Resumo: O presente estudo investigou a qualidade microbiológica do leite de duas pequenas propriedades orgânicas (I e II) do estado de São Paulo, bem como a presença de marcadores de virulência de Staphylococcus spp. e isolados bacterianos multirresistentes aos antimicrobianos. Foram analisados os principais constituintes do leite, contagem bacteriana total, nível de celularidade, além da presença de resíduos de antimicrobianos, com base nas Normativas 051 e 064 do MAPA. O efeito das estações do ano sobre os parâmetros pesquisados também foi considerado. Foram realizadas 12 colheitas em cada uma das duas propriedades, das quais 12 mensais dos latões e quatro trimestrais de todos os animais. No total foram colhidas amostras de leite de 178 animais (259 tetos). Destes, 125/259 (48,27%) tetos acusaram mastite subclínica no CMT, 2/259 (0,77%) tetos mastite clínica e 132/259 (50,96%) foram negativos. A mediana da CCS das duas propriedades variou entre 311,67 x 1000 céls/mL e 447,83 x 1000 céls/mL e a CBT variou entre 25,4 x 1000 UFC/mL e 141,63 x 1000 UFC/mL, sem influência das estações do ano. Os principais constituintes do leite mantiveram-se dentro dos parâmetros estabelecidos. Das 86 amostras de leite da propriedade I, seis (6,97%) foram positivas para a presença de resíduos de antimicrobianos, enquanto das 173 amostras da propriedade II, 16 (9,24%) foram positivas. Staphylococcus spp. e Corynebacterium bovis foram os micro-organismos mais freqüentes, isolados em 58/259 (22,39%) e 50/259 (19,30%), respectivamente, de amostras de leite dos animais. Das 58 linhagens de Staphylococcus spp., 48 (82,76%) foram classificadas como coagulase positivas (ECPs) e 10 (17,24%) como coagulase negativas (ECNs). Para os ECPs, S. intermedius foi mais frequente (46,56%), seguido por S. aureus (22,42%). Dentre os ECNs, S. warneri foi caracterizado em 13,80% das linhagens. A sensibilidade das ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The present study investigated the microbiological quality of milk from two small organic properties (I and II) from São Paulo State, as well as the presence of virulence markers of Staphylococcus spp. and multidrug-resistant isolates to antimicrobials. We analyzed the major milk components, total bacterial count, level of cellularity and the presence of antimicrobial residues, based on Normative 051 and 064 MAPA, Brazil. The effect of seasons on the studied parameters was also considered. Twenty harvests were conducted in each of the two properties, including 12 monthly and four quarterly samples of all animals. In total we collected milk samples from 178 animals (259 mammary glands). Of these, 125/259 (48.27%) mammary glands showed subclinical mastitis on CMT, 2/259 (0.77%) clinical mastitis and 132/259 (50.96%) had been negative. The median of SCC of the two properties varied between 311.67 x 1000 cells/mL and 447.83 x 1000 cells/mL and TBC showed between 25.4 x 1000 CFU/mL and 141.63 x 1000 CFU/mL, without influence of the seasons. The contents of the main milk components remained with the established standards. Of the 86 samples of milk from the property I, six (6.97%) were positive for the presence of antimicrobial residues, while from 173 samples of property II, 16 (9.24%) were positive. Staphylococcus spp. and Corynebacterium bovis were the most frequent microorganisms isolated in 58/259 (22.39%) and 50/259 (19.30%), respectively, in the milk samples of animals. Of the 58 strains of Staphylococcus spp., 48 (82.76%) were classified as coagulase positive (CPS) and 10 (17.24%) as coagulase negative (CNS). For the CPS, S. intermedius was more frequent (46.56%), followed by S. aureus (22.42%). Among the CNS, S. warneri was characterized in 13.80% of the strains. The sensitivity of Staphylococcus spp. strains was > 88% for ceftiofur, oxacillin and trimethoprim/sulfamethoxazole ... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Márcio Garcia Ribeiro / Coorientador: Domingos da Silva Leite / Banca: José Paes de Almeida Nogueira Pinto / Banca: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Banca: Evelise Oliveira Telles / Banca: Elizabeth Oliveira da Costa Freitas Guimarães / Doutor

Resumo: O leite é de extrema importância na alimentação humana. A exigência quanto à sua qualidade tem aumentado, inclusive com relação à transmissão de patógenos. Staphylococcus aureus é um dos principais agentes da mastite bovina e tem grande importância em saúde pública por produzir enterotoxinas. Os objetivos do trabalho foram avaliar o perfil dos produtores da região considerando-se a atual legislação e a qualidade do leite produzido com ênfase na presença de Staphylococcus enterotoxigênicos, utilizando a PCR na detecção de S. aureus e dos genes codificadores das enterotoxinas sea, seb, sec e sed diretamente do leite de tanque em comparação ao exame microbiológico tradicional, e realizando a detecção das respectivas enterotoxinas pelo método de aglutinação passiva reversa em látex (RPLA) diretamente do leite, comparando com os resultados genotípicos. Utilizaram-se 104 amostras de leite de tanque, estudadas a fresco e após incubação por 5 horas, uma alíquota a 7°C e outra a 25°C concomitantemente. A PCR foi altamente sensível, detectando S. aureus em 99% das amostras, mas com moderada concordância com o microbiológico nas amostras positivas. As amostras de Staphylococcus enterotoxigênicos apresentaram predomínio do gene sec (58,65%), seguido pelo gene sea (43,27%), seb (23,27%) e sed (1,28). Quanto às enterotoxinas, houve a sua detecção em 9% das amostras em quantidades que variaram de 1 a 5 ng/μL. Verifica-se a importância do estudo do potencial do leite como fonte de S. aureus enterotoxigênico e de suas enterotoxinas, fornecendo risco para a saúde pública caso o leite não seja refrigerado adequadamente / Abstract: Milk has extreme importance to human feed. The demand for quality milk has increased, including pathogens transmission. Staphylococcus aureus is one of the main agents of mastitis and has importance in public health for producing enterotoxins. The study aims were to evaluate the region producer's profile, considering the present legislation and the quality of milk produced with emphasis in enterotoxigenic Staphylococcus presence, using PCR in detection of S. aureus and enterotoxins encoding genes sea, seb, sec and sed directly from bulk tank milk in comparison with traditional microbiological test, and carring out the detection of respective enterotoxins by reverse passive latex agglutination method (RPLA) directly from milk comparing with genotypic results. A total of 104 samples of bulk tank milk were used, studied fresh and after 5-hour storage, one bracket at 7°C the another at 25°C concurrently. PCR was highly sensitive, detecting S. aureus in 99% of samples, but with moderate concordance with microbiological test in positive samples. The samples of enterotoxigenic Staphylococcus presented predomination of sec (58.65%), followed by sea (43.27%), seb (23.27%) and sed (1.28%) genes. As the enterotoxins, its detection occurred in 9% of samples in quantities that ranged from 1 to 5 ng/μL. The importance of the study of milk potential as enterotoxigenic S. aureus and enterotoxins source is verified, providing risk to public health if milk is not refrigerated properly / Orientador: Hélio Langoni / Coorientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Banca: Márcio Garcia Ribeiro / Banca: José Paes de Almeida Nogueira Pinto / Banca: Luiz Simões do Carmo / Banca: Elizabeth Oliveira da Costa Freitas Guimarães / Doutor

Orientador: Antonio Nader Filho / Coorientador: Luis Manuel Medina Canalejo / Banca: Luiz Francisco Zafalon / Banca: Luciano Menezes Ferreira / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Lisiane de Almeida Martins / Resumo: Foi realizado o estudo epidemiológico molecular de estirpes de Staphylococcus aureus potencialmente toxigênicas isoladas no processo de produção do Queijo Tipo Minas Frescal em uma micro-usina no Estado de São Paulo. Para tanto, foram realizadas seis amostragens durante o período de junho de 2008 a julho de 2009, de modo a perfazer um total de 140 amostras, as quais foram colhidas do leite cru e pasteurizado, mãos do manipulador, queijo embalado para consumo e diversos pontos do fluxograma de seu processamento. A confirmação molecular da espécie dos isolados e a presença de genes codificadores das enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e da toxina TSST-1, foram realizadas a partir da amplificação dos fragmentos de DNA genômico específico. Entre as 41 (29,3,4%) das estirpes confirmadas como sendo S. aureus, 25 (61%) mostraram-se positivas na pesquisa de genes codificadores de toxinas estafilocócicas. Os pontos de maior frequência de estirpes de S. aureus toxigênico foram as mãos do manipulador (16,0%), o leite cru do tanque de recepção (12,0%), o leite pasteurizado (12,0%) e o Queijo Tipo Minas Frescal pronto para consumo (12,0%). O gene codificador de enterotoxina de maior frequência identificada foi o sea. Na determinação do potencial toxigênico das estirpes com genes codificadores de enterotoxinas por imunodifusão, apenas uma estirpe isolada da superfície interna do tanque de estocagem do leite cru foi produtora da enterotoxina SEC. Houve variabilidade genética entre as 41 estirpes de S. aureus isoladas, uma vez que foram identificados 22 pulsotipos diferentes pelo PFGE. Os resultados obtidos permitem a adoção de medidas para a melhoria do processamento do Queijo Tipo Minas Frescal de modo a reduzir o risco potencial que estas toxinas podem representar para a saúde da população consumidora deste produto / Abstract: We performed molecular epidemiological study of strains of Staphylococcus aureus isolated toxigenic potential in the process of producing the Frescal Minas Type Cheese in a micro-mill in State of São Paulo. For this, six samples were taken during the period June 2008 to July 2009 in order to make a total of 140 samples, which were collected raw and pasteurized milk, the handler's hands, cheese packaged for consumption and different points flowchart of processing. Confirmation of the molecular species of the isolates and the presence of genes encoding enterotoxins SEA, SEB, SEC, SED and TSST-1 toxin, were made from the amplification of specific fragments of genomic DNA. Among the 41 (29.3%) of strains confirmed as S. aureus, 25 (61%) were positive in the research of genes encoding staphylococcal toxins. Points higher frequency of toxigenic strains of S. aureus were the hands of the handler (16.0%), raw milk receiving tank (12.0%), pasteurized milk (12.0%) and Frescal Minas Type Cheese ready for consumption (12.0%). The gene encoding enterotoxin most frequently identified was the sea. In determining the potential toxigenic strains with genes encoding enterotoxins by immunodiffusion, only one strain isolated from the inside surface of the storage tank of raw milk was the producer of enterotoxin SEC. There was genetic variability among the 41 strains of S. aureus isolated, since they were identified by 22 different PFGE pulsotypes. The results obtained allow the adoption of measures to improve the processing of Frescal Minas Type Cheese to reduce the potential risk that these toxins can pose to the health of consumers of this product / Doutor

Resumo: Entre agosto de 2005 e dezembro de 2006, foram obtidas 245 estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de amostras de leite de vacas com mastite, de óstios papilares da glândula mamária e de insufladores da ordenhadeira, procedentes de um rebanho bovino produtor de leite tipo B. Com a finalidade de monitorar as estirpes de S. aureus envolvidas em casos de mastite bovina por meio da verificação da relação epidemiológica existente entre as estirpes isoladas, especialmente com vistas aos sítios de localização e vias de transmissão, as estirpes foram submetidas à Eletroforese de Campo Pulsado (PFGE), à amplificação das seqüências codificadoras (sea, seb, sec, sed e tst), por intermédio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), e suas sensibilidades in vitro a 12 antimicrobianos foram determinadas. Os resultados obtidos revelaram 51 diferentes perfis, sendo que a resistência à penicilina foi a predominante entre as 179 (73,1%) estirpes de S. aureus, quando considerada de forma particular (54,8%) ou em conjunto (29,4%). As 66 (26,9%) estirpes restantes foram sensíveis aos 12 antimicrobianos testados e a vancomicina foi o único princípio ativo que se mostrou eficiente a 100% das estirpes testadas. A PFGE revelou 39 pulsotipos distintos, dos quais 25 (64,1%) encontraram-se distribuídos nas 137 (55,9%) estirpes obtidas do leite. Dentre estas, 92 (67,1%) estirpes apresentaram resistência a um ou mais antimicrobianos e foram agrupadas em 22 (88,0%) pulsotipos distintos. Foi observado, também, por meio da PFGE, que nenhum pulsotipo foi isolado por mais de três colheitas consecutivas e que somente o pulsotipo 29 foi identificado em 5 (31,2%) colheitas...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two hundred and forty five Staphylococcus aureus strains were isolated between August of 2005 and December of 2006 from samples collected from a type-B milk-producing herd. Samples encompassed milk collected directly from mastitic cows, papillas osteuns of mammary glands, and milking machine cups. Samples were subjected to Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) to monitor for the strains of S. aureus and to determine epidemiologic relationships between the isolated strains, taking into account the different precedence of strains. PFGE was used to monitor the presence of specific coding sequences (i.e., sea, seb, sec, sed, and tst) in the milk samples using polymerase chain reaction (PCR) amplification. Moreover, sensitivity of strains to 12 different antibiotics was determined in vitro. Results revealed the presence of 51 different PFGE profiles of S. aureus in the samples, and highlighted 179 (73.1%) penicillin resistant strains. Nonetheless, the 66 (26.9%) other strains were sensitive to all 12 antibiotics tested, and vancomycin was the only antibiotic effective against all tested strains. PFGE also revealed 39 distinct peaks with 25 of them (64.1%) being present in 137 (55.9%) strains obtained from milk. Of these strains, 92 (67.1%) were resistant to one or more antibiotics, and were further grouped in 22 (88.0%) distinct peaks. Additionally, PFGE revealed the presence of no distinct peaks in samples from three consecutive collection times, and that peak 29 was the only one identified in 5 collection times (31.2%). Importantly, PGFE also indicated that in the periods A and H, which corresponded to 12.5% of the total time points, the isolated strains from one collection day (samples from all 3 sources) all had the peaks 2 and 12, respectively...(Complete abstract, click electronic access below) / Orientador: Antonio Nader Filho / Coorientador: Luiz Francisco Zafalon / Banca: Carlos Augusto Fernande de Oliveira / Banca: Naiá Carla Marchi de Rezende Lago / Banca: Paulo Francisco Domingues / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Doutor

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Janete Apparecida Desiderio Sena / Banca: Gislayne Fernandes Lemes Trindade Vilas-Bôas / Banca: Sérgio Antonio de Bortoli / Banca: Fernando Hercos Valicente / Resumo: O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada (LGBBA) da FCAV-UNESP. Foram caracterizados geneticamente, por PCR, isolados de Bacillus thuringiensis, provenientes de três coleções brasileiras, quanto aos tipos de genes cry1, avaliando-se o efeito dos mesmos sobre uma população de Plutella xylostella caracterizando-se também os isolados de B. thuringiensis quanto à presença de enterotoxinas HBL, NHE e o regulador pleitrópico PLC, por verificação biomolecular, avaliando a variabilidade, bem como a estruturação genética de populações de B. thuringiensis, por PCR-RFLP. Verificou-se que existe uma distribuição homogênea das subclasses cry1 dentro do banco de isolados de B. thuringiensis, com maior porcentagem de isolados portadores dos genes cry1Ab (42,12%) e com menor porcentagem de representantes da subclasse cry1Db (0,6%). Nos bioensaios observou-se 100% de mortalidade para lagartas de P. xylostella com os isolados utilizados, indicando que combinações de tipos diferentes de genes cry1 apresentam ação tóxica para larvas de P. xylostella. Analisando a estrutura populacional de B. thuringiensis foram obtidos 78 haplótipos, definidos para as populações das diferentes coleções, e 76 haplótipos, definidos para as populações de diferentes regiões brasileiras, retratando a variabilidade genética para os loci hblA, plcR, nheBC e cry1 analisados. Segundo valores FSTs, de comparação duas a duas, diferenças significativas entre coleções e populações de B. thuringiensis provenientes das regiões brasileiras foram verificadas. Mesmo assim, alguns grupos formados são constituídos por uma população clonal de isolados da bactéria. / Abstract: The work was developed in the Laboratory of Bacterias' Genetics and Applied Biotechnology (LGBBA) at UNESP/ Jaboticabal Campus. There were genetically characterized, by PCR, isolates of B. thuringiensis, belonging to three Brazilian collections basead on cry1 gene content, evaluating their effects on Plutella xylostella. They were also characterized concerning their enterotoxins production such as HBL, NHE and the PLC virulence factor, using molecular techniques, so as to evaluate their gene diversities, as well as their population genetic, using the PCR-RFLP approach. It was observed a homogeneous distribution of the cry1 subclasses within B. thuringiensis strain collections studied, with bigger percentage of isolates showing the cry1Ab genes (42.12%) and with lower percentage of isolates for subclass cry1Db (0.6%). The bioassays have revealed 100% mortality to P. xylostella larvae meaning that the effectiveness of B. thuringiensis as a biological control agent does not depend at the cry genes content. When the B. thuringiensis population structure was considered, 78 haplotypes were defined for the strains contents of different collections and 76 haplotypes were defined for strains of different Brazilian regions, exhibiting the great genetic variability for hblA, plcR, nheBC and cry1 loci. According to the FSTs values for establish pair comparisons, significant differences among the B. thuringiensis collections and populations, were observed. Nevertheless some of the formed groups were considered as bacterial clonal population. / Doutor