Dunaliella tertiolecta, uma alga verde fitoplanctônica de ampla distribuição no ambiente marinho, foi escolhida como organismo teste para estudar a possibilidade de ser utilizada no ensaio cometa, um teste de detecção de danos no DNA em células individualizadas muito utilizado na ecotoxicologia. Essas algas foram facilmente lisadas pela solução de lise alcalina iônica, seus cometas foram corados eficientemente pelo brometo de etídio e pela prata, e a análise por índice de danos apresentou boa correlação com momento de cauda, comprimento de cauda e porcentagem de DNA na cauda. As algas foram expostas a concentrações crescentes de 4-nitroquinolina-N-óxido (4NQO) e benzo[a]pireno (BAP) por 1, 2 e 4 h no escuro. Após somente 1 h de exposição, observou-se um aumento significativo de danos no DNA das algas expostas a 0,25 µM de 4NQO, demonstrando a sensibilidade das mesmas em relação a células de animais. Os dados obtidos da exposição ao BAP não foram consistentes e necessitam de verificação. A metabolização de BAP em compostos tóxicos pelas algas e o efeito das condições de luminosidade antes e durante as exposições são discutidos. Os resultados indicam que D. tertiolecta pode ser utilizada em laboratório para avaliação de genotoxicidade na água através do ensaio cometa. / D. tertiolecta, a phytoplanktonic green algae with ubiquitous distribution in the marine environment, was chosen as a test organism to study the possibility of being used in the comet assay, a frequently used test in ecotoxicology to detect DNA damage in single cells. These algae were easily lised by the alkaline ionic lysis solution, their comets were efficiently stained by ethidium bromide and silver and the damage index was well correlated to tail moment, tail length and percentage of DNA in the tail. The algae were exposed to increasing concentrations of 4-nitroquinoline-N-oxide (4NQO) and benzo[a]pyrene (BAP) for 1, 2 and 4 h in the dark. After 1 h exposure, a significant increase in the DNA damage of algae exposed to 0,25 µM of 4NQO was observed, demonstrating their sensitivity in relation to cells from animals. The data of BAP exposure were not consistent and need further verification. The metabolization of BAP to toxic compounds by algae and the light conditions before and during exposure are discussed. The results indicate that D. tertiolecta can be used in laboratory to evaluate water genotoxicity with comet assay.

Dunaliella tertiolecta, uma alga verde fitoplanctônica de ampla distribuição no ambiente marinho, foi escolhida como organismo teste para estudar a possibilidade de ser utilizada no ensaio cometa, um teste de detecção de danos no DNA em células individualizadas muito utilizado na ecotoxicologia. Essas algas foram facilmente lisadas pela solução de lise alcalina iônica, seus cometas foram corados eficientemente pelo brometo de etídio e pela prata, e a análise por índice de danos apresentou boa correlação com momento de cauda, comprimento de cauda e porcentagem de DNA na cauda. As algas foram expostas a concentrações crescentes de 4-nitroquinolina-N-óxido (4NQO) e benzo[a]pireno (BAP) por 1, 2 e 4 h no escuro. Após somente 1 h de exposição, observou-se um aumento significativo de danos no DNA das algas expostas a 0,25 µM de 4NQO, demonstrando a sensibilidade das mesmas em relação a células de animais. Os dados obtidos da exposição ao BAP não foram consistentes e necessitam de verificação. A metabolização de BAP em compostos tóxicos pelas algas e o efeito das condições de luminosidade antes e durante as exposições são discutidos. Os resultados indicam que D. tertiolecta pode ser utilizada em laboratório para avaliação de genotoxicidade na água através do ensaio cometa. / D. tertiolecta, a phytoplanktonic green algae with ubiquitous distribution in the marine environment, was chosen as a test organism to study the possibility of being used in the comet assay, a frequently used test in ecotoxicology to detect DNA damage in single cells. These algae were easily lised by the alkaline ionic lysis solution, their comets were efficiently stained by ethidium bromide and silver and the damage index was well correlated to tail moment, tail length and percentage of DNA in the tail. The algae were exposed to increasing concentrations of 4-nitroquinoline-N-oxide (4NQO) and benzo[a]pyrene (BAP) for 1, 2 and 4 h in the dark. After 1 h exposure, a significant increase in the DNA damage of algae exposed to 0,25 µM of 4NQO was observed, demonstrating their sensitivity in relation to cells from animals. The data of BAP exposure were not consistent and need further verification. The metabolization of BAP to toxic compounds by algae and the light conditions before and during exposure are discussed. The results indicate that D. tertiolecta can be used in laboratory to evaluate water genotoxicity with comet assay.

Algumas áreas do canal de Piaçaguera, localizado na Baixada Santista, SP-Brasil, apresenta alto nível contaminação por hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) entre outros contaminantes nos sedimentos. O objetivo do presente estudo foi verificar diferentes biomarcadores de exposição em bile e de efeitos genotóxicos em sangue de peixes, coletados in situ, que poderiam ser utilizados como ferramenta de monitoramento. O canal de Bertioga foi selecionado como região de referência. Embora não seja uma região sem nenhuma interferência de contaminantes, os sedimentos apresentam baixos valores para HPA, metais e atividade mutagênica. A espécie Mugil curema foi selecionada por ser freqüentemente encontrada em ambas as regiões de estudo. Observamos que os peixes coletados no canal de Piaçaguera apresentaram maior porcentagem de micronúcleos e danos ao DNA (ensaio cometa) no sangue quando comparados com a região de referência. Para o teste de micronúcleo, realizamos leituras de 1000 e 4000 células/indivíduo e não foram observadas diferenças estatísticas, sugerindo que o número de 1000 células poderia ser suficiente para gerar dados confiáveis para a espécie Mugil curema. A avaliação de mutagenicidade da bile foi realizada pelo teste Salmonella/microssoma combinado à extração de bile utilizando Blue rayon (BR) com as linhagens TA98, TA100 e YG1041 com e sem S9 (ativação metabólica). As maiores respostas mutagênicas foram observadas para os peixes coletados no canal de Piaçaguera. A mutagenicidade com a linhagem YG1041 na presença de S9 foi mais elevada quando comparado à mutagenicidade observada na ausência de S9 e também em comparação com a sua linhagem parental TA98, indicando a provável presença de compostos da classe das aminas aromáticas na bile como responsáveis pelos efeitos observados. A quantificação de metabólitos equivalentes de HPA foi realizada por HPLC/fluorescência na bile bruta e embora os resultados não se correlacionem com a mutagenicidade, altos níveis também foram encontrados para os peixes coletados no canal de Piaçaguera em comparação com Bertioga. O protocolo de amplificação do gene ras para a espécie Mugil curema foi estabelecido e os genes foram seqüenciados para verificação da presença de mutações. Não foram observadas mutações nos poucos peixes analisados e mais estudos são necessários para verificar a utilização deste biomarcador. O teste de micronúcleo, ensaio cometa e análise de mutagencidade em bile extraída por Blue rayon parecem ser ferramentas biológicas adequadas para monitoramento da qualidade ambiental de estuários contaminados. / Some areas of the Piaçaguera channel at Baixada Santista, SP, Brazil present high levels of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) among other contaminants in the sediment. The aim of the present study was to verify if biomarkers of exposure in bile and effect in blood of fishes collected in the field could be used as a monitoring tool. We selected Bertioga channel as a reference area. Although it is not a pristine area, the sediment presents low values of PAHs, metals and mutagenic activity. We selected the fish species Mugil curema, because they are frequently found in both areas during the entire year. We observed that the fish collected at the Piaçaguera channel showed a higher percentage of micronuclei and DNA damage (comet assay) in blood when compared to the Bertioga channel. The micronucleus readings were done in 1000 and 4000 cells/fish and no statistical difference was observed, suggesting that the number of 1000 cells would be sufficient to generate reliable data for the species Mugil curema , in the studied area. The mutagenicity of the bile was performed using the Salmonella/microsome assay combined with Blue rayon (BR) extraction with TA98, TA100 and YG1041 strains with and without rat liver S9. We observed that the mutagenic responses were higher in fish collected in Piaçaguera. The mutagenicity in YG1041 with S9 in fishes collected in the Piaçaguera channel was higher when compared to the mutagenicity observed in the absence of S9 and also higher than the response with the parental strain TA98. The results suggest that mutagenic polycyclic compounds, probably from the class of the aromatic amines are causing the observed effect. PAH metabolites-equivalent were also determined using HPLC/fluorescence in crude bile, and although the results did not correlate with the mutagenicity, higher levels were observed in fish collected in the Piaçaguera channel when compared to Bertioga. A protocol for amplification of the ras gene for the Mugil curema species was established and gene sequenced. No mutations were observed in the liver of the few fishes analyzed, and more studies are required to verify the utility of this biomarker in this fish. The micronuclei, comet assay and mutagenicity in bile extracted with blue rayon seem to be suitable biological tools to monitor the environmental quality of contaminated estuaries.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:18:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ThiagoMC.pdf: 54368 bytes, checksum: 8e14c2b4d3fe392bf725d169831359dc (MD5) Previous issue date: 2007-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / A contamina??o de reservat?rios de ?gua ? um dos principais problemas da atualidade. A Barragem Engenheiro Armando Ribeiro Gon?alves (EARG), (06?08 S; 37?07 W) localizada no estado do Rio Grande do Norte, ? a segunda maior barragem do nordeste brasileiro, respons?vel pelo abastecimento dom?stico de aproximadamente 415 mil habitantes do semi-?rido brasileiro. A ?gua da EARG ? captada por um sistema de adutoras, onde ? tratada e distribu?da para a popula??o. O presente trabalho teve o objetivo de avaliar o potencial genot?xico da ?gua da Barragem EARG. Para isso, foram realizados os testes cometa e micron?cleo com eritr?citos de til?pias (Oreochromis niloticus) capturadas nesse reservat?rio. Os testes Allium cepa e muta??o reversa com Salmonela typhimurium foram realizados com ?gua do reservat?rio antes e ap?s o tratamento. Al?m disso, an?lises quantitativa e qualitativa de cianobact?rias, assim como a quantifica??o das microcistinas produzidas pelas cianobact?rias presentes nesse reservat?rio foram realizados, apenas com amostras coletadas na barragem. Os resultados obtidos indicaram aumento significativo na freq??ncia de micron?cleos em eritr?citos de O. niloticus (p<0,05). A m?dia obtida foi de 2,38 ? 3,02 micron?cleos em mil c?lulas analisadas, enquanto que o controle negativo apresentou m?dia de 0,20 ? 0,41 micron?cleos. O ensaio cometa realizado com peixes da EARG foi analisado em uma escala crescente de danos (0 - 4), e mostrou resultados classificados nos n?veis 0, 1, 2 e 3, enquanto que o controle negativo apresentou resultados nos n?veis 0 e 1. Nos par?metros macrosc?picos avaliados no teste A. cepa n?o foi verificado altera??es estatisticamente significativas. Os par?metros microsc?picos indicaram diminui??o significativa no ?ndice mit?tico nos dois pontos estudados. Al?m disso, tamb?m foi detectado aumento na freq??ncia de met?fases e an?fases aberrantes em ambos os pontos, por?m estatisticamente significativo apenas na amostra sem tratamento para an?fases aberrantes. A freq??ncia de micron?cleos no teste A. cepa n?o foi significativo em rela??o ao controle negativo. Para o teste de muta??o reversa com S. typhimurium realizado com ?gua sem extra??o, os resultados n?o demonstraram mutagenicidade para ambos os pontos. Os resultados encontrados com os extratos das amostras coletadas em ambos os pontos apresentaram diferen?as estatisticamente significativa quando foi utilizada a fra??o S9 como ativador metab?lico. Para a ?gua n?o tratada, essas diferen?as foram encontradas apenas para a cepa TA98, enquanto que para a ?gua tratada, as duas linhagens apresentaram diferen?as significativas. A an?lise qualitativa de cianobact?rias demonstrou a exist?ncia de cianobact?rias potencialmente t?xicas tais como Planktothrix agardii, Cylindrospermopsis raciborskii e Microcystis panniformes. O ensaio de HPLC indicou a presen?a de 38,1 &#956;g/L de microcistinas na ?gua da EARG. O teste de muta??o reversa realizado com o extrato contendo microcistinas, n?o apresentou aumento na raz?o de mutagenicidade para TA100. O conjunto dos resultados obtidos no presente trabalho sugere que as ?guas da Barragem EARG podem conter agentes genot?xicos, capazes de alterar a informa??o gen?tica dos indiv?duos. Esses resultados indicam a necessidade de um programa de monitoramento e controle desses poluentes