Orientador: João Matins Pizauro Júnior / Coorientador: Cecília Maria Costa do Amaral / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Luís Henrique Souza Guimarães / Resumo: Bactérias do gênero Enterobacter sp. são conhecidas por produzir ácidos orgânicos e solubilizar fosfato inorgânico presente no solo. O objetivo do trabalho foi caracterizar a enzima fosfatase ácida ligada à membrana de Enterobacter sp. isolada de raízes de orquídeas Cyrtopodium paludicolum. A enzima ligada à membrana foi purificada por centrifugação a 100.000 x g durante uma hora a 4ºC. A atividade da p-nitrofenilfosfatase (PNFFásica) foi determinada descontinuamente a 37°C. A bactéria foi inoculada em meio de cultura líquido e a enzima foi estritamente regulada pelo fósforo, atingindo expressão máxima a 5 mM, em pH ótimo aparente de 3,5. Em relação aos inibidores avaliados, verificouse que o cobre apresentou inibição não-competitiva. Já o arsenato, vanadato e fosfato inibiram competitivamente a enzima, demonstrando que são análogos estruturais. A enzima exibiu comportamento "michaeliano" para a hidrólise do PNFF (atividade específica de 30,67 U/mg, Km = 0,55 mM e n = 1). Interações sítio-sítio foram observadas para a hidrólise do ATP (atividade específica de 11,2 U/mg, Km = 0,62 mM e n = 1,8) e para a hidrólise do pirofosfato (atividade específica de 15,64 U/mg, Km = 0,89 mM e n = 2,8). Os valores obtidos pela inativação térmica demonstraram que a enzima manteve-se estável a 45°C e a atividade enzimática diminuiu com o aumento da temperatura. Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida promove aumento na disponibilidade dos nutrientes para as plantas, solubilizando minerais insolúveis através da produção de enzimas, sendo um dos mecanismos que esses microrganismos utilizam para solubilização de fosfato mineral / Abstract: Bacteria of the genus Enterobacter sp. are known as organic acid producers and are able to solubilize inorganic phosphate which is present in soil. The aim of this work was to characterize the cell-wall associated acid phosphatase of Enterobacter sp. symbionts of plants and were isolated from roots of orchid Cyrtopodium paludicolum. The enzyme was obtained by centrifugation at 100.000 x g, for one hour at 4ºC and the activity from p-nitrophenilphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C Culture medium was inoculate d with bacteria and supplemented with phosphorus. Under optimal conditions (5mM phosphorus, pH 3.5) the enzyme was expressed. The activity from p-nitrophenylphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C. The enzyme presen ted Michaelis behavior for the hydrolysis of PNPP (specific activity of 30.67 U/mg, Km = 0.55 mM and n = 1). Besides site-site interactions were observed for ATP hydrolysis (specific activity of 11.2 U/mg, Km = 0.62 mM and n = 1.8) and pyrophosphate hydrolysis (specific activity of 15.64 U/mg, Km = 0.89 mM and n = 2.8). It was observed that enzyme activity decreased with increasing temperature. Inhibition studies revealed that copper inhibited the enzyme in a non-competitive manner. In contrast arsenate, and vanadate which are structural analogues of phosphate presented a competitive inhibition. The results suggest that plants expressing acid phosphatase are able to solubilize mineral phosphate and are able to hydrolyse insoluble minerals thereby increasing the availibilty of nutrients which can be used by the plant / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-01Bitstream added on 2014-06-13T18:31:26Z : No. of bitstreams: 1 sandrini_gb_me_jabo.pdf: 333023 bytes, checksum: 103aefb6c00d464c83f63b4a78d2cb4c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Bactérias do gênero Enterobacter sp. são conhecidas por produzir ácidos orgânicos e solubilizar fosfato inorgânico presente no solo. O objetivo do trabalho foi caracterizar a enzima fosfatase ácida ligada à membrana de Enterobacter sp. isolada de raízes de orquídeas Cyrtopodium paludicolum. A enzima ligada à membrana foi purificada por centrifugação a 100.000 x g durante uma hora a 4ºC. A atividade da p-nitrofenilfosfatase (PNFFásica) foi determinada descontinuamente a 37°C. A bactéria foi inoculada em meio de cultura líquido e a enzima foi estritamente regulada pelo fósforo, atingindo expressão máxima a 5 mM, em pH ótimo aparente de 3,5. Em relação aos inibidores avaliados, verificouse que o cobre apresentou inibição não-competitiva. Já o arsenato, vanadato e fosfato inibiram competitivamente a enzima, demonstrando que são análogos estruturais. A enzima exibiu comportamento “michaeliano” para a hidrólise do PNFF (atividade específica de 30,67 U/mg, Km = 0,55 mM e n = 1). Interações sítio-sítio foram observadas para a hidrólise do ATP (atividade específica de 11,2 U/mg, Km = 0,62 mM e n = 1,8) e para a hidrólise do pirofosfato (atividade específica de 15,64 U/mg, Km = 0,89 mM e n = 2,8). Os valores obtidos pela inativação térmica demonstraram que a enzima manteve-se estável a 45°C e a atividade enzimática diminuiu com o aumento da temperatura. Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida promove aumento na disponibilidade dos nutrientes para as plantas, solubilizando minerais insolúveis através da produção de enzimas, sendo um dos mecanismos que esses microrganismos utilizam para solubilização de fosfato mineral / Bacteria of the genus Enterobacter sp. are known as organic acid producers and are able to solubilize inorganic phosphate which is present in soil. The aim of this work was to characterize the cell-wall associated acid phosphatase of Enterobacter sp. symbionts of plants and were isolated from roots of orchid Cyrtopodium paludicolum. The enzyme was obtained by centrifugation at 100.000 x g, for one hour at 4ºC and the activity from p-nitrophenilphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C Culture medium was inoculate d with bacteria and supplemented with phosphorus. Under optimal conditions (5mM phosphorus, pH 3.5) the enzyme was expressed. The activity from p-nitrophenylphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C. The enzyme presen ted Michaelis behavior for the hydrolysis of PNPP (specific activity of 30.67 U/mg, Km = 0.55 mM and n = 1). Besides site-site interactions were observed for ATP hydrolysis (specific activity of 11.2 U/mg, Km = 0.62 mM and n = 1.8) and pyrophosphate hydrolysis (specific activity of 15.64 U/mg, Km = 0.89 mM and n = 2.8). It was observed that enzyme activity decreased with increasing temperature. Inhibition studies revealed that copper inhibited the enzyme in a non-competitive manner. In contrast arsenate, and vanadate which are structural analogues of phosphate presented a competitive inhibition. The results suggest that plants expressing acid phosphatase are able to solubilize mineral phosphate and are able to hydrolyse insoluble minerals thereby increasing the availibilty of nutrients which can be used by the plant

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Submitted by Programa de Pós-graduação em Biotecnologia (mebiotec.ufba@gmail.com) on 2017-04-04T13:41:41Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Final - Sueli.pdf: 2426193 bytes, checksum: 5cd08338c3132f14d2db37b31d5b43f8 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-06T13:03:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Final - Sueli.pdf: 2426193 bytes, checksum: 5cd08338c3132f14d2db37b31d5b43f8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-06T13:03:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Final - Sueli.pdf: 2426193 bytes, checksum: 5cd08338c3132f14d2db37b31d5b43f8 (MD5) / FAPESB / Recentemente tem aumentado muito o interesse em exopolissacarideos (EPS) de origem microbiana. Esse composto é um constituinte comum de muitos produtos comerciais em diferentes setores industriais como alimento, petróleo e farmacêutico. O objetivo desse trabalho foi o de quantificar e otimizar a produção de EPS a partir de duas bactérias previamente identificadas como sendo Enterobacter sp., pertencente a coleção de culturas do Laboratório de Biotecnologia e Ecologia de Micro-organismos LABEM. Os isolados foram primeiramente identificados com a nomenclatura CCMICS 544 e CCMICS 549 para ambas as cepas. Testes de cultivo em glicerol identificaram a Enterobacter CCMICS 549 como sendo a mais produtiva entre as cepas testadas alcançando a produção de EPS de aproximadamente 4 g.L-1 em 36 horas. Essa cepa foi submetida a testes genéticos (16S rRNA) e bioquímicos que a identificaram como sendo Enterobacter amnigenus grupo 2. Para otimizar a produção de EPS foi realizado planejamento experimental utilizando a Metodologia “Superficie de Resposta”. Os resultados mostraram que as condições ótimas de cultivo acontecem a 35°C, pH 7.0, agitação de 240 rpm e com 3% glicerol. Nessas condições a produção de EPS foi de 0.05 g.L-1h-1 alcançando um total de (5,012) g.L-1 em 60 horas, e com produção em meio a base de água produzida com produção de 7,27g.L-1. A viscosidade do EPS em solução foi de aproximadamente 160 cP mesmo nas condições de alta salinidade (5% NaCl), temperatura (80 oC) e baixa concentração (1%). O modelo de Ostwald-de-Waele (parâmetros k e n) indicaram um comportamento pseudoplástico em todas as concentrações testadas (0.1-2.0%, w/v), temperaturas (15-80 °C) e, principalmente, salinidade (1 a 5%). A consistência de index indica que o polímero possui propriedades reológicas promissoras para aplicação como fluido de perfuração. O tratamento térmico mostrou que o EPS perde grande parte de sua massa em temperaturas acima de 300°C, mas ainda retém 50% do seu peso total a 1000°C indicando a presença de constituintes minerais em concentrações significantes. A caracterização do EPS no infravermelho identificou semelhanças químicas significativas com a goma Xantana. / The interest in microbial produced exopolysaccharides (EPS) has increased considerably in recent years. This compound is a common constituent of many commercial products in different industrial sectors; such as food, petroleum, and pharmaceuticals. The aim of this study was to quantify and optimize EPS production from two bacterial previously identified as Enterobacter sp., Belonging to a culture collection of the Laboratory of Biotechnology and Ecology of Microorganisms LABEM. The isolates were primarily identified with CCMICS 544 and 549 CCMICS nomenclature for both strains. Culturing tests on glycerol identified Enterobacter CCMICS 549 as more productive among the strains reaching an EPS production value of about 4 g.L-1 within 36 hours. This strain was then submitted to biochemical and genetic characterization (16S rRNA), which identified such strain as Enterobacter amnigenus group 2. To optimize the production of EPS was performed using experimental design methodology "Response Surface". The results showed that the optimum condition was achieved at 35°C, pH 7.0, agitation of 240 rpm and 3% crude glycerol. In such conditions, EPS production was of 0.05 gL-1h-1 reaching a total of 5,012 g.L-1 within 60 hours, with production of water-based medium produced using production 7,27g.L-1. EPS viscosity was of about 160 cP even at high salinity (5% NaCl), temperature (80 oC) and low concentration (1%). The Ostwald-de-Waele model parameters (K and n) indicated a pseudoplastic behavior at all concentrations (0.1 to 2.0%, w/v) temperatures (15-80 °C) and especially saline (1 to 5%). The consistency index indicates that the polymer has rheological properties promising for use as a drilling fluid. Thermal treatment showed that most of mass loss occurs at 300°C, but the polymer retains about 50% of its total weight at 1000°C indicating the significant presence of mineral constituents. The characterization of EPS synthesized by Enterobacter amnigenus infrared identified significant chemical similarities with the xanthan gum.

Submitted by Caroline Varella Rodrigues null (carolvr61@hotmail.com) on 2016-09-13T20:21:24Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de mestrado - Caroline.pdf: 2303536 bytes, checksum: 62bf73f0ff7f989aa65a89bf8593fc5f (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-09-16T20:39:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rodrigues_cv_me_araiq.pdf: 2303536 bytes, checksum: 62bf73f0ff7f989aa65a89bf8593fc5f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T20:39:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rodrigues_cv_me_araiq.pdf: 2303536 bytes, checksum: 62bf73f0ff7f989aa65a89bf8593fc5f (MD5) Previous issue date: 2016-08-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A produção de biodiesel levou ao aumento do coproduto gerado desse processo, o glicerol bruto, que devido ao seu excesso, tem ganhado interesse nas transformações biotecnológicas visando à formação de produtos com valor agregado, sendo H2 de maior interesse. Este estudo avaliou o potencial da bioconversão do glicerol bruto, proveniente da produção de biodiesel a partir de óleo de cozinha usado, a hidrogênio por meio de consórcios de bactérias anaeróbias fermentativas. O glicerol bruto foi submetido ao pré-tratamento ácido (pH 3,0, HCl 1,0M) para converter sabões solúveis, considerados inibitórios ao crescimento microbiano, à ácidos graxos insolúveis. Consórcios bacterianos provenientes de estação de tratamento de água residual industrial (I) e sanitária (II e III), além da cultura pura Enterobacter sp. (inóculo IV) foram utilizados como inóculos e reativados em meio de cultivo, pH 7,0, a 37°C por 7 dias, sob condições anaeróbias. Para a obtenção de consórcios bacterianos produtores de H2, o pré-tratamento nos inóculos I, II e III foi realizado por meio do choque térmico (100°C por 15 minutos) com posterior enriquecimento por diluições seriais em meio PYG modificado e pH 5,5. Bacilos Gram positivos e formadores de endósporos foram predominantes. Os consórcios enriquecidos que apresentaram melhores desempenhos quanto à geração de H2, (I) e (II), foram utilizados para as realizações de ensaios, em batelada, em proporções crescentes de glicerol bruto pré-tratado. Nos ensaios de geração de H2, 20% do meio reacional era composto pelos inóculos (I) e (II), separadamente, em meio PYG modificado, mantidos a 37°C, pH inicial 5,5, headspace de N2 (100%) sob as seguintes condições: (a) 10 g DQO L-1 de glicerol bruto pré-tratado e 10 g DQO L-1 de glicerina; (b) 4 g DQO L-1 de glicerina e 16 g DQO L-1 de glicerol bruto pré-tratado e (c) 20 g DQO L-1 de glicerol bruto pré-tratado. Os rendimentos de H2 foram de 2,21, 1,63, 0,83, 1,05, 0,57 e 0,31 mol H2 mol-1 glicerol, respectivamente para Ensaio (I)-a (envolvendo o inóculo (I) sob a condição a), Ensaio (I)-b, Ensaio (I)-c, Ensaio (II)-a (envolvendo o inóculo (II) sob a condição a), Ensaio (II)-b e Ensaio (II)-c, com o consumo de glicerol de 26,9%, 45,8%, 56,2%, 31,7%, 59,0% e 91,0% para os respectivos ensaios citados. Foi detectado principalmente etanol em maior concentração em todos os ensaios envolvendo o inóculo (I), bem como para o inóculo (II) envolvendo os ensaios (II)-a e b, e ácido butírico em maior concentração no ensaio (II)-c. Por meio da análise de biologia molecular, a abundância relativa da ordem Clostridiales para o inóculo (I) e (II) foi, respectivamente, 91,81% e 94,70%, bem como de representantes da família Peptostreptococcaceae com alta abundância relativa para ambos os inóculos, de 85,29% e 70,26% para inóculo (I) e (II) respectivamente. Foi realizado um ensaio comparativo com cultura pura Enterobacter sp. com 20 g DQO L-1 de glicerol bruto pré-tratado e o rendimento obtido foi de 0,13 mol H2 mol-1 glicerol. Além disso, a cultura pura mostrou-se ser mais sensível nos ensaios de geração de hidrogênio devido à presença de contaminantes no glicerol bruto. Os resultados de geração de H2 envolvendo consórcios foram eficientes do ponto de vista em que foram atingidos rendimentos equivalentes, ou até mesmo superiores, aos reportados por outros trabalhos, mostrando que é possível obter hidrogênio por meio do glicerol bruto proveniente de transesterificação do óleo de cozinha usado. / The biodiesel production has led to increase co-product generated in this process, the crude glycerol, which due to its excess, has gained interest in the biotechnological transformations for aimed at formation of value-added products, considering H2 the most interest bioproduct. This study evaluated the potential of bioconversion of crude glycerol from the biodiesel production from used cooking oil, to generate hydrogen through consortia of fermentative anaerobic bacteria. The crude glycerol has been subjected to the acid pretreatment (pH 3.0, 1.0M HCl) to convert soluble soaps, considered inhibitory to microbial growth, to insoluble fatty acids. Consortia from sewage treatment of industrial waste (I) and sanitary waste (II and III), and the pure culture Enterobacter sp. (inoculum IV) were used as inocula and reactivated in growth medium, pH 7.0, at 37°C for 7 days, under anaerobic conditions. To obtain H2-producing bacterial consortia, pretreatment in inocula I, II and III was carried through the thermal shock (100°C for 15 minutes) with subsequent enrichment by serial dilutions in modified PYG and pH 5.5. Gram positive bacillis and spores-forming were predominant. The enriched consortia that showed better performances for the H2 generation, (I) and (II), were used for the assays, in batch mode, varying concentrations in increasing proportions of the crude glycerol pretreated. In the H2 generation assays, 20% of the reaction medium was composed of inoculum (I) and (II) separately in modified PYG medium, kept at 37 ° C, initial pH 5.5, headspace N2 (100%) under the following conditions: (a) 10 g COD L-1 crude glycerol pretreated and 10 g COD L-1 glycerine; (b) 4 g COD L-1 of glycerin and 16 g COD L-1 crude glycerol pretreated and (c) 20 g COD L-1 crude glycerol pretreated. H2 yields were 2.21, 1.63, 0.83, 1.05, 0.57 and 0.31 mol H2 mol-1 glycerol, respectively, for the Assay (I)-a (involving the inoculum (I) under the condition a), Assay (I) -b, Assay (I)-c, Assay (II)-a (involving the inoculum (II) under the condition a), Assay (II) -b Assay (II)-c with glycerol consumption of 26.9%, 45.8%, 56.2%, 31.7%, 59.0% and 91.0% for the respective assays cited. Ethanol was mainly detected in a higher concentration in all assays involving the inoculum (I), as well as for the inoculum (II) involving the assays (II)-a and b, and butyric acid in higher concentrations in the assay (II)-c. Through molecular biology, the relative abundance of the Clostridiales order for the inoculum (I) and (II) were, respectively, 91.81% and 94.70% as well as the Peptostreptococcaceae family showed high relative abundance for both inocula of 85.29% and 70.26% for inoculum (I) and (II) respectively. A comparative assay with a pure culture Enterobacter sp., with 20 g COD L-1 crude glycerol pretreated and the yield obtained was 0.13 mol H2 mol-1 glycerol was performed. In addition, the pure culture was shown to be more sensitive to hydrogen generation assays due to the presence of contaminants in the crude glycerol. The results of generation of H2 evolving consortia were efficient from the point of view that equivalent yields have been achieved, or even superior, to those reported by other studies showing that it is possible to obtain hydrogen by crude glycerol from cooking oil transesterification used.

Among abiotic stresses, salinity is considered the main limiting stress that negatively affects plant growth and reduces productivity worldwide. To overcome this challenge, a sustainable solution such as plant growth-promoting bacteria (PGPB) can be used to meet the increasing demand for food. The desert microbe Enterobacter sp SA187, an endophytic PGPB, induces salt tolerance in both model plant and crops. The interaction between SA187 and the host plant triggers the sulfur pathway in the bacteria which then provides multiple sulfur-containing compounds to its host plant. However, the molecular sensor of these compounds in the host plant is not known. Here, we show that SA187 activates the plant target of rapamycin (TOR) pathway. The beneficial effect of SA187 was lost in TOR mutants like raptor, and by the application of TOR inhibitor AZD8055. Next, we show that SA187 modulates the one- carbon (1C) metabolism of the host plant consisting of methionine and folate cycles. The beneficial effect of SA187 was compromised by using chemical inhibitors of folate cycle like Methotrexate (MTX) and Sulfadiazine (SDZ). The intermediates of the 1C metabolism like Homocysteine and S-adenosyl methionine (SAM) showed similar beneficial effects as SA187 colonized plants. Finally, we showed that SA187 enhances 1C metabolism activity by increasing methylation index (SAM/SAH ratio) in the plants. Taken together, we could show that host TOR-1C axis is essential for plant salt tolerance by SA187.