Background: Plastic stents used for the treatment of biliary obstruction will become occluded over time due to microbial colonization and formation of biofilms. Treatment of stent-associated cholangitis is often not effective because of inappropriate use of antimicrobial agents or antimicrobial resistance. We aimed to assess the current bacterial and fungal etiology of stentassociated biofilms, with particular emphasis on antimicrobial resistance. Methods: Patients with biliary strictures requiring endoscopic stent placement were prospectively enrolled. After the retrieval of stents, biofilms were disrupted by sonication, microorganisms were cultured, and isolates were identified by matrix-associated laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry and/or biochemical typing. Finally, minimum inhibitory concentrations (MICs) were determined for various antimicrobial agents. Selected stents were further analyzed by fluorescence in situ hybridization (FISH). Results: Among 120 patients (62.5% males, median age 64 years) with biliary strictures (35% malignant, 65% benign), 113 double pigtail polyurethane and 100 straight polyethylene stents were analyzed after a median indwelling time of 63 days (range, 1–1274 days). The stent occlusion rate was 11.5%and 13%, respectively, being associated with a significantly increased risk of cholangitis (38.5% vs. 9.1%, P<0.001). Ninety-five different bacterial and 13 fungal species were detected; polymicrobial colonization predominated (95.8% vs. 4.2%, P<0.001). Enterococci (79.3%), Enterobacteriaceae (73.7%), and Candida spp. (55.9%) were the leading pathogens. Candida species were more frequent in patients previously receiving prolonged antibiotic therapy (63% vs. 46.7%, P = 0.023). Vancomycinresistant enterococci accounted for 13.7%, extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Enterobacteriaceae with co-resistance to ciprofloxacin accounted for 13.9%, and azole-resistant Candida spp. accounted for 32.9% of the respective isolates. Conclusions: Enterococci and Candida species play an important role in the microbial colonization of biliary stents. Therefore, empirical antimicrobial treatment of stent-associated cholangitis should be guided toward enterococci, Enterobacteriaceae, streptococci, anaerobes, and Candida. To determine causative pathogens, an accurate microbiological analysis of the extracted stent(s) may be helpful.

Background: Plastic stents used for the treatment of biliary obstruction will become occluded over time due to microbial colonization and formation of biofilms. Treatment of stent-associated cholangitis is often not effective because of inappropriate use of antimicrobial agents or antimicrobial resistance. We aimed to assess the current bacterial and fungal etiology of stentassociated biofilms, with particular emphasis on antimicrobial resistance. Methods: Patients with biliary strictures requiring endoscopic stent placement were prospectively enrolled. After the retrieval of stents, biofilms were disrupted by sonication, microorganisms were cultured, and isolates were identified by matrix-associated laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry and/or biochemical typing. Finally, minimum inhibitory concentrations (MICs) were determined for various antimicrobial agents. Selected stents were further analyzed by fluorescence in situ hybridization (FISH). Results: Among 120 patients (62.5% males, median age 64 years) with biliary strictures (35% malignant, 65% benign), 113 double pigtail polyurethane and 100 straight polyethylene stents were analyzed after a median indwelling time of 63 days (range, 1–1274 days). The stent occlusion rate was 11.5%and 13%, respectively, being associated with a significantly increased risk of cholangitis (38.5% vs. 9.1%, P<0.001). Ninety-five different bacterial and 13 fungal species were detected; polymicrobial colonization predominated (95.8% vs. 4.2%, P<0.001). Enterococci (79.3%), Enterobacteriaceae (73.7%), and Candida spp. (55.9%) were the leading pathogens. Candida species were more frequent in patients previously receiving prolonged antibiotic therapy (63% vs. 46.7%, P = 0.023). Vancomycinresistant enterococci accounted for 13.7%, extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Enterobacteriaceae with co-resistance to ciprofloxacin accounted for 13.9%, and azole-resistant Candida spp. accounted for 32.9% of the respective isolates. Conclusions: Enterococci and Candida species play an important role in the microbial colonization of biliary stents. Therefore, empirical antimicrobial treatment of stent-associated cholangitis should be guided toward enterococci, Enterobacteriaceae, streptococci, anaerobes, and Candida. To determine causative pathogens, an accurate microbiological analysis of the extracted stent(s) may be helpful.

Einleitung: Das Auftreten von multiresistenten Bakterien in der Bevölkerung und in Kran-kenhäusern sowie in der Tierhaltung hat in den letzten Jahrzehnten stark zugenommen. Die weltweite Zunahme multiresistenter gramnegativer Bakterien, insbesondere Entero-bakterien wie Klebsiella (K.) pneumoniae und Escherichia (E.) coli, gibt Anlass zu wach-sender Besorgnis und ist Gegenstand zahlreicher Studien. Ziele der Untersuchungen: Im Rahmen der vorliegenden Studie sollte die Prävalenz von Extended-Spectrum-Beta-Lactamase (ESBL)-produzierenden Enterobakterien (ESBL-E) bei Milchkälbern untersucht und Risikofaktoren für deren Auftreten unter Verwendung von Daten zu Antibiotikaeinsatz, Betriebshygiene und Tiergesundheit identifiziert werden. Tiere, Material und Methoden: Zehn Betriebe mit einem Median von 781 Milchkühen (319-1701) nahmen an der Studie Teil. Die Betriebe wurden zweimal im Abstand von 7-11 Monaten besucht und Kotproben von jeweils 10 neugeborenen Kälbern gesammelt. Alle untersuchten Kälber waren jünger als zwei Wochen mit einem Durchschnittsalter von 6,8 (±3,9) Tagen. Die Kotproben wurden 1:10 verdünnt und im Doppelansatz auf Brilli-anceTM ESBL-Agar plattiert. Nach 24 Stunden bei 37 °C wurden die Kolonien gezählt und die Gesamtanzahl der koloniebildenden Einheiten (cfu)/ml berechnet. Die Bakterien-spezies wurde biochemisch identifiziert. Die ESBL-Produktion wurde mittels MICRONAUT-S β-Lactamase-Platten phänotypisch bestätigt. Zusätzlich wurden weitere Resistenztest mit der VITEK® 2 Technologie durchgeführt. Die Bestimmung der Phy-logruppen der E. coli-Isolate und das Screening auf bla-Gene wurde mittels PCR durch-geführt. Der Hygienestatus der Betriebe wurde mit Hilfe eines standardisierten Fragebo-gens erfasst und bewertet und Daten zu Tiergesundheit und Antibiotikaeinsatz wurden über Tier-Scoring und das Herdemanagementprogramm gesammelt. Ergebnisse: ESBL-E konnten in allen Betrieben und 96,5 % der Kotproben nachgewiesen werden. Der dominierende Anteil der ESBL-produzierenden Isolate waren E. coli (92,9 %), gefolgt von Enterobacter (E.) cloacae (5,1 %) und K. pneumoniae subsp. pneumoniae (2,0 %). Die Mehrheit der E. coli-Isolate wurde eindeutig der Phylogruppe C zugeordnet (25,0 %), gefolgt von den Phylogruppen A (15,2 %) und E (14,1 %). Die CTX-M-Gruppe 1 wurde am häufigsten nachgewiesen (80,4 %). Neben der Resistenz gegenüber Penicillinen und Cephalosporinen war die Mehrheit der Isolate zusätzlich ge-genüber einer oder mehrerer weiterer Substanzklassen resistent, wobei ein hoher Anteil gegenüber Fluorchinolonen resistent war. 52,5 % der Isolate wurden außerdem als drei-fach multiresistente gramnegative Bakterien (3MRGN) gemäß der Kommission für Kran-kenhaushygiene und Infektionsprävention charakterisiert. Keines der Isolate war 4MRGN, d.h. keines zeigte eine Carbapenem-Resistenz. Penicilline wurden bei Kälbern in den meisten Betrieben am häufigsten verabreicht und stellten auf Herdenebene in al-len Betrieben die vorherrschende Substanzklasse dar. Insgesamt war die Anzahl der Kälber, die vor der Probenahme behandelt wurden, eher gering (11,7 %). Analysen der Daten zum Betriebsmanagement ergaben Schwächen bei der Biosicherheit und der Rei-nigung und Desinfektion. Neben Beta-Laktam-Antibiotika als den am häufigsten verwen-deten Antibiotika konnten keine weiteren Risikofaktoren identifiziert werden. Schlussfolgerungen: Die Prävalenz von ESBL-E in unserer Studie war außergewöhnlich hoch. Obwohl die Prävalenz mit zunehmendem Alter der Rinder nachgewiesenermaßen abnimmt, sollten unsere Ergebnisse Anlass zur Entwicklung von Strategien sein, die den Eintrag von ESBL-E in das Kälberaufzuchtsystem frühzeitig verhindern. Dies können beispielsweise der verantwortungsbewusste Einsatz antibiotischer Trockensteller und ei-ne sorgfältige Hygiene in Abkalbeboxen und Kälberställen sein. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um den/die Eintrittspunkt(e) von ESBL-E in die Kälberaufzucht zu defi-nieren.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Antimikrobielle Resistenzen 2.1.1 Entstehung antimikrobieller Resistenzen 2.1.2 Resistenzmechanismen 2.1.3 Verbreitung von Resistenzen 2.2 Beta-Laktamantibiotika 2.2.1 Penicilline 2.2.2 Cephalosporine 2.2.3 Carbapeneme und Monobactame 2.2.4 ß-Laktamasehemmer 2.2.5 Bakterielle Resistenzmechanismen gegenüber Beta-Laktamen 2.3 Beta-Laktamasen 2.3.1 Klassifikation 2.3.2 Extended-Spectrum-Beta-Laktamasen 2.4 Vorkommen und Verteilung von ESBL bei Nutztieren und ihr zoonotisches Potenzial 2.5 Nachweis und Identifikation von ESBL 2.5.1 Phänotypischer Nachweis 2.5.2 Genotypische Identifikation 3 Veröffentlichung 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Danksagung / Introduction: The occurrence of multidrug-resistant bacteria in the community and in hospi-tals as well as in animal husbandry has increased rapidly over the last decades. The in-creasing occurrence of multidrug-resistant gram-negative bacteria, especially enterobac-teria such as Klebsiella (K.) pneumoniae and Escherichia (E.) coli, is of growing concern and has been subject to many studies worldwide. Study aims: We studied the prevalence of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Enterobacteriaceae in dairy calves as part of a routine health check protocol. In addition, data regarding antimicrobial use (AMU), farm hygiene, and farm manage-ment were collected in order to identify possible risks for ESBL occurrence. Animals, material and methods: Ten farms participated in the study with a median of 781 milking cows (319-1701). All calves investigated were younger than two weeks with an average age of 6.8 (±3.9) days. The farms were visited and samples were collected twice at an interval of 7-11 months. Faecal samples diluted 1:10, were plated onto Bril-lianceTM ESBL agar in duplicates. After 24 hours at 37 °C, colonies were counted and to-tal colony forming units (cfu)/ml calculated. Bacteria species were identified biochemical-ly. ESBL-production was phenotypically confirmed using the MICRONAUT-S β-Lactamases system. Additionally, antimicrobial susceptibility was tested using VITEK® 2 technology. Phylotyping of E. coli isolates and screening for bla genes was performed by PCR. The hygienic status of the farms was recorded and rated using a standardized questionnaire developed for dairy cattle and data on animal health and antimicrobial treatment were collected through animal scoring and the herd management program. Results: ESBL-producing enterobacteria were detected on all farms and 96.5 % of calves investigated shed ESBL-positive bacteria. Of all ESBL-producing isolates, the majority were E. coli (92.9 %), followed by Enterobacter cloacae (5.1 %) and Klebsiella pneu-moniae subsp. pneumoniae (2.0 %). The majority of E. coli isolates was clearly assigned to phylogroup C (25.0 %), followed by phylogroups A (15.2 %) and E (14.1 %). CTX-M group 1 was most frequently detected (80.4 %). Besides resistance to penicillins and cephalosporins, the majority of isolates was also resistant to one or more antibiotic clas-ses, with a high proportion being resistant against fluoroqinolones. 52.5 % of isolates were further characterised as threefold multidrug resistant gram-negative bacteria (3MDR-GNB) according to the German Commission for Hospital Hygiene and Infection Prevention. None of the isolates were 4MDR-GNB, i.e. none revealed carbapenem-resistance. Penicillins were the most frequently administered antibiotics to calves on most farms and were the predominant substance class at herd level on all farms. Over-all, the number of calves treated prior to sampling was rather low (11.7 %). Analyses of data regarding the farm management identified weaknesses in biosecurity and cleaning and disinfection. Besides beta-lactam antibiotics being the most commonly used antibiot-ics no other risk factors could be identified. Conclusions: The prevalence of ESBL-carriers in dairy calves in our study was exceptional-ly high. Although ESBL-E-prevalence has been described to decrease with increasing age of cattle, our findings should be motivation to develop strategies to prevent the entry of ESBL-E into the calf rearing system at an early stage such as prudent use of antimi-crobials during drying off and diligent hygiene in calving pens and calf housing. Further investigation is needed, to define the entry point(s) of ESBL-E into calf rearing.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Antimikrobielle Resistenzen 2.1.1 Entstehung antimikrobieller Resistenzen 2.1.2 Resistenzmechanismen 2.1.3 Verbreitung von Resistenzen 2.2 Beta-Laktamantibiotika 2.2.1 Penicilline 2.2.2 Cephalosporine 2.2.3 Carbapeneme und Monobactame 2.2.4 ß-Laktamasehemmer 2.2.5 Bakterielle Resistenzmechanismen gegenüber Beta-Laktamen 2.3 Beta-Laktamasen 2.3.1 Klassifikation 2.3.2 Extended-Spectrum-Beta-Laktamasen 2.4 Vorkommen und Verteilung von ESBL bei Nutztieren und ihr zoonotisches Potenzial 2.5 Nachweis und Identifikation von ESBL 2.5.1 Phänotypischer Nachweis 2.5.2 Genotypische Identifikation 3 Veröffentlichung 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Danksagung

Die chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen Morbus Crohn und Colitis ulzerosa sind wiederkehrende, nicht heilbare, immunvermittelte Krankheiten unklarer Ursache. Genetische Prädisposition und Umweltfaktoren können die Barrierefunktion der Darmmukosa stören, so dass eine überschiessende Entzündungsreaktion folgt, die durch kommensale Bakterien der normalen Darmflora verstärkt wird. Die Infektion mit H. pylori im Magen kann zu Gastritis, Ulkuskrankheit und der Entstehung von MALT-Lymphomen und Magenkarzinomen führen. An der Erkennung von bakteriellen Bestandteilen im Gastrointestinaltrakt sind Toll-like-Rezeptoren (TLR), als Komponenten des angeborenen Immunsystems maßgeblich beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen der Bakterienflora bei Ileitis, Colitis und bei Vorliegen einer H. pylori-Infektion im Mausmodell untersucht. Durch eine globale Florenanalyse mit klassischen mikrobiologischen und molekularbiologischen Techniken konnte gezeigt werden, dass die Konzentrationen an Gram-negativen Stäbchenbakterien während der Entzündung in Ileum und Colon anstiegen. Die bakteriellen Faktoren, die eine Ileitis induzierten, wurden durch den Einsatz von gnotobiotischen TLR-defizienten Mäusen mit definierter bakterieller Rekolonisierung ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass eine Ileitis durch das LPS von akkumulierenden E. coli über die TLR4-vermittelte Signaltransduktion verstärkt wurde. Die Entzündungsreaktionen konnten durch Behandlung mit Antibiotika oder dem LPS-Antagonisten Polymyxin B gebessert werden. In Folge einer H. pylori-Infektion kam es im Mausmagen zu einer erhöhten Diversität der Bakterienflora durch die Besiedelung mit Bakterienarten, die normalerweise das Colon kolonisieren. Eine derartige Florenverschiebung konnte durch eine Vakzinierung gegen H. pylori verhindert werden. Die Tiermodelle zur T. gondii-induzierten Ileitis und DSS-Colitis erlauben eine reproduzierbare Analyse entzündungsrelevanter Komponenten und damit die Möglichkeit, therapeutische Ansatzpunkte, wie z.B. den Einsatz von Lipopolysaccharid-Inhibitoren, die Blockade von TLR4 oder dem LPS-Bindeprotein oder den Einsatz von Probiotika, unter definierten Bedingungen zu analysieren. / Inflammatory bowel diseases like Crohn´s disease and ulcerative colitis are chronic, relapsing, immunologically mediated disorders with uncertain etiology. Genetic abnormalities and environmental factors may have negative influences on the physiologic barrier function of the intestinal mucosa with inflamamtion coming up after immune response which is aggravated by commensal intestinal bacteria. The infection of H. pylori can cause gastritis and ulcus disease and contribute to the occurence of MALT lymphoma and gastric cancer. Bacterial ligands in the intestine are recognized by toll-like receptors (TLR) which are one component of the innate immune system. This study observed variations of the bacterial flora in mice with ileitis, colitis or H. pylori-infection. Performing a global survey of the intestinal flora combining culture based techniques with molecular methods, it was observed, that the concentration of gram-negative rods is elevated during ileitis or colitis. The bacterial factors, which are capable of inducing ileitis, could be confirmed using gnotobiotic TLR-deficient mice with a defined bacterial recolonization. It was clearly shown that ileitis was aggravated by LPS of accumulating E. coli through a TLR4-mediated signal transduction. The inflammation was ameliorated through antibiotic treatment or after application of the LPS-scavenger polymyxin B. H. pylori infection of mice leads to an increase of bacterial diversity in the stomach and bacterial species which are normally colonize the colon were detected after infection. Vaccination against H. pylori could prevent this diversity shift. The animal models for the T. gondii-induced ileitis and DSS-colitis used in this study offering the reproducible analysis of inflammation relevant components so that new approaches of treatment like inhibition of lipopolysaccharide, blockage of TLR4 or LPS binding protein or application of probiotics could be studied under well defined conditions.