarcane, where they can establish mutualistic associations with the plant and provide several benefits. Within this context, studies evaluating the interaction of Penicillium spp. with sugar cane are very promising to generate knowledge in order to assist in the agriculture optimization. Thus, this study aimed to evaluate the biotechnological potential of endophytic Penicillium from root and rhizosphere, belonging to the fungal community of sugarcane, through tests of antagonism, enzyme production, solubilization of inorganic phosphate and indole acetic acid production, as well as studying the interaction of an isolate of P. pinophilum with sugarcane using the development of a system for genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Both the analysis of antimicrobial activity and the production of metabolites showed extensive physiological variation among isolates. An isolate of the species P. pinophilum (strain 44) was chosen to be used in genetic transformation for being statistically superior than the other strains in previous trials. Different parameters were evaluated to increase the efficiency of this transformation system, among them: co-culture time (24 and 48 hours), concentration of the inducer acetosyringone (200 µM and 400 µM) and types of membrane (filter paper and nylon). Agrotransformation system showed high efficiency, generating a high amount of hygromycin B resistant transformants that expressed GFP. Among the factors evaluated, the combination that showed the best results involved the transformation with a co-cultivation for 48 hours on a nylon membrane, in culture medium containing 200 µM of acetosyringone. The plant-fungus interaction was assessed from the inoculation of wild type and transformants P. pinophilum in seedlings of sugarcane followed by analysis by epifluorescence microscopy and reisolation. Results revealed the non-pathogenic nature of this fungus, since it was capable of endophytically colonize sugarcane and persisted in the roots of this plant, without developing any symptoms of illness. In addition, agrotransformation tests gave rise to a library with a thousand and one hundred insertional transformants, which is an important tool for molecular study of secondary metabolism of endophytic fungus, and may contribute to the comprehension of the complex interaction of fungus-sugarcane, allowing its future application in plant breeding and exploitation of their biotechnological potential.

Microrganismos endofíticos são aqueles, cultiváveis ou não, que habitam o interior da planta hospedeira sem causar danos aparentes, podendo ou não apresentar estruturas externas visíveis. Esta interação endófito-planta é intrínseca a determinadas espécies de plantas e/ou bactérias. Embora bactérias do gênero Curtobacterium sejam normalmente estudadas como fitopatógenas, este grupo vem sendo isolado como endófito de diferentes espécies vegetais, tais como citros, trevo, arroz, batata, milho, olmeiro, café e álamo. Tais bactérias vem sendo estudada no controle de doenças em pepino, batata e fumo, na promoção de crescimento, interagindo com bactérias promotoras de crescimento (PGPR) e fitopatógenas. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi estudar a variabilidade genética e fisiológica de Curtobacterium sp. isolados endofiticamente de citros, por meio das técnicas moleculares ARDRA, RAPD, AFLP e sequenciamento do gene 16S rRNA, além de características fisiológicas (coloração da colônia, fitopatogenicidade e perfil enzimático). Além dos isolados endofíticos de citros, foram utilizados isolados endofíticos e fitopatogênicos de diversas culturas proveniente de diferentes regiões do Brasil e outros países. Embora a coloração das colônias seja uma característica altamente variável, foi observada correlação, onde os isolados endofíticos de citros apresentaram coloração variando de alaranjado a róseo, enquanto os outros isolados analisados apresentaram coloração amarelada e creme. A análise por ARDRA possibilitou a formação de 4 ribotipos (A, B, C e D), sendo que todos os fitopatógenos foram agrupados no ribotipo D. As análises de variabilidade por meio do RAPD e AFLP permitiram a separação dos isolados bacterianos em 2 grupos principais, endófitos e fitopatógenos, além de mostrar grande variabilidade dentro do grupo de isolados endofíticos de citros. De acordo com os resultados do sequenciamento do gene 16S rRNA, os isolados endofíticos de citros foram agrupados separadamente das demais espécies analisadas. Os resultados do presente estudo demonstram que os isolados endofíticos de citros apresentam genótipo divergente, sugerindo que estes isolados possam pertencer a uma nova espécie ou subespécie de Curtobacterium. / The endophytic microorganisms are those, cultivated or not, that inhabit the interior of the plant host without causing apparent damages, presenting or not visible external structures. This interaction microorganisms-plant is specific to certain species of plants and/or bacteria. Although bacteria from genus Curtobacterium genus are normally studied as phytopathogens, this group has been isolated as endophytes from several plants, such as citrus, potato, rice, maize, coffee, elm trees, red clover and poplar. Also, this bacterium has been associated to disease biocontrol in tobacco, cucumber and potato; influencing host growth or interacting with plant growth-promoting rhizobacteria and other phytopathogenic bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the genetic and physiological variability of citrus endophytic strains of Curtobacterium by physiological traits (colony color, pathogenicity and enzymatic profile), as well as molecular techniques, such as ARDRA, RAPD, AFLP and 16S rRNA gene sequencing. In the present study endophytic and phytopathogenic strains from many different plants and regions around the world were used. Although the colony color is a high variable character, correlation was observed, since phytopathogenic strains presented yellow and ivory colors, while endophytes from citrus presented orange and pink colors. Four ARDRA profile (A, B, C, D) were observed in the evaluated population, being all phytopathogenic strains include in the ribotype D. The RAPD and AFLP analysis allocated the endophytes and phytopathogens in two different major groups, besides a high variability inside citrus endophytes cluster. According to 16S rRNA gene sequence analysis, citrus endophytic were clustered in a different group of others Curtobacterium strains. The results of the present study demonstrated that the citrus endophytic strains is a divergent genotype, suggesting that citrus endophytic strains could belong to a new Curtobacterium species or subspecies.

A cultura do guaranazeiro, (Paullinia cupana var. sorbilis) espécie nativa da região amazônica, é de grande importância para o Brasil, tanto do ponto de vista econômico quanto social. Atualmente, a comercialização do guaraná em rama (sementes torradas) é a maneira mais comumente utilizada na produção de xaropes e extratos de guaraná utilizados principalmente pelas indústrias de bebidas. O Brasil é o único produtor de guaraná no mundo, com destaque para o Estado do Amazonas e a Bahia. Entretanto, a produção de guaraná na região amazônica, centro de origem da planta, vem sendo cada vez mais afetada por condições fitossanitárias desfavoráveis, como a presença da antracnose, doença causada pelo fungo Colletotrichum spp.., que não se constitui um problema na Bahia. A finalidade da presente pesquisa foi de comparar microbiota endofítica de sementes dos dois estados na detecção de possíveis causas que poderiam explicar as diferenças de sanidade, além de procurar uma alternativa sustentável para a utilização de microrganismos endofíticos, que vivem no interior dos tecidos vegetais, e tem sido descritos como agentes de controle biológico de doenças através de vários mecanismos, dentre eles a produção de enzimas líticas. Assim, o presente estudo teve por objetivo isolar e identificar bactérias e fungos endofíticos associados à sementes de guaranazeiros provenientes do Amazonas e da Bahia. Esses microrganismos foram também avaliados quanto ao potencial biotecnológico na produção de enzimas e controle da antracnose. Para o isolamento, as sementes passaram por um processo de desinfecção. A análise da produção enzimática foi detectada por meios de culturas específicos e para o estudo da atividade antagonística contra o Colletotrichum sp. (L1) foram realizados ensaios in vitro por meio de cultura pareada. A identificação dos isolados foi realizada por sequenciamento parcial do gene 16S rDNA para isolados bacterianos, e da região ITS do rDNA para isolados fúngicos. Não foram encontradas diferenças significativas no número de isolados bacterianos em sementes das duas procedências. Fungos em pequeno número (6) foram isolados apenas de sementes da Bahia. Desses isolados foram selecionadas 102 bactérias, sendo 48 provenientes do Amazonas e 54 da Bahia. Nos testes de antagonismo houve redução de 32% a 64% do crescimento do fungo patogênico Colletotrichum por bactérias endofíticas e 8% a 52% pelos fungos endofíticos. Com relação à atividade enzimática, 13 bactérias apresentaram atividade amilolítica, 5 celulolítica, 11 pectinolítica, e 24 proteolítica. Em relação aos fungos endofíticos, todos apresentaram pelo menos uma atividade das enzimas testadas, com exceção de atividade proteolítica. Bactérias dos gêneros Bacillus, Paenibacillus, Ochrobacterium, Rhizobium e Microbacterium foram isolados como endofíticos de sementes de guaraná. Em relação a isolados fúngicos foram encontrados representantes dos gêneros Lasiodiplodia e Fusarium. Embora não tenham sido encontradas diferenças substanciais com relação aos endófitos isolados, para explicar a incidência de antracnose no Amazonas em relação à Bahia, os resultados demonstram o potencial biotecnológico de microrganismos endofíticos de sementes de guaraná na produção de enzimas e para o controle biológico da antracnose / Guarana (Paullinia cupana var. sorbilis) a plant from the Amazon region is of great importance mainly from the Amazonas state both from economic and social points of view. Currently roast seed extracts have been used for the production of soft drinks and medicinal purposes. Brazil is the only guarana producer in the world, being the states of Amazonas and Bahia the main producers in the country. However, guarana production in Amazonas state has been increasingly affected by unfavorable conditions due the plant disease anthracnose caused by fungi from the genus Colletotrichum, which is not a problem in Bahia state. The aim of the present research was to compare the endophytic microbiota from seeds derived from the two states, to detect possible causes which could explain plant sanity differences in both regions and also to use endophytic microorganisms as biological controllers, a sustainable alternative to chemical products to control the disease. Endophytic bacteria and fungi from guarana seeds obtained from Bahia and Amazonas regions were isolated and studied as antagonists against Colletotrichum sp. strain L1 and also for enzymes production. The isolates identification was performed by partial sequencing the 16S rDNA region for bacterial isolates and rDNA ITS region for fungal isolates. Fungal morphological characterization was also done. We detect few differences between the number of bacteria isolated from Bahia and Amazonas seeds. Although only reduced number of seeds were analyzed, only six fungal isolates were obtained, all from Bahia. A total of 102 bacteria isolates, 48 from Amazonas and 54 from Bahia were selected. Antagonistic tests and enzymatic activities showed that from bacteria tested, 13, 5, 11 and 24 isolates were able to produce amylolytic, cellulolytic, pectinolytic and proteolytic activities respectively. All the six fungal isolates produced the tested enzymes with exception of proteases. From the positive tests, Bacillus, Paenibacillus, Ochrobacterium, Rhizobium and Microbacterium were the genera isolated from guarana seeds and the genera Lasiodiplodia and Fusarium were found among the endophytic fungi. Although no clear distinctions among isolated endophytes were found to explain anthracnose differences in Amazonas and Bahia, the results demonstrated the biotechnological potential of selected endophytic microbiota from guarana seeds for enzyme production and in vitro control of Colletotricum, the causal agent of guarana anthracnose

O Brasil é líder absoluto no comércio internacional de suco de laranja concentrado congelado participando com 82% do volume comercializado no mundo. Guignardia citricarpa é um fungo Ascomiceto agente causal da Mancha Preta dos Citros (MPC), uma doença importante no contexto da Citricultura, causando lesões negras em frutos tornando-os impróprios para a exportação, já que não são aceitos na União Européia pois o patógeno é classificado como quarentenário. O presente trabalho teve como objetivo principal estabeler a metodologia de transformação genética de G. citricarpa para futuramente auxiliar no entendimento dos mecanismos de patogenicidade desta espécie, visando diminuir perdas na citricultura brasileira devido à MPC. Além disso, foi realizada uma análise do gene da enzima endopoligalacturonase, a qual está associada à capacidade de patógenos em colonizar plantas. Para elucidar esse fenômeno, foi realizada a busca de genes relacionados à patogenicidade em outros fungos fitopatogênicos previamente descritos e confirmados participarem no processo de doenças em diversas plantas. Considerando que esses genes possuem uma região conservada para esse fim, após o alinhamento dessas sequências foram construídos primers e o gene de endopoligalacturonase foi identificado no gênero Guignardia sp. Outra espécie pertencente a esse gênero é G. mangiferae, conhecida como endófito de citros, ou seja, coloniza os tecidos internos da planta hospedeira sem causar dano. Em análises enzimáticas foi observado que a quantidade de endopoligalacturonase produzida pela espécie patogênica é superior à da espécie endofítica, mostrando que essa enzima pode participar do processo de patogenicidade de G. citricarpa. Estudos para comprovar a participação de genes nos mecanismos de patogenicidade em diversas espécies utilizando reconhecimento de genes e genômica funcional, expressão e knockout de genes estão sendo realizados, permitindo uma visão geral da organização genômica do sistema patogênico. Pensando nisso, esse trabalho descreve pela primeira vez a metodologia de transformação genética de G. citricarpa via micélio e a obtenção de transformantes expressando a proteína verde fluorescente (GFP). Micélios do fungo foram transformados pelo sistema via Agrobacterium tumefaciens com o plasmídeo pFAT-gfp, contendo os genes de resistência à higromicina B (hgr) e da GFP. A otimização do protocolo de agrotransformação foi realizada a partir do teste de diferentes condições como: tipo de membrana, concentração de agente indutor e tempo de cocultivo. A melhor condição incluiu a utilização de membrana de éster de celulose; 200 PM de AS e 96 horas de co-cultivo. Os transformantes apresentaram alta estabilidade mitótica (82%) e tiveram a inserção do gene hgr confirmada por PCR e do gfp observada em microscopia óptica de epifluorescência. Além disso, foi acompanhado o desenvolvimento do fungo inoculado em frutos, mostrando a interação planta-patógeno. O estabelecimento do sistema de transformação por Agrobacterium para G. citricarpa possibilita o uso dessa ferramenta para estudos de mutagênese insercional e interrupção gênica visando a identificação de genes importantes, como os envolvidos com os mecanismos de patogenicidade utilizados por esse fungo. / Brazil is the world leader in the international trade of frozen orange juice concentrate, taking part with around 82% of the traded volume. Guignardia citricarpa (anamorph Phyllosticta citricarpa) is a fungal pathogen of citrus plants, being described as the causal agent of citrus black spot (CBS), one of the most important fungal diseases of citrus worldwide. Its symptoms are black lesions on fruit, making them unsuitable for the international fresh market, since they are included in the quarantine list of the European Plant Protection Organization (EPPO). Moreover, when the disease is severe it may cause extensive premature fruit drop that reduces yields of fruit for processing. Taking this into consideration, the current work aimed to improve the understanding on the pathogenic mechanisms of this fungus. Firstly, in an attempt to elucidate this phenomenon, it was performed a search for pathogenicity genes previously reported to some pathogenic fungi and confirmed to participate in the process of infection in many plants , especially endopolygalacturonase. Primers were designed using the conserved regions of the genes and allowed the identification of the Guignardia spp. endopolygalacturonase gene for the first time. This enzyme has been described as playing important role in the process of fungal diseases in plants. In the present work, enzymatic analysis showed that the pathogen G. citricarpa produced significantly greater amounts of endopolygalacturonase when compared to G. mangiferae, a closely related fungus described as a citrus endophyte. This result suggests that this enzyme may participate in the process of pathogenicity, characteristic of the pathogenic species. Genetic transformation methods have been used to prove the involvement of genes in pathogenic mechanisms, however, a suitable methodology for G. citricarpa has not been described yet. In this way, this study describes for the first time a methodology for genetic transformation of G. citricarpa via mycelia and the successful generation of transformants expressing the green fluorescent protein (GFP) and resistant to the hygromycin B antibiotic. Mycelia of the fungus were genetically transformed via Agrobacterium tumefaciens hosting the plasmid pFAT-gfp, which carries the genes for resistance to hygromycin B (hph) and for GFP (gfp). The protocol was optimized through different test conditions (type of membrane, concentration of the inducing agent acetosyringone and duration of the co-cultivation period). The higher transformation efficiencies were observed using cellulose ester membrane, 200 PM of acetosyringone and 96 hours of cocultivation. The transformants showed high mitotic stability (82%) and the insertion of the T-DNA was confirmed by PCR and GFP expression through epifluorescence microscopy observation. Moreover, it was observed the development of the fungus in inoculated oranges, showing the plant-pathogen interaction observed by epifluorescense microscopy. The establishment of the Agrobacterium-mediated transformation system for G. citricarpa represents an important step on the search for unveiling important genes of this fungus, such as those involved in the pathogenic mechanisms.

A cultura de tecidos tem sido uma importante ferramenta amplamente utilizada para diversas finalidades, dentre elas a micropropagação tem merecido destaque devido à rápida produção de mudas saudáveis num espaço físico reduzido. Dentro deste contexto, o termo, plantas axênicas, tem sido difundido como um ideal a ser atingido nesta técnica, havendo a busca cada vez maior de métodos que eliminem de forma eficaz toda e qualquer contaminação que possa, eventualmente, crescer no meio de cultura. No entanto, cada vez mais se observa que a concepção de contaminação dentro da cultura de tecidos deve ser revista, assim como a de planta axênica, pois inúmeros trabalhos têm mostrado, que mesmo em microplantas assintomáticas consideradas axênicas, existe uma comunidade endofítica onipresente e que na sua grande maioria desempenha papel fundamental no estabelecimento, desenvolvimento e aclimatização das culturas, sendo, portanto, microrganismos benéficos que devem ser conservados no cultivo in vitro. Dessa forma, o presente trabalho teve como principal objetivo investigar a microbiota endofítica presente em diversas espécies de microplantas assintomáticas consideradas axênicas, independente de seu protocolo de cultivo in vitro, local, método de micropropagação e manipulação. Para tal, foram utilizadas microplantas assintomáticas, em fase de multiplicação por mais de um ano, provenientes de três laboratórios diferentes, submetidas à caracterização por meio de testes histoquímicos, à análises ultraestruturais, a isolamento em diferentes meios de cultura por dois métodos (trituração e fragmentação), à análises moleculares utilizando a extração do DNA genômico total e PCR-DGGE, além da extração e sequenciamento do DNA dos isolados obtidos. Os resultados obtidos pelo isolamento, testes moleculares e análises ultraestruturais, evidenciaram a presença de uma comunidade endofítica, colonizando os tecidos de diferentes espécies de microplantas, provenientes de três laboratórios distintos. Dessa forma, conclui-se que a inexistência de plantas axênicas deve ser considerada, futuramente, como um aspecto positivo dentro da cultura de tecidos, uma vez que, essa comunidade endofítica pode atribuir características de interesse agronômico às diferentes espécies vegetais. / Tissue culture has been an important tool widely used for various purposes, among them the micropropagation has been highlighted due to the rapid production of healthy seedlings in a small space. Within this context, the term axenic plant has been distributed as an ideal to be achieved in this technique, which the search based on numerous methods that effectively eliminate any contamination that may eventually grow into the culture medium. However, it is seen that the conception of contamination in tissue culture should be reviewed as well as axenic plants, because several studies have shown that even in asymptomatic microplants considered axenic, there is an ubiquitous and that the endophytic community mostly plays a fundamental role in the establishment, development and acclimatization of cultures, therefore, beneficial microorganisms that should be preserved in vitro. Thus, this study aimed to investigate the endophytic microbiota present in several species of micro asymptomatic considered \"axenic\" regardless of their protocol for in vitro culture, location, method of micropropagation and manipulation. For this purpose, were used asymptomatic microplants in multiplication stage by more than one year, from three different laboratories, and were submitted to characterization by histochemistry tests, ultrastructural analysis, isolation in different culture medium by two methods (grinding and fragmentation), molecular analyses using the extraction of total genomic DNA and PCR-DGGE, in addition to extracting and sequencing the DNA of the isolates obtained. The results obtained by the isolation, molecular and ultrastructural analysis, showed the presence of an endophytic community colonizing the tissues of different species of microplants, from three different laboratories. Thus, it was concluded that the inexistence of axenic plants should be considered in future as a positive aspect in the tissue culture, since this endophytic community can give agronomical traits to different crop species.