CARVALHO, L. L. Inibição do mTOR agrava a mucosite intestinal induzida por irinotecano. 2016. 118 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-06T15:50:42Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_llcarvalho.pdf: 2848340 bytes, checksum: aaf346e9f648dc008eef1d64977af996 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-06T15:50:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_llcarvalho.pdf: 2848340 bytes, checksum: aaf346e9f648dc008eef1d64977af996 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-06T15:50:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_llcarvalho.pdf: 2848340 bytes, checksum: aaf346e9f648dc008eef1d64977af996 (MD5) Previous issue date: 2016-10-21 / INTRODUCTION. Colorectal cancer (CRC) is one of the most prevalent neoplasms worldwide, being one of the leading causes of death from cancer. In Brazil, it is the third most frequent cancer in men and second in women. In the last decades new drugs incorporated into the clinical protocols for the treatment of mCRM have provided a significant increase in the survival of patients with this type of malignancy. Among these drugs, irinotecan occupies a prominent place and is commonly used as the first line in the treatment of metastatic RCC. However, since all chemotherapy treatments have a burden, a quarter of patients receiving irinotecan have a severe intestinal mucositis as a more noticeable side effect. Deregulation of cell signaling pathways is certainly one of the main reasons for the development of cancer. The mammalian rapamycin target protein (mTOR) is responsible for cell growth and the PI3K / Akt / mTOR axis is often dysregulated in several types of cancer. Thus, this work focused on investigating the role of mTOR during experimental intestinal mucositis induced by irinotecan. METHODS. C57BL / 6 male mice (n = 6 / group) were given intraperitoneally with saline or irinotecan (75 mg / kg or 45 mg / kg) for four consecutive days and treated with rapamycin or everolimus (mTOR inhibitors, 1.5 mg / Kg and 3 mg / kg, respectively) followed by irinotecan administration. Periodically the body weight variation and scores were evaluated for the degree of diarrhea. After euthanasia of the animals, ileus samples were collected for determination of myeloperoxidase activity (MPO), histopathology and morphometric analysis and cytokine levels measurement [KC (human IL-8 analogue chemokine), IL-1β, TGF-β And IFN-γ]. Gene expression of the mRNA of the PI3K / Akt / mTOR pathway proteins was performed by qRT-PCR. Blood was also collected from the animals to evaluate the total white blood cell count. The ANOVA / Bonferroni or Kruskal-Wallis / Dunn tests were used for statistical analysis. P <0.05 was accepted as significant. The present work was approved by the ethics committee of UFC (protocol number 100/14). RESULTS. Animals injected with irinotecan 75 mg / kg showed an increase in the gene expression of PI3K, Akt and mTOR mRNA evidencing the participation of the pathway in iatrogeny. Irinotecan 75 mg / kg significantly reduced body weight, total leukocyte count, villus / crypt ratio and promoted a characteristic intestinal lesion when compared to the saline control group. In addition, inhibition of mTOR with rapamycin or everolimus generally aggravated most of these parameters, such as weight loss, diarrhea, histopathology, neutrophil infiltration, and inflammatory mediators such as TGF-β and IFN-γ. CONCLUSION. Inhibition of mTOR aggravates irinotecan-induced intestinal mucositis probably by increasing the pro-inflammatory response via TGF-β and IFN-γ with important involvement of Paneth's Cells. Financial support: CNPq. / INTRODUÇÃO. O câncer colorretal (CCR) é uma das neoplasias mais prevalentes em todo o mundo, sendo uma das principais causas de óbito por câncer. No Brasil, apresenta-se como o terceiro câncer mais frequente nos homens e segundo nas mulheres. Nas últimas décadas novas drogas incorporadas à protocolos clínicos para o tratamento do CCRm tem proporcionado um aumento significativo na sobrevida de pacientes com esse tipo de malignidade. Dentre estas drogas o irinotecano ocupa lugar de destaque e é comumente utilizado como primeira linha no tratamento do CCR metastático. Entretanto, como todo tratamento quimioterápico há um ônus, um quarto dos pacientes em tratamento com irinotecano apresentam uma grave mucosite intestinal como efeito colateral mais notório. A desregulação de vias de sinalização celular certamente é uma das principais razões para o desenvolvimento do câncer. A proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é responsável pelo crescimento celular e o eixo compreendido por PI3K/Akt/mTOR está frequentemente desregulada em vários tipos de câncer. Dessa forma, esse trabalho focou em investigar o papel do mTOR durante a mucosite intestinal experimental induzida pelo irinotecano. MÉTODOS. Camundongos machos C57BL/6 (n=6/grupo) foram administrados intraperitonialmente com salina ou irinotecano (75 mg/kg ou 45 mg/kg) durante quatro dias consecutivos e tratados com rapamicina ou everolimo (inibidores de mTOR, 1,5 mg/kg e 3 mg/kg, respectivamente) seguidos da administração de irinotecano. Periodicamente foram avaliados a variação de peso corpóreo e escores para avaliação do grau de diarreia. Após a eutanásia dos animais, amostras de íleo foram coletadas para determinação da atividade de mieloperoxidase (MPO), histopatologia e análise morfométrica e dosagem dos níveis de citocinas [KC (quimiocina análoga da IL-8 humana), IL-1β, TGF-β e IFN-γ]. A expressão gênica do RNAm das proteínas da via PI3K/Akt/mTOR foi realizada por qRT-PCR. Também foi colhido sangue dos animais para avaliação da contagem total de leucócitos. Os testes de ANOVA/Bonferroni ou Kruskal-Wallis/Dunn foram usados para as análises estatísticas. P<0,05 foi aceito como significativo. O presente trabalho foi aprovado pelo comitê de ética da UFC (número de protocolo Nº100/14). RESULTADOS. Os animais injetados com irinotecano 75 mg/kg apresentaram um aumento na expressão gênica do RNAm de PI3K, Akt e mTOR evidenciando a participação da via na iatrogenia. O irinotecano 75 mg/kg reduziu significativamente o peso corpóreo, contagem total de leucócitos, razão vilo/cripta e promoveu uma lesão intestinal que lhe é característico quando comparado ao grupo controle salina. Além disso, de forma geral, a inibição do mTOR com rapamicina ou everolimo agravou a maioria desses parâmetros, tais como perda de peso, diarreia, histopatologia, infiltração de neutrófilos e mediadores inflamatórios como TGF-β e IFN-γ. CONCLUSÃO. A inibição do mTOR agrava a mucosite intestinal induzida por irinotecano provavelmente pelo aumento da resposta pro-inflamatória via TGF-β e IFN-γ com participação importante das Células de Paneth. Apoio financeiro: CNPq.

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 narayana_fazolini_ioc_dout_2015.pdf: 28846913 bytes, checksum: fb7289feda75ac74ab6ff1cb6771e1e3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A obesidade é uma condição predisponente ao desenvolvimento de câncer de cólon, esôfago, pulmão, próstata, dentre outros. Um dos maiores desafios no estabelecimento da ligação de obesidade e o risco de câncer tem sido correlacionar a epidemiologia e sua base biológica, ou seja, o mecanismo pelo qual a obesidade leva ao desenvolvimento de câncer. A leptina é uma adipocitocina, produzida e secretada pelo tecido adiposo que possui além dos efeitos em nível central no controle da saciedade, ações na regulação da resposta imune e inflamatória. Temos por hipótese que os níveis elevados de leptina na obesidade ative vias de sinalização envolvidas na regulação da inflamação, metabolismo lipídico e proliferação celular em células epiteliais. Os corpúsculos lipídicos são organelas dinâmicas envolvidas no metabolismo lipídico e inflamação, e o aumento no número destas organelas foi observado no câncer de cólon humano. A mTOR é uma serina/treonina cinase que está relacionada com o estímulo à tradução de proteínas, proliferação celular e progressão tumoral. Nosso objetivo foi, portanto, estudar o papel da leptina na alteração do metabolismo lipídico e progressão tumoral. Células epiteliais intestinais (IEC-6) não-transformadas de rato foram incubadas com leptina por 6h, na presença ou ausência do inibidor de mTOR, rapamicina. O estímulo com leptina induziu aumento na formação de corpúsculos lipídicos em células IEC-6 quando comparadas às células controle após coloração com tetróxido de ósmio ou ORO. O pré-tratamento com rapamicina inibiu significantemente a indução de corpúsculos lipídicos por leptina, sugerindo um papel de mTOR na sinalização induzida por esta adipocina Nós demonstramos que a leptina aumenta a fosforilação de S6K em um mecanismo sensível à rapamicina. Além, disso, a leptina aumenta a proliferação de células epiteliais de forma dependente da via de mTOR, aumentando o número de células na fase S do ciclo celular. Através de proteoma descritivo de corpúsculos lipídicos de células de adenocarcinoma de cólon, verificamos a presença de 370 proteínas, incluindo diversas proteínas importantes no metabolismo lipídico, tradução de proteínas, sinalização e proliferação celular, sugerindo que estas organelas podem ser sítios de tradução de proteínas e sinalização, e poderiam contribuir para o fenótipo hiperproliferativo observado em tumores. Através de fracionamento subcelular e microscopia confocal, validamos que corpúsculos lipídicos de células de adenocarcinoma de cólon são sítios de localização da proteína S6K e mTOR. O estudo da regulação e ativação de mTOR e outras importantes vias durante processos patológicos como o câncer poderá contribuir para o entendimento dos mecanismos básicos de regulação do metabolismo lipídico e transformação celular de células tumorais. Dessa forma, nossos estudos podem contribuir para a identificação de novos alvos terapêuticos para o tratamento do câncer / Obesity is a predisposing condition to cancer development in colon, esophagus, lung, prostate, among others. One of the greatest challenge in establishing the link of obesity and the risk of cancer has been to establish the mechanism by which obesity leads to the development of cancer. Leptin is a adipocytokine, produced and secreted by adipose tissue that beyond its central effects in the control of satiety, has actions in the regulation of immune and inflammatory response. We hypothesized that elevated levels of leptin in obesity activate signaling pathways involved in the regulation of inflammation, lipid metabolism and cell proliferation in epithelial cells. Lipid droplets are dynamic organelles involved in lipid metabolism and inflammation, and the increase in the number of these organelles was observed in human colon cancer. mTOR is a serine / threonine kinase that regulates protein translation, cell proliferation and tumor progression. Our goal was therefore to study the impact of leptin in changes in lipid metabolism and tumor progression. Non-transformed rat intestinal epithelial cells (IEC-6) were incubated with leptin for 6h in the presence or absence of the mTOR inhibitor, rapamycin. Leptin stimulation induced increase in lipid droplet formation in IEC-6 cells when compared to control cells after staining with osmium tetroxide or ORO Pre-treatment with rapamycin significantly inhibited the induction of lipid droplet by leptin, suggesting a role for mTOR in leptin-induced signaling. Leptin treatment leads to an increase in the phosphorylation of S6K in a rapamycin-sensitive manner. In addition, leptin-induced increase in epithelial cell proliferation is dependent of mTOR. Through descriptive proteomics of lipid droplets from colon adenocarcinoma cells, we identified 370 proteins, several of them involved in lipid metabolism, translation, cell signaling and proliferation, suggesting that these organelles can be sites of protein translation, contributing to the hyperproliferative phenotype observed in tumors. We have also demonstrated by confocal microscopy and subcellular fractionation that the S6K protein and mTOR are located at lipid droplets in colon adenocarcinoma cells. The study of regulation and activation of mTOR and other important pathways for diseases like cancer may contribute to a better understanding of the basic mechanisms involved in lipid metabolism and cell transformation in tumor cells, thus permitting the identification of new therapeutic targets for treatment of cancer / 2017-03-15

A hipertrofia cardíaca é caracterizada pelo aumento do músculo cardíaco devido aumento das dimensões dos cardiomiócitos. Em condições fisiológicas ou patológicas a hipertrofia está relacionada com o aumento da força do coração, provocando alterações nas células miocárdicas. O exercício ativa a via da proteína Akt relacionada à sobrevivência celular em resposta ao exercício e atua sobre a proteína quinase mTOR, ocasionando síntese proteica e hipertrofia. A mTOR participa da proliferação e crescimento celular através da regulação da tradução da proteína. Além disso, a mTOR também controla outros processos celulares como autofagia e parece estar relacionada com a sinalização de miostatina. Portanto, quando miostatina aumentada, inibe o crescimento muscular provavelmente através da inibição de mTOR. A autofagia é um mecanismo homeostático com a finalidade de degradação e reciclagem através da ação lisossomal reciclando organelas citoplasmáticas e proteínas a fim de remover esses materiais intracelulares. A ativação da autofagia ocorre em duas situações: uma em baixo nível de fluxo autofágico, devido uma baixa energética a fim de manter a sobrevivência celular e em outra situação há ativação pronunciada a fim de esgotar os elementos celulares culminando em morte celular. Esses dois extremos nas ações autofágicas são mecanismos potenciais pró ou anti-sobrevivência. Estudos mostram uma ativação da autofagia durante o exercício agudo e parece estar relacionado com a repressão da via AKT/mTOR. Por outro lado, no exercício crônico a autofagia é ativada em músculo esquelético através de aumento das proteínas autofágicas. Tal evento é explicado pela mudança do perfil muscular esquelético pós-exercício gerando maior quantidade de metabólitos que são reciclados pelo sistema, porém em músculo cardíaco ainda está sendo estudado. A miostatina é um regulador negativo do crescimento muscular esquelético. Em doenças seu aumento resulta em perda muscular, contudo, na hipertrofia fisiológica a miostatina está reduzida no músculo esquelético e no cardíaco. A miostatina aumentada bloqueia não só Akt, mas também mTOR, favorecendo a via de degradação proteica através da maquinaria autofágica. Assim, a miostatina tem ação na autofagia durante o exercício e essas vias podem estar relacionadas com o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca.

A hipertrofia cardíaca é caracterizada pelo aumento do músculo cardíaco devido aumento das dimensões dos cardiomiócitos. Em condições fisiológicas ou patológicas a hipertrofia está relacionada com o aumento da força do coração, provocando alterações nas células miocárdicas. O exercício ativa a via da proteína Akt relacionada à sobrevivência celular em resposta ao exercício e atua sobre a proteína quinase mTOR, ocasionando síntese proteica e hipertrofia. A mTOR participa da proliferação e crescimento celular através da regulação da tradução da proteína. Além disso, a mTOR também controla outros processos celulares como autofagia e parece estar relacionada com a sinalização de miostatina. Portanto, quando miostatina aumentada, inibe o crescimento muscular provavelmente através da inibição de mTOR. A autofagia é um mecanismo homeostático com a finalidade de degradação e reciclagem através da ação lisossomal reciclando organelas citoplasmáticas e proteínas a fim de remover esses materiais intracelulares. A ativação da autofagia ocorre em duas situações: uma em baixo nível de fluxo autofágico, devido uma baixa energética a fim de manter a sobrevivência celular e em outra situação há ativação pronunciada a fim de esgotar os elementos celulares culminando em morte celular. Esses dois extremos nas ações autofágicas são mecanismos potenciais pró ou anti-sobrevivência. Estudos mostram uma ativação da autofagia durante o exercício agudo e parece estar relacionado com a repressão da via AKT/mTOR. Por outro lado, no exercício crônico a autofagia é ativada em músculo esquelético através de aumento das proteínas autofágicas. Tal evento é explicado pela mudança do perfil muscular esquelético pós-exercício gerando maior quantidade de metabólitos que são reciclados pelo sistema, porém em músculo cardíaco ainda está sendo estudado. A miostatina é um regulador negativo do crescimento muscular esquelético. Em doenças seu aumento resulta em perda muscular, contudo, na hipertrofia fisiológica a miostatina está reduzida no músculo esquelético e no cardíaco. A miostatina aumentada bloqueia não só Akt, mas também mTOR, favorecendo a via de degradação proteica através da maquinaria autofágica. Assim, a miostatina tem ação na autofagia durante o exercício e essas vias podem estar relacionadas com o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca.

A hipertrofia cardíaca é caracterizada pelo aumento do músculo cardíaco devido aumento das dimensões dos cardiomiócitos. Em condições fisiológicas ou patológicas a hipertrofia está relacionada com o aumento da força do coração, provocando alterações nas células miocárdicas. O exercício ativa a via da proteína Akt relacionada à sobrevivência celular em resposta ao exercício e atua sobre a proteína quinase mTOR, ocasionando síntese proteica e hipertrofia. A mTOR participa da proliferação e crescimento celular através da regulação da tradução da proteína. Além disso, a mTOR também controla outros processos celulares como autofagia e parece estar relacionada com a sinalização de miostatina. Portanto, quando miostatina aumentada, inibe o crescimento muscular provavelmente através da inibição de mTOR. A autofagia é um mecanismo homeostático com a finalidade de degradação e reciclagem através da ação lisossomal reciclando organelas citoplasmáticas e proteínas a fim de remover esses materiais intracelulares. A ativação da autofagia ocorre em duas situações: uma em baixo nível de fluxo autofágico, devido uma baixa energética a fim de manter a sobrevivência celular e em outra situação há ativação pronunciada a fim de esgotar os elementos celulares culminando em morte celular. Esses dois extremos nas ações autofágicas são mecanismos potenciais pró ou anti-sobrevivência. Estudos mostram uma ativação da autofagia durante o exercício agudo e parece estar relacionado com a repressão da via AKT/mTOR. Por outro lado, no exercício crônico a autofagia é ativada em músculo esquelético através de aumento das proteínas autofágicas. Tal evento é explicado pela mudança do perfil muscular esquelético pós-exercício gerando maior quantidade de metabólitos que são reciclados pelo sistema, porém em músculo cardíaco ainda está sendo estudado. A miostatina é um regulador negativo do crescimento muscular esquelético. Em doenças seu aumento resulta em perda muscular, contudo, na hipertrofia fisiológica a miostatina está reduzida no músculo esquelético e no cardíaco. A miostatina aumentada bloqueia não só Akt, mas também mTOR, favorecendo a via de degradação proteica através da maquinaria autofágica. Assim, a miostatina tem ação na autofagia durante o exercício e essas vias podem estar relacionadas com o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca.

Novas informações assimiladas pelo sistema nervoso primeiramente ficam em um estado de labilidade para depois se estabilizarem através de um processo conhecido como consolidação, que envolve síntese de proteínas. Depois da reativação, uma memória previamente consolidada retorna ao seu estado de labilidade, e para que volte a ser estável, é necessário que haja novamente síntese de proteínas. Este segundo processo é chamado de reconsolidação. Recentemente os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na regulação da síntese protéica relacionados à formação de memória de longa duração vêm sendo esclarecidos. A proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) modula a plasticidade sináptica pela regulação da fosforilação de dois alvos: a proteína ribossomal S6K e a proteína de ligação 4E. A amígdala basolateral e o hipocampo dorsal são parte integrante do sistema neural envolvido na formação e expressão de diversos tipos de memórias. Estudos indicam que a via de sinalização da mTOR no hipocampo tem um papel importante na consolidação da memória de ratos submetidos a tarefa de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e na reconsolidação da memória de medo contextual condicionado. Contudo, estudos anteriores não avaliaram o efeito da inibição de mTOR amigdalar sobre a memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos. O objetivo do presente trabalho é investigar o efeito da inibição de mTOR na amígdala basolateral por rapamicina na consolidação e reconsolidação da memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e comparar estes resultados com a inibição de mTOR no hipocampo. Ratos Wistar machos foram submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação de cânulas na amígdala basolateral e hipocampo dorsal. Os animais foram submetidos à tarefa de esquiva inibitória, um modelo animal de memória de caráter aversivo, e a tarefa de reconhecimento de objetos, um modelo animal de memória de caráter pouco aversivo. Para investigar o efeito da inibição de mTOR na consolidação e reconsolidação da memória, os animais receberam microinfusões de rapamicina intra-amigdalar e intra-hipocampal em diferentes tempos em torno do treino e do teste. Nós demonstramos que a via de sinalização de mTOR na amígdala basolateral é necessária para consolidação da memória de esquiva inibitória e de reconhecimento de objetos. Nós também mostramos que a reativação torna a memória novamente suscetível e sensível à inibição de mTOR por rapamicina. / Memory formation requires protein synthesis, but only recently the cellular and molecular mechanisms involved in the regulation of protein synthesis related to the formation of long term memory has been elucidated. During memory formation, new information is acquired by the central nervous system as an initially fragile trace that over time becomes stable through a process known as consolidation. After reactivation, previously consolidated memories might return to a labile state, requiring a new round of protein synthesis to be restabilized. This second process is called reconsolidation. The basolateral amygdala and dorsal hippocampus are part of the neural systems involved in the formation and expression of several types of memory. One key regulator of protein synthesis is mTOR, a protein critical for different forms of synaptic plasticity by regulation of two targets: S6K and 4EBP. Evidence indicates that the mTOR signaling pathway in hippocampus has an important role in consolidation in rats of inhibitory avoidance and object recognition in rats, as well as in reconsolidation of contextual fear conditioning. However, previous studies have not examinated the effect of amygdalar mTOR inhibition on reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition. The aim of the present study was to evaluate the effect of amygdalar mTOR inhibition by rapamycin on consolidation and reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition, and compare the results with those obtained with hippocampal mTOR inhibition. Male rats Wistar underwent stereotaxic surgeries for cannulae implantation above the basolateral amygdala or dorsal hippocampus. After recovery, the animals were trained in inhibitory avoidance, an aversive memory task, or object recognition, a less aversive task. To investigate the effect of mTOR inhibition on memory consolidation and reconsolidation, we administered rapamycin, a specific mTOR inhibitor, into the basolateral amygdala or the dorsal hippocampus before or after training or reactivation. Our results provide evidence that mTOR in the basolateral amygdala and hippocampus might play a role in inhibitory avoidance and object recognition memory formation and reconsolidation.

Novas informações assimiladas pelo sistema nervoso primeiramente ficam em um estado de labilidade para depois se estabilizarem através de um processo conhecido como consolidação, que envolve síntese de proteínas. Depois da reativação, uma memória previamente consolidada retorna ao seu estado de labilidade, e para que volte a ser estável, é necessário que haja novamente síntese de proteínas. Este segundo processo é chamado de reconsolidação. Recentemente os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na regulação da síntese protéica relacionados à formação de memória de longa duração vêm sendo esclarecidos. A proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) modula a plasticidade sináptica pela regulação da fosforilação de dois alvos: a proteína ribossomal S6K e a proteína de ligação 4E. A amígdala basolateral e o hipocampo dorsal são parte integrante do sistema neural envolvido na formação e expressão de diversos tipos de memórias. Estudos indicam que a via de sinalização da mTOR no hipocampo tem um papel importante na consolidação da memória de ratos submetidos a tarefa de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e na reconsolidação da memória de medo contextual condicionado. Contudo, estudos anteriores não avaliaram o efeito da inibição de mTOR amigdalar sobre a memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos. O objetivo do presente trabalho é investigar o efeito da inibição de mTOR na amígdala basolateral por rapamicina na consolidação e reconsolidação da memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e comparar estes resultados com a inibição de mTOR no hipocampo. Ratos Wistar machos foram submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação de cânulas na amígdala basolateral e hipocampo dorsal. Os animais foram submetidos à tarefa de esquiva inibitória, um modelo animal de memória de caráter aversivo, e a tarefa de reconhecimento de objetos, um modelo animal de memória de caráter pouco aversivo. Para investigar o efeito da inibição de mTOR na consolidação e reconsolidação da memória, os animais receberam microinfusões de rapamicina intra-amigdalar e intra-hipocampal em diferentes tempos em torno do treino e do teste. Nós demonstramos que a via de sinalização de mTOR na amígdala basolateral é necessária para consolidação da memória de esquiva inibitória e de reconhecimento de objetos. Nós também mostramos que a reativação torna a memória novamente suscetível e sensível à inibição de mTOR por rapamicina. / Memory formation requires protein synthesis, but only recently the cellular and molecular mechanisms involved in the regulation of protein synthesis related to the formation of long term memory has been elucidated. During memory formation, new information is acquired by the central nervous system as an initially fragile trace that over time becomes stable through a process known as consolidation. After reactivation, previously consolidated memories might return to a labile state, requiring a new round of protein synthesis to be restabilized. This second process is called reconsolidation. The basolateral amygdala and dorsal hippocampus are part of the neural systems involved in the formation and expression of several types of memory. One key regulator of protein synthesis is mTOR, a protein critical for different forms of synaptic plasticity by regulation of two targets: S6K and 4EBP. Evidence indicates that the mTOR signaling pathway in hippocampus has an important role in consolidation in rats of inhibitory avoidance and object recognition in rats, as well as in reconsolidation of contextual fear conditioning. However, previous studies have not examinated the effect of amygdalar mTOR inhibition on reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition. The aim of the present study was to evaluate the effect of amygdalar mTOR inhibition by rapamycin on consolidation and reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition, and compare the results with those obtained with hippocampal mTOR inhibition. Male rats Wistar underwent stereotaxic surgeries for cannulae implantation above the basolateral amygdala or dorsal hippocampus. After recovery, the animals were trained in inhibitory avoidance, an aversive memory task, or object recognition, a less aversive task. To investigate the effect of mTOR inhibition on memory consolidation and reconsolidation, we administered rapamycin, a specific mTOR inhibitor, into the basolateral amygdala or the dorsal hippocampus before or after training or reactivation. Our results provide evidence that mTOR in the basolateral amygdala and hippocampus might play a role in inhibitory avoidance and object recognition memory formation and reconsolidation.

Novas informações assimiladas pelo sistema nervoso primeiramente ficam em um estado de labilidade para depois se estabilizarem através de um processo conhecido como consolidação, que envolve síntese de proteínas. Depois da reativação, uma memória previamente consolidada retorna ao seu estado de labilidade, e para que volte a ser estável, é necessário que haja novamente síntese de proteínas. Este segundo processo é chamado de reconsolidação. Recentemente os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na regulação da síntese protéica relacionados à formação de memória de longa duração vêm sendo esclarecidos. A proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) modula a plasticidade sináptica pela regulação da fosforilação de dois alvos: a proteína ribossomal S6K e a proteína de ligação 4E. A amígdala basolateral e o hipocampo dorsal são parte integrante do sistema neural envolvido na formação e expressão de diversos tipos de memórias. Estudos indicam que a via de sinalização da mTOR no hipocampo tem um papel importante na consolidação da memória de ratos submetidos a tarefa de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e na reconsolidação da memória de medo contextual condicionado. Contudo, estudos anteriores não avaliaram o efeito da inibição de mTOR amigdalar sobre a memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos. O objetivo do presente trabalho é investigar o efeito da inibição de mTOR na amígdala basolateral por rapamicina na consolidação e reconsolidação da memória de esquiva inibitória e reconhecimento de objetos e comparar estes resultados com a inibição de mTOR no hipocampo. Ratos Wistar machos foram submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação de cânulas na amígdala basolateral e hipocampo dorsal. Os animais foram submetidos à tarefa de esquiva inibitória, um modelo animal de memória de caráter aversivo, e a tarefa de reconhecimento de objetos, um modelo animal de memória de caráter pouco aversivo. Para investigar o efeito da inibição de mTOR na consolidação e reconsolidação da memória, os animais receberam microinfusões de rapamicina intra-amigdalar e intra-hipocampal em diferentes tempos em torno do treino e do teste. Nós demonstramos que a via de sinalização de mTOR na amígdala basolateral é necessária para consolidação da memória de esquiva inibitória e de reconhecimento de objetos. Nós também mostramos que a reativação torna a memória novamente suscetível e sensível à inibição de mTOR por rapamicina. / Memory formation requires protein synthesis, but only recently the cellular and molecular mechanisms involved in the regulation of protein synthesis related to the formation of long term memory has been elucidated. During memory formation, new information is acquired by the central nervous system as an initially fragile trace that over time becomes stable through a process known as consolidation. After reactivation, previously consolidated memories might return to a labile state, requiring a new round of protein synthesis to be restabilized. This second process is called reconsolidation. The basolateral amygdala and dorsal hippocampus are part of the neural systems involved in the formation and expression of several types of memory. One key regulator of protein synthesis is mTOR, a protein critical for different forms of synaptic plasticity by regulation of two targets: S6K and 4EBP. Evidence indicates that the mTOR signaling pathway in hippocampus has an important role in consolidation in rats of inhibitory avoidance and object recognition in rats, as well as in reconsolidation of contextual fear conditioning. However, previous studies have not examinated the effect of amygdalar mTOR inhibition on reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition. The aim of the present study was to evaluate the effect of amygdalar mTOR inhibition by rapamycin on consolidation and reconsolidation of inhibitory avoidance and object recognition, and compare the results with those obtained with hippocampal mTOR inhibition. Male rats Wistar underwent stereotaxic surgeries for cannulae implantation above the basolateral amygdala or dorsal hippocampus. After recovery, the animals were trained in inhibitory avoidance, an aversive memory task, or object recognition, a less aversive task. To investigate the effect of mTOR inhibition on memory consolidation and reconsolidation, we administered rapamycin, a specific mTOR inhibitor, into the basolateral amygdala or the dorsal hippocampus before or after training or reactivation. Our results provide evidence that mTOR in the basolateral amygdala and hippocampus might play a role in inhibitory avoidance and object recognition memory formation and reconsolidation.

Orientadores: Sandra Martha Gomes Dias, Marília Meira Dias / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T09:41:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ascencao_CarollineFernandaRodrigues_M.pdf: 4713312 bytes, checksum: b65183d96535d66661af745a562f2d58 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A proliferação celular comanda os processos de embriogênese e de crescimento do organismo, sendo essencial para a correta função de vários tecidos adultos. Apesar de ser importante para a homeostase do organismo, a sua desregulação compõe a força motriz do desenvolvimento tumoral. Somente nos últimos vinte anos começou a ser evidenciada a relação entre as vias de tradução de sinais estimuladas por fatores de crescimento e a reorganização da atividade metabólica, a qual precisa priorizar a biossíntese e o aumento da biomassa, processos essenciais para a divisão celular. Em células tumorais, o consumo de glutamina é aumentando concomitante ao aumento da atividade de glutaminase. Três isoenzimas de glutaminase são expressas na maioria dos tecidos (liver-type glutaminase, kidney-type glutaminase e glutaminase C), todavia pouco se sabe sobre a necessidade específica de cada uma delas para o metabolismo tumoral. Vários artigos recentes têm definido o papel da glutaminólise, ou metabolismo da glutamina e seus subprodutos, na ativação da mTOR. Neste sentido é uma hipótese válida imaginar que mTOR possa contra-regular glutaminase. Desta maneira, resolvemos investigar se mTOR atua na regulação da atividade de glutaminase. Para tanto, realizamos knockdown estável de PTEN em células MDA-MB 231 e verificamos que não o mesmo afetou os níveis protéicos de GAC e KGA, assim como não houve mudança na localização subcelular das isoformas. Cinética enzimática da fração mitocondrial desta linhagem revelou que o knockdown de PTEN levou à uma diminuição do KM da enzima sem alteração de Vmax. De acordo, o tratamento com rapamicina, inibidor da mTOR, elevou o KM para os níveis detectados nas células controles. A atividade de glutaminase de lisado total de MDA-MB 231, NIH 3T3, IMR90 e BJ5TA foi afetada pelo tratamento com rapamicina conforme julgado por ensaios de dose e tempo resposta. Mais, ensaios de privação de glicose, glutamina e de fatores de crescimento levaram à inibição de mTOR e concomitante redução da atividade de glutaminase. Somado a isso, o knockdown estável de TSC2 em MDA-MB 231 e BJ5TA, assim como o knockout de TSC2 em MEF, promoveu superestimulação de mTOR e foi capaz de aumentar a atividade de glutaminase. Dosagem de atividade de glutaminase de células MDA-MB 231 com knockdown de GAC, KGA ou GAC/KGA tratadas com rapamicina indicaram que mTOR possa agir em ambas as isoformas. Curioso foi que apenas células shGAC e shGAC/KGA apresentaram redução da fosforilação de S6K em Thr389 indicando que GAC ou o metabolismo de glutamina via esta isoforma, possa contra-regular mTOR. Em adição, na comparação entre PC3 e DU145, verificamos que DU145 apresentou maior expressão de GAC, maior consumo de glutamina, maior dependência de glutamina em seu crescimento, maior sensibilidade ao inibidor de glutaminase, BPTES, e por fim, se mostrou mais responsiva à metformina, ativador indireto de AMPK. A ativação de AMPK por metformina, um conhecido sensor de estresse energético, mostrou diminuir a atividade de glutaminase em célula de tumor de próstata, DU145, indicando uma potencial ação de AMPK na atividade de glutaminase / Abstract: Cell proliferation is crucial for embryogenesis and organism growth, being also essential for the proper function of several adult tissues. Although important for the homeostasis of the organism, its deregulation composes the driving force of tumor development. In the past twenty years the relationship between the processes of signal translation stimulated by growth factors and the reorganization of metabolic activity has become more evident. Growing cells need to prioritize the biosynthesis and biomass increase, processes essential for cell division. In tumor cells, the glutamine consumption is increased concurrently with the increasing in the glutaminase activity. Three glutaminase isoenzymes are expressed in most tissues (liver- type glutaminase, kidney -type glutaminase and glutaminase C), but not much is known about the necessity of each isoform for the tumor metabolism. Several recent papers have defined the role of glutaminolysis or glutamine metabolism in mTOR activation. So it is a valid hypothesis to speculate that mTOR can counter-regulate glutaminase. Thus, we decided to investigate whether mTOR can control glutaminase activity. To this end, we have made MDA - MB 231 cells stably knocked down for PTEN and verified no alteration in KGA and GAC protein levels, as well as there was no change on their subcellular location. Enzyme kinetics of the MDA-MB 231 mitochondrial fraction revealed that PTEN knockdown led to a decrease in the KM of the enzyme without changing Vmax. Accordingly, the treatment with rapamycin (mTOR inhibitor), led to an increase in KM back to the level detected in control cells. The glutaminase activity of MDA - MB 231, NIH 3T3, IMR90 and BJ5TA total cellular lysates was also affected by rapamycin treatment in a dose- and time-response fashion. Moreover, glucose, glutamine and growth factors deprivation promoted mTOR inhibition and concomitant reduction on glutaminase activity. Glutaminase activity of MDA-MB 231 cells knocked down for GAC, KGA or GAC/KGA and treated with rapamycin indicated that mTOR can regulate both isoforms. Curiously, it was only on GAC or GAC/KGA knocked down cells that we observed a decrease in S6K Thr 389 phosphorylation, which could indicate that GAC or the GAC dependent-glutamine metabolism is a specific mTOR counter-regulator. Accordling, stable TSC2 knockdown in MDA-MB 231 and BJ5TA, as well as TCS2 knockout in MEF cells, promoted overstimulation of mTOR and increasing on glutaminase activity. Moreover, a comparison between PC3 and DU145 revealed that DU145 has higher GAC expression, greater consumption of glutamine, is more dependent on glutamine for its growth, more sensitive to the inhibitor of glutaminase, BPTES, and more responsive to metformin, an indirect AMPK activator. The activation of AMPK by metformin, a known energy stress sensor, led to a decreased glutaminase activity in the prostate tumor cell line DU145 indicating a potential role of AMPK on glutaminase activity / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Gabriel Forato Anhê / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T19:01:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_ThiagoMatosFerreirade_D.pdf: 1239554 bytes, checksum: 87d5fc958173ca83a217021c9d866455 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A obesidade é caracterizada pela deposição ectópica de gordura no fígado. Este acúmulo de gordura hepática (NAFLD) pode gerar consequências graves, como a hepatite não alcoólica (NASH), fator de ricos para carcino hepatocelular (HCC). A morte de hepatócitos, evento chave na evolução da NAFLD para NASH, é causada pelo excesso de nutrientes e é dependente do estresse de retículo endoplasmático (RE). O estresse no RE resulta no acúmulo de proteínas não processadas desencadeia a "unfolded protein response" (UPR), podendo gerar apoptose. A mTOR é formada basicamente por dois complexos: mTOR1 e mTOR2; ambos são sensíveis a nutrientes, a insulina e a rapamicina. O complexo mTOR2/Rictor catalisa a fosforilação da AKT, aumentando a sinalização da insulina. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre ativação da mTOR, do estresse de RE e da apoptose em hepatócito expostos a ácidos graxos livres. Observamos que a apoptose causada pelo palmitato ativa o estresse de RE de maneira tempo dependente. Não observamos alterações na fosforilação de proteínas alvo específicas para o complexo mTOR1. No entanto, a fosforilação geral da mTOR foi estimulada pelo palmitato. Altas doses de rapamicina inibiram a apoptose e do estresse de RE causado pelo palmitato, sugerindo a participação do complexo mTOR2. Estes resultados ainda foram confirmados pelo silenciamento gênico da Rictor. A fosforilação em serina 473 da AKT apresenta um caráter transitório, elevando-se em tempos que precedem morte e o estresse de RE, e diminuindo em tempos prolongados concomitantemente à apoptose. A inibição da AKT pelo "AKT inhibitor" gerou diminuição da apoptose, do estresse de RE e da incorporação lipídica na linhagem de hepatoma. Estes dados sugerem que a AKT, como alvo preferencial da mTOR2 é necessária para geração de morte e da UPR. A glicose (33.3mM) gera morte as células HepG2 e esta é inibida com baixas doses de rapamicina, mostrando possível atividade via mTOR1 nesta resposta. De outro modo, a frutose (4.5mM) que também desencadeia apoptose das células de hepatoma, tem seu efeito inibido por doses maiores de rapamicina, indicando atividade mTOR2 neste processo. No entanto, a possibilidade de diferentes monossacarídeos recrutarem complexos diferentes de mTOR para desencadear apoptose ainda precisa ser melhor explorada / Abstract: Obesity is characterized by fat ectopic deposition in liver. This hepatic fat accumulation our non-alcoholic fat liver disease (NAFLD) can have serious consequences such as non-alcoholic hepatitis (NASH), that is a factor to liver cancer. The cell death of hepatocytes is an important event in the development to NAFLD to NASH, all that are caused by excess nutrients and dependent of endoplasmic reticulum (ER) stress. The ER stress is caused by accumulation of unfolded proteins triggers the unfolded protein response (UPR), which mau cause apoptosis. mTOR is basically formed by two complexes: mTOR1 and mTOR2, both are sensitive to nutrients, insulin and rapamycin. The mTOR2/Rictor complex catalyse AKT phosphorylation increasing the insulin pathway. All together, the aim of this study was evaluate the relationship between mTOR, ER stress and apoptosis in liver cells exposed to free fatty acids. We observed that apoptosis caused by palmitate activates ER stress in a manner dependent on time. We din¿t observed changes in phosphorylation of specific target proteins to mTOR1 complex. However, a general phosphorylation of mTOR was stimulated by palmitate. High doses of rapamycin inhibited apoptosis and ER stress caused by palmitate, suggesting the participation of the mTOR2 complex. These results were further confirmed by gene silencing of Rictor. The AKT phospholylation in serine 473 has a transitional character, rising in times that preceding cell death and ER stress, and decreasing concomitantly apoptosis in prolonged times. Inhibition of AKT by AKT inhibitor caused a decrease in apoptosis, ER stress and lipid incorporation in hepatoma cell line. These data suggest that AKT, preferential targets of mTOR2 is required for generation death and UPR. Glucose (33.3mM) generates HepG2 cell death and this is inhibited by low doses on rapamycin, showing possible mTOR1 activity. Otherwise, fructose (4.5mM) also triggers apoptosis of hepatoma cells; its effect is inhibited by higher doses of rapamycin, indicating mTOR2 activity in this process. However, the possibility of different monosaccharide recruit different complexes of mTOR to trigger apoptosis should be further explored / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia