Diante da ausência de dados prévios, foi pretendido estabelecer uma correlação entre as possíveis modificações metabólicas e moleculares na resistência insulínica e inflamação em modelos animais de obesidade, induzida pela dieta, recebendo a suplementação de ômega 3/ALA. Além disto, pretendeu-se obter dados que permitam uma melhor elucidação dos mecanismos envolvidos na resistência insulínica neste modelo e um possível efeito preventivo da administração de ALA sobre este processo, podendo, desta forma, auxiliar no desenvolvimento de novas terapias. O objetivo do estudo foi demonstrar que a suplementação ALA reduz a resistência à insulina e a inflamação em modelo animal de obesidade. Foram divididos 40 camundongos machos (C57/BL6) em 4 grupos: controle (C), controle + ômega 3/ALA (CW), obesos (O) e obesas + ômega 3/ALA (OW). Por um período de oito semanas, os grupos O e OW receberam uma dieta hiperlipídica com 60% de lipídeos, enquanto o C e CW receberam ração padrão. Depois, os grupos CW e OW receberam suplementação de 10% de ômega 3/ALA liofilizado, extraído de semente de linhaça, diariamente, por mais 8 semanas. Observando os resultados, todos os grupos de animais tiveram o mesmo ganho de peso, assim como consumo alimentar, eficiência enérgica e eficiência alimentar. O uso do ALA diminuiu o peso da gordura subcutânea no grupo OW comparado ao O e manteve os valores semelhantes entre os outros grupos, no entanto, as comparações do peso do fígado, gordura epididimal, pâncreas e músculo gastrocnemio, foram semelhantes entre todos os grupos. Observou-se uma diminuição na resistência insulínica nos animais OW comparado ao O pelo teste de IPGTT, sendo a área sob a curva de glicose similar entre C e CW. Além disso, os níveis totais de gordura no fígado foram significativamente menores no CW e OW, em comparação com C e O, estes resultados são reforçados pela análise dos tecidos em avaliação histopatológica. Os níveis séricos de glicemia e insulina, ao final do estudo, mostraram uma redução importante em OW comparado a CW, porém, não foi observado diferenças entre os animais obesos suplementados ou não com ômega-3/ALA. Entretanto, quanto à avaliação de resistência insulínica pelo cálculo do HOMA IR, este mostrou-se menor comprando-se OW com O. Os níveis séricos de colesterol total e HDL foram maiores no grupo CW comparados ao C, sendo que os níveis de colesterol total foram menores, também, no grupo OW comparados ao O. No entanto, os valores de triglicérides séricos foram semelhantes entre todos os grupos, assim como valores de triglicérides hepáticos. Colesterol total hepático teve um aumento significativo entre OW e O. As dosagens séricas de IL1, IL6 e MCP1 mostraram uma redução importante em O comparadas com OW. Já quanto a IL17 e TNF, ambas foram equivalentes, nas comparações entre diferentes grupos. A avaliação da ativação do estresse do retículo endoplasmático mostrou que a proteína BIP teve um aumento importante tanto na comparação entre C e CW e também entre O e OW. A também chaperona HSP70 mostrou aumento significativo em ambas as comparações entre grupos, tanto em C e CW quanto em O e OW. GRP94 e IRE1 tiveram resultados semelhantes, sem diferenças entre os grupos, assim como a DAPK1. CHOP teve diminuição importante comparando-se C e CW, e O e OW. Em contrapartida, XBP1 teve diminuição importante na comparação entre os grupos C e CW. Por fim, a suplementação de ômega 3/ALA mostrou ser eficaz na prevenção de esteatose hepática, redução de resistência insulínica, diminuição do processo inflamatório, e redução da ativação do estresse do retículo endoplasmático em tecido hepático. / Given the absence of previous data, it is intended to establish a possible correlation between metabolic and molecular changes in insulin resistance and inflammation in animals receiving supplementation of -linoleic acid (ALA) found in flaxseeds oil. Furthermore, we intend to obtain data for an elucidation of the mechanisms involved in insulin resistance and preventive effect of administration of ALA on this process and may thus aid the development of new therapies. The aim of study was prove the ALA supplementation reduces insulin resistance and inflammation in an obesity animal model. 40 male mice (C57/BL6) were divided into 4 groups: control (C), control + omega 3/ALA (CW), obese (O) + omega 3/ALA and obese (OW). For a period of eight weeks, the groups O and OW received a high-fat diet with 60% fat, while the C and CW received regular chow. Then, the CW and OW groups were supplemented with 10% omega 3/ALA lyophilized, extracted from flaxseed daily, for another 8 weeks. Analyzing the results, all groups of animals had the same weight gain, and food consumption, food efficiency and energetic efficiency. The use of ALA decreased subcutaneous fat weight in group OW compared to O and remained similar values between the other groups, however, comparisons of the size of liver tissue, epididymal fat, pancreas and gastrocnemius muscle were similar among all groups. There was a decrease in insulin resistance in animals OW compared to O by GTT test, with an area under the curve of glucose similar between C and CW. Moreover, the total liver fat levels were significantly lower in CW and OW compared to C and O, these results are reinforced by histopathological tissues analysis. Serum glucose and insulin levels, at the end of the study, showed a significant reduction in OW compared to CW, however, no differences were observed between the obese animals supplemented or not with omega 3/ALA. Meanwhile, about the valuation of insulin resistance calculating by HOMA IR, this was lower in OW compared with O. Serum total cholesterol and HDL levels were higher in CW compared to the group C, and total cholesterol levels were also lower in the OW group compared to O. However, the serum levels of triglyceride were similar among all groups as well as hepatic triglycerides values. Hepatic total cholesterol increased significantly between OW and O. Serum levels of IL1, IL6 and MCP1 showed a significant reduction in O compared to OW. As for IL17 and TNF were similar for both comparisons between different groups. The evaluation of endoplasmic reticulum stress activation showed the BIP protein had a significant increase in the comparison between CW and C and also between OW and O. The also chaperone HSP70 showed a significant increase in both comparisons between groups, both in C and CW as for O and OW. GRP94 and IRE1 had similar results, with no differences between groups, as well as DAPK1. CHOP had significant decrease comparing CW and C, and O and OW. In contrast, XBP1 had significant reduction in the comparison between groups C and CW. Finally, omega 3/ALA supplementation showed to be effective in preventing hepatic esteatose, the reduction of insulin resistance, inflammation decrease, and reduction of activation of endoplasmic reticulum stress in liver tissue.

Orientador: Gabriel Forato Anhê / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T19:01:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_ThiagoMatosFerreirade_D.pdf: 1239554 bytes, checksum: 87d5fc958173ca83a217021c9d866455 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A obesidade é caracterizada pela deposição ectópica de gordura no fígado. Este acúmulo de gordura hepática (NAFLD) pode gerar consequências graves, como a hepatite não alcoólica (NASH), fator de ricos para carcino hepatocelular (HCC). A morte de hepatócitos, evento chave na evolução da NAFLD para NASH, é causada pelo excesso de nutrientes e é dependente do estresse de retículo endoplasmático (RE). O estresse no RE resulta no acúmulo de proteínas não processadas desencadeia a "unfolded protein response" (UPR), podendo gerar apoptose. A mTOR é formada basicamente por dois complexos: mTOR1 e mTOR2; ambos são sensíveis a nutrientes, a insulina e a rapamicina. O complexo mTOR2/Rictor catalisa a fosforilação da AKT, aumentando a sinalização da insulina. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre ativação da mTOR, do estresse de RE e da apoptose em hepatócito expostos a ácidos graxos livres. Observamos que a apoptose causada pelo palmitato ativa o estresse de RE de maneira tempo dependente. Não observamos alterações na fosforilação de proteínas alvo específicas para o complexo mTOR1. No entanto, a fosforilação geral da mTOR foi estimulada pelo palmitato. Altas doses de rapamicina inibiram a apoptose e do estresse de RE causado pelo palmitato, sugerindo a participação do complexo mTOR2. Estes resultados ainda foram confirmados pelo silenciamento gênico da Rictor. A fosforilação em serina 473 da AKT apresenta um caráter transitório, elevando-se em tempos que precedem morte e o estresse de RE, e diminuindo em tempos prolongados concomitantemente à apoptose. A inibição da AKT pelo "AKT inhibitor" gerou diminuição da apoptose, do estresse de RE e da incorporação lipídica na linhagem de hepatoma. Estes dados sugerem que a AKT, como alvo preferencial da mTOR2 é necessária para geração de morte e da UPR. A glicose (33.3mM) gera morte as células HepG2 e esta é inibida com baixas doses de rapamicina, mostrando possível atividade via mTOR1 nesta resposta. De outro modo, a frutose (4.5mM) que também desencadeia apoptose das células de hepatoma, tem seu efeito inibido por doses maiores de rapamicina, indicando atividade mTOR2 neste processo. No entanto, a possibilidade de diferentes monossacarídeos recrutarem complexos diferentes de mTOR para desencadear apoptose ainda precisa ser melhor explorada / Abstract: Obesity is characterized by fat ectopic deposition in liver. This hepatic fat accumulation our non-alcoholic fat liver disease (NAFLD) can have serious consequences such as non-alcoholic hepatitis (NASH), that is a factor to liver cancer. The cell death of hepatocytes is an important event in the development to NAFLD to NASH, all that are caused by excess nutrients and dependent of endoplasmic reticulum (ER) stress. The ER stress is caused by accumulation of unfolded proteins triggers the unfolded protein response (UPR), which mau cause apoptosis. mTOR is basically formed by two complexes: mTOR1 and mTOR2, both are sensitive to nutrients, insulin and rapamycin. The mTOR2/Rictor complex catalyse AKT phosphorylation increasing the insulin pathway. All together, the aim of this study was evaluate the relationship between mTOR, ER stress and apoptosis in liver cells exposed to free fatty acids. We observed that apoptosis caused by palmitate activates ER stress in a manner dependent on time. We din¿t observed changes in phosphorylation of specific target proteins to mTOR1 complex. However, a general phosphorylation of mTOR was stimulated by palmitate. High doses of rapamycin inhibited apoptosis and ER stress caused by palmitate, suggesting the participation of the mTOR2 complex. These results were further confirmed by gene silencing of Rictor. The AKT phospholylation in serine 473 has a transitional character, rising in times that preceding cell death and ER stress, and decreasing concomitantly apoptosis in prolonged times. Inhibition of AKT by AKT inhibitor caused a decrease in apoptosis, ER stress and lipid incorporation in hepatoma cell line. These data suggest that AKT, preferential targets of mTOR2 is required for generation death and UPR. Glucose (33.3mM) generates HepG2 cell death and this is inhibited by low doses on rapamycin, showing possible mTOR1 activity. Otherwise, fructose (4.5mM) also triggers apoptosis of hepatoma cells; its effect is inhibited by higher doses of rapamycin, indicating mTOR2 activity in this process. However, the possibility of different monosaccharide recruit different complexes of mTOR to trigger apoptosis should be further explored / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Orientador: Marcio Alberto Torsoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas / Made available in DSpace on 2018-08-23T21:16:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_ArinedeMattos_M.pdf: 2027179 bytes, checksum: 2320e20506f524d224919f97ec6056eb (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: É conhecido que a obesidade materna durante a gestação e lactação expõe a prole a condições inflamatórias e leva a distúrbios metabólicos e obesidade na vida adulta. Porém, não é conhecido se o evento celular relacionado aos danos da sinalização hipotalâmica, como o estresse de retículo endoplasmático (ERE) e resistência à insulina, poderia estar presente na prole. Para responder essa questão, nós avaliamos o tecido hipotalâmico e hepático em camundongos recém desmamados (d28) e o hipotálamo de camundongos recém nascidos (d0) de mães alimentadas com dieta rica em gordura (HFD-O) e dieta controle (SC-O) durante a gestação e lactação. Peso corpóreo, massa do tecido adiposo, e ingestão alimentar foram mais acentuados em camundongo HFD-O que em camundongo SC-O. Além disso, intolerância a glicose (GTT) e insulina (ITT) foram maior em HFD-O que em SC-O. Comparado com SC-O, os níveis de RNAm de IL1-?, expressão proteica de NF?B e p-JNK no hipotálamo foram aumentados em HFD-O. Além disso, comparado ao SC-O, a fosforilação da AKT hipotalâmica após estímulo com insulina foi reduzida, enquanto os marcadores de ERE (p-PERK, p-eIF2?, XBP1s, GRP78 e GRP94) foram aumentados no tecido hipotalâmico de HFD-O com d28 mas não com d0. A fosforilação hipotalâmica da AMPK estava aumentada em HFD-O comparado a SC-O com d28. Esses danos na sinalização hipotalâmica foram acompanhados de alterações hepáticas evidenciadas pelo aumento de depósito de triglicérides, ativação de proteínas próinflamatórias (NF?B, p-IKK e p-JNK), e marcadores de ERE (p-PERK e p-eIF2?). Esses resultados indicam fortemente que o período de lactação é importante para as mudanças metabólicas. Essas mudanças podem ocorrer precocemente na prole de mães obesas e contribuir para a obesidade e patologias associadas / Abstract: It is known that maternal obesity during pregnancy and lactation exposes offspring to inflammatory conditions and leads to metabolic disturbances and obesity in adult offspring. However, it is unknown whether the cellular events related to the damage to hypothalamus signaling, such as endoplasmic reticulum stress (ERS) and insulin resistance, could be present early in the offspring. To address this question, we evaluated the hypothalamic and hepatic tissues in recently weaned mice (d28) and the hypothalamus of newborn mice (d0) from dams fed HFD (HFD-O) or standard chow diet (SC-O) during pregnancy and lactation. Body weight, adipose tissue mass, and food intake were more accentuated in HFD-O mice than in SC-O mice. In addition, intolerance to glucose (GTT) and insulin (ITT) was higher in HFD-O mice than in SC-O mice. Compared with SC-O mice, levels of hypothalamic IL1-? mRNA, NF?B protein, and p-JNK were increased in HFD-O mice. Furthermore, compared with SC-O mice, hypothalamic AKT phosphorylation after insulin challenge was reduced, while markers of ERS (p-PERK, p-eIF2?, XBP1s, GRP78, and GRP94) were increased in the hypothalamic tissue of HFD-O at d28 but not at d0. Hypothalamic AMPK phosphorylation was higher in HFD-O mice than in SC-O mice at d28. These damages to hypothalamic signaling were accompanied by hepatic alterations evidenced by increased triglyceride deposits, activation of proinflammatory proteins (NF?B, p-IKK, and p-JNK), and markers of ERS (p-PERK and p-eIF2?). Taken together, these results strongly indicate that the lactation period is important for metabolic changes. These changes may occur early in offspring from obese dams and contribute to obesity and associated pathologies / Mestrado / Metabolismo e Biologia Molecular / Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo

O fator 2 derivado de células estromais, SDF2 (do inglês Stromal cell derived fator 2) é um gene de função ainda desconhecida, conservado em mamíferos e descrito primeiramente por Hamada et al. (1996). Neste estudo, observamos que a proteína Sdf2 de camundongo possui a alta similaridade de sequência em relação ao SDF2-like(L)1 humano e murino e de estrutura preditiva também similar em relação ao SDF2-like de Arabidopsis thaliana. A proteína mostrou-se sublocalizada no retículo endoplasmático e apresentou ampla distribuição nos tecidos e órgãos de camundongos. O mapeamento da expressão de Sdf2 ao longo da gestação humana e de camundongo nos mostrou que a proteína está presente em todas as etapas e compartimentos da placenta, com expressão em diversos tipos celulares. Nossos resultados sugerem que o SDF2 participa dos processos de diferenciação de células trofoblásticas humanas e murinas de maneira oposta. Em humanos, onde o processo é dependente da ativação de caspase-8 observou-se um aumento da expressão de SDF2. Em camundongos, onde o processo é por endoreduplicação, houve diminuição da expressão da proteína. A participação do SDF2 na via de estresse de retículo endoplasmático (RE) nas células trofoblásticas também foi analisada. Fatores adversos que podem levar à perda da homeostase do RE e levar a um acúmulo de proteínas mal enoveladas geram o fenômeno conhecido como Estresse de RE. O estresse de RE ativa a via de Resposta a Proteínas Mal Enoveladas (UPR, em inglês Unfolded Protein Response), que atua em diferentes vias de sinalização para aumentar a produção de chaperonas, a degradação das proteínas mal enoveladas e a diminuição da produção de novas proteínas. Estas respostas aumentam as chances de sobrevivência celular. Se, no entanto, a célula não recuperar sua homeostase, vias que levam à apoptose serão ativadas. A geração de estresse de RE pelo agente tunicamicina alterou significativamente a expressão de SDF2. Além disso, o silenciamento do gene SDF2 alterou a expressão dos principais fatores de controle de sobrevivência e apoptose da UPR. Desta forma, estes achados sugerem que o SDF2 desempenha um papel na regulação de sobrevivência/apoptose das células trofoblásticas pela via UPR. / The stromal cell derived factor 2 (SDF2) was first described by Hamada et al.(1996), is well conserved in mammals but its function is still unknown. In this study, we observed the predicted aminoacid sequence os Sdf2 is similar to human and mouse SDF2L1 sequence and the predicted Sdf2 structure is similar to SDF2-like from Arabidopsis thaliana. The protein is sublocalizes in the ER and it is widely expressed in mouse tissue and organs. The expression of Sdf2 throughout human and mouse gestation showed the protein is present in all gestational phases and compartments analysed and it is expressed by several cell types in the placenta. In trophoblast functional assays, SDF2 showed opposite expression patterns in human and mouse differentiation processes. In humans, where the process is dependent of caspase-8 activation, the protein is upregulated. Im mouse, the process is dependent of endoreduplication, the protein is downregulated. The participation of SDF2 in Endoplasmic Reticulum (ER) stress in trophoblastic cells was also evaluated. Adverse environmental conditions may lead to disruption of ER homeostasis causing accumulation of unfolded/misfolded proteins in ER, a phenomenon known as ER stress. ER stress activates the Unfolded Protein Response (UPR) that acts in several signaling cascades to improve chaperone production, misfolded protein degradation and to downregulate new protein production. These responses increase the capacity of cells to maintain alive even in stress conditions. Whether cells fail on restore homeostasis, the UPR activates apoptosis. We were able to observed that when gene silencing assays was used for SDF2, modifications in UPR cell survival/apoptosis markers were observed. In conclusion, we propose that SDF2 is playing a role in ER stress cell survival/apoptosis control in trophoblast cells.

O transplante de ilhotas pancreáticas é uma terapia promissora para o tratamento da diabetes mellitus tipo 1 (DM1). No entanto, ilhotas transplantadas estão sujeitas à rejeição pelo sistema imune dos pacientes receptores, portanto faz-se necessário o desenvolvimento de mecanismos moleculares que protejam essas células. Estudos mostraram que o hormônio prolactina (PRL) é capaz de inibir a apoptose desencadeada por citocinas pró-inflamatórias sobre células beta pancreáticas e que este processo citoprotetor depende da presença da chaperona HSPB1. Foi observado que durante o desenvolvimento do DM1, as células beta pancreáticas sofrem estresse de retículo endoplasmático e que isso contribui para desencadear apoptose. O estresse de retículo endoplasmático é caracterizado pelo acúmulo de proteínas mal dobradas nessa organela resultando na ativação da resposta a proteínas mal dobradas (UPR) que tem como finalidade recuperar a homeostase celular. No presente estudo mostramos, pela primeira vez, que PRL foi capaz de proteger células beta pancreáticas contra estresse de retículo endoplasmático promovido tanto por citocinas pró-inflamatórias (TNFα, IFNγ e IL1β) quanto pelos estressores de retículo endoplasmático: tunicamicina e tapsigargina; e que HSPB1 é essencial nesse mecanismo de citoproteção. No contexto do DM1, esse hormônio parece ter um efeito modulador da UPR aumentando os níveis de BiP, antecipando a ativação de ATF6 e PERK, mantendo a via de PERK ativa por mais tempo, inibindo a via de IRE1α, e diminuindo os níveis de CHOP em tempos maiores. Coletivamente, os resultados aqui apresentados aprofundam os conhecimentos sobre a função de HSPB1, conduzindo para o desenvolvimento de estratégias que visam à atenuação da morte de células beta por meio da modulação de uma via de proteção endógena, a qual é independente da modulação do sistema imunológico. / The islet transplantation is a promising therapy for the treatment of type 1 diabetes mellitus (T1DM). However, transplanted islets are subject to rejection by the immune system of the recipient patients, therefore the development of molecular mechanisms that protect these cells is necessary. Studies have shown that the hormone prolactin (PRL) is capable of inhibiting apoptosis triggered by pro-inflammatory cytokines on pancreatic beta cells and that this cytoprotective process depends on the presence of the chaperone HSPB1. It was observed that during the development of type 1 diabetes, pancreatic beta cells undergo endoplasmic reticulum stress and that this contributes to trigger apoptosis. The endoplasmic reticulum stress is characterized by accumulation of misfolded proteins in this organelle resulting in the activation of unfolded protein response (UPR) that aims to restore cellular homeostasis. In the present study, we show for the first time that PRL was able to protect pancreatic beta cells against endoplasmic reticulum stress promoted by both pro-inflammatory cytokines (TNFα, IFNγ and IL1β) as the endoplasmic reticulum stressors: tunicamycin and thapsigargin; and HSPB1 is essential that cytoprotective mechanism. In the context of T1DM, PRL appears to have a modulating effect of the UPR by increasing the levels of BiP, anticipating the activation of ATF6 and PERK, keeping the PERK pathway active for longer, inhibiting the pathway IRE1α, and decreasing the levels of CHOP for longer times. Collectively, the results presented here deepen the knowledge of the HSPB1 function, leading to the development of strategies inducing attenuation of beta cells death through modulation of endogenous protection means, which are independent of the modulation of the immune system.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23082号 / 医博第4709号 / 新制||医||1049(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 長船 健二, 教授 妹尾 浩, 教授 村川 泰裕 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Orientador: Fabíola Freitas de Paula Lopes / Resumo: A série de eventos desencadeados durante o período de maturação oocitária é muito susceptível ao estresse ambiental. Condições adversas tais como agentes pró-oxidantes e temperatura ambiente comprometem a função oocitária, reduzindo a capacidade de fertilização e o posterior desenvolvimento embrionário. O efeito negativo do estresse térmico sobre a fertilidade de bovinos já foi bem caracterizado. Entre os efeitos celulares do estresse térmico no oócito bovino podemos destacar a desorganização do citoesqueleto, aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), danos mitocondriais e ativação da morte celular por apoptose. Um efeito conservado do choque térmico em diferentes tipos celulares é a desnaturação de proteínas, ativando mecanismos de proteção no citoplasma celular e no retículo endoplasmático (RE) para manutenção da proteostasis. O RE funciona como sensor de estresse ambiental ativando a Unfolded Protein Response (UPR), podendo desencadear autofagia e/ou apoptose, dependendo da intensidade do estresse. Apesar da importância do RE para a função oocitária, os efeitos do choque térmico nesta organela nunca foram investigados. Portanto, os objetivos gerais desta dissertação foram determinar o papel do estresse do RE na função de oócitos bovinos submetidos ao choque térmico (Capítulo 2) e o papel da autofagia na expressão gênica e competência de desenvolvimento de oócitos bovinos submetidos a choque térmico durante a maturação in vitro (MIV) (Capítulo 3). Para os ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The series of events triggered during the oocyte maturation is very susceptible to environmental stress. Adverse conditions such as pro-oxidant agents and environmental temperature compromise oocyte function, reducing fertilization capacity and subsequent embryonic development. The negative effect of heat stress on bovine fertility has been well characterized. Among the cellular effects of heat stress on bovine oocytes, one can highlight cytoskeletal disorganization, increased production of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial damage, and activation of cell death by apoptosis. A conserved effect of heat shock on different cell types is protein denaturation, activating protection mechanisms in the cytoplasm and endoplasmic reticulum (ER) to maintain proteostasis. The ER acts as an environmental stress sensor activating Unfolded Protein Response (UPR), which can trigger autophagy and/or apoptosis, depending on the intensity of the stress. Despite the importance of ER for oocyte function, the effects of heat shock on this organelle have never been investigated. Therefore, the general objectives of this dissertation were to determine the role of ER stress on function of bovine oocytes submitted to heat shock (Chapter 2) and the role of autophagy on gene expression and developmental competence of bovine oocytes submitted to heat shock during in vitro maturation (IVM) (Chapter 3). For the ER studies, cumulus-oocyte complexes (COCs) were initially distributed in the followin... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

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Les inhibiteurs de la protéase virale (IPs) sont utilisés avec succès dans le cadre d'une thérapie anti-VIH-1. L'efficacité de ce traitement est incontestable notamment en terme de réduction de la charge virale et de maintient du taux de lymphocytes CD4 circulants. Depuis l'incorporation des IPs dans la prise en charge thérapeutique, on note une réduction significative de la morbidité et de la mortalité ainsi qu'un allongement de la durée de vie des patients. Cependant, la prise de ces molécules anti-rétrovirales s'accompagne de nombreux effets secondaires. Les plus préoccupants d'entre eux sont : une lipodystrophie partielle, une hyperlipidémie, une insulino-résistance, une athérosclérose prématurée, ainsi que des infarctus du myocarde. Les patients sont également confrontés à l'apparition de maladies généralement associées à l'âge telles que la neurodégenérescence, l'ostéopénie et le développement de tumeurs malignes. Les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans ces altérations métaboliques n'ont pas encore été élucidés. L'objectif de cette étude était d'étudier les effets cellulaires de quatre IPs (Atazanavir, Lopinavir, Ritonavir et Saquinavir) sur la cellule musculaire striée squelettique humaine. Ces travaux ont permis d'identifier une augmentation de la production d'espèces oxygénées réactives (ERO), une altération morphologique du réticulum sarco/endoplasmique (RS/RE) ainsi qu'une augmentation de l'expression de CHOP, un marqueur du stress de ce compartiment et une diminution de l'expression et de la localisation dans les microdomaines membranaires (lipid rafts) de la cavéoline 3 et de la flotilline 1. Enfin, l'utilisation d'un antioxydant, le Resvératrol protége le myotube primaire humain de ces différentes altérations engendrées par les IPs. Ces données suggèrent un rôle central de la surproduction d'ERO dans le développement du stress du RE/RS et de la perte de localisation des protéines résidantes des microdomaines membranaires. De plus , en l'absence de persceptive vaccinale concrète, le Resvératrol, au travers de ces effets protecteurs, pourrait se révéler un atout de choix dans l'atténuation des effets secondaires des IPs en contribuant ainsi à l'amélioration de la prise en charge du patient séropositif. / HIV protease inhibitors (PI) have been successfully used in highly active antiretroviral therapy (HAART) of HIV-1 infection, the most effective treatment currently available. Incorporation of protease inhibitors in HAART has significantly reduced the morbidity and mortality and prolonged the lifespan of patients with HIV infection. Protease inhibitor benefits are unfortunately compromised by a number of clinically important adverse side-effects. Most patients on HAART develop a metabolic syndrome associated with partial lipodystrophy, hyperlipidemia, insulin resistance, premature atherosclerosis and myocardial infarction. Moreover, these patients face a growing number of other age-related comorbidities, such as neurodegeneration, osteopenia and malignancies. The cellular and molecular mechanisms underlying protease inhibitor-associated metabolic abnormalities remain elusive, but they seem to be related to overproduction of reactive oxygen speci es (ROS), induction of endoplasmic reticulum stress and activation of the unfolded protein response (UPR). The objective of this thesis was to determine the cell effects of four PIs (Atazanavir, Lopinavir, Ritonavir and Saquinavir) in cultures of primary human skeletal myotubes. This study showed that PIs increased ROS production, altered sarco/endoplasmic reticulum (SR/ER) morphology, increased expression of C/EBP homologous protein, a SR/ER stress marker, and decreased expression and localization at lipid rafts of Caveolin 3 and Flotillin 1. In addition, we showed that the antioxidant Resveratrol protected the human primary myotube of these iatrogenic effects. These data suggest a central role of the overproduction of ERO in the development of SR/ER stress and mislocalization of lipid raft proteins induced by PIs. Besides, in absence of vaccine, Resveratrol may be used by a potentiel therapeutic agent to attenuate PI-induced side effects

Iron is an essential trace element for almost all living organisms. Iron overload in cells and tissues, however, leads to their disruption. Most oftenly damaged are parenchymatic organs such as the liver, pancreas and heart. The aim of this thesis was to create cellular in vitro models for the investigation of effects of excess iron on hepatocytes and pancreatic beta cells and on these models to investigate cellular processes which lead to cellular damage during iron overload. We focused on examining the presence of oxidative and endoplasmic reticulum stress and the activation of apoptotic cell death. For our experiments, we used HEP-G2 cell line which represents human hepatocytes and NES2Y cell line which represents human pancreatic beta cells. To study the mechanisms of cellular damage during iron overload, we used two approaches by which we observed both acute and long-term effects of high levels of iron on damage of the tested cell lines. When studying the acute effect of excess iron on the cells, we applied high doses of iron (using 15 mM ferric citrate in medium) that led to the activation of cell death in hours. Long-term effects of iron overload were tested on cells regularly cultivated in the presence of 50 μM and 100 μM ferric citrate over a period of several months. Iron concentrations...