Orientador: Francisco Maugeri Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:42:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Contiero_Jonas_D.pdf: 6240338 bytes, checksum: dbd339aaa2fb31f23f673d121a70050b (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: O principal objetivo deste trabalho, foi estudar a produção da enzima invertase por Kluyveromyces bulgaricus utilizando diferentes processos de fermentação com células livres e imobilizadas. Estudou-se igualmente a influência dos substratos sacarose, glicose e frutose na cinética de crescimento do microrganismo e de produção da enzima, além de procurar caracteriza-la cineticamente. As fermentações foram realizadas á temperatura de 30°G e aeração entre 0,2 a 0,3 vvm, sendo que dos processos estudados, os melhores resultados foram obtidos- para reator contínuo com células imobilizadas, com volume liquido de 530 ml, utilizando melaço como fonte de carbono e agua de maceração de milho como fonte de nitrogênio. Os valores de atividade enzimática, produtividade e rendimento para os diferentes processos foram: para o processo batelada simples respectivamente 9,17 U.I/ml, 0,19 U.I/ml.h e 424,34 U.I/g ART; para processo batelada alimentada 11,0 U l/mi, 1,3 U.I/ml.h e 883,66 Ul/g ART; para processo em reator contínuo duplo estágio 32,0 U.I/ml, S,30 U.I/ml.h e 1749,60 U.I/g ART e para reator contínuo com células imobilizadas 97,3 U.I/ml , 5,74 U.I/ml.h e 5322,97 U.I/g AKT. Para o estudo da influência do substrato na produção da enzima, verificou-se tratar-se de enzima constitutiva e que a produção é inibida pela presença em excesso de sacarose, glicose e frutose. Através da técnica de perturbação por degrau, em fermentação contínua determinou-se µmax constante de saturação Ks para o microrganismo. As constantes cinéticas de crescimento µmax (velocidade específica de crescimento máxima) e Ks ( constante de saturação ) foram deter terminadas em fermentação contínua. Verificou-se que para qualquer dos substratos utilizados (sacarose, glicose e frutose) µmax foi aproximadamente constante e igual a 0,24 h-1, enquanto que Ks foi 1,4*10-4, 1,15*10-3 e si 1,77*10-3 mol/l, respectivamente para sacarose, glicose e frutose. Os valores das constantes cinéticas µmax e Ks para a produção da enzima nos diferentes substratos foram: 3099,51 U.I/gcel . h e 0,0181 mol/l; 5264,8 U.I/g h e 0,0023 mol/l e 14S0.99 U.I/g . h e 0.0097 mol/l para a sacarose, glicose e frutose respectivamente. Quanto a caracterização da enzima foram encontrados os valores da energia de desativação para a enzima precipitada com álcool e após passsagem por coluna de DEAE- celulose, 61043 cal/g.mol e 93861,9 cal/g.mol respectivamente. Para a enzima bruta (após precipitação com álcool) foram encontrados os valores de Km igual 0,0662 mol/l e Vmax igual a 2037 U.I/ml / Abstract: The main objective of this work was to study the production of enzyme invertase by Kluyveromyces bulgaricus using immobilized cell and free cell fermentations. Parallel with this, it was studied the influence of the substrates sucrose, glucose and fructose on the kinetics of cell growth and enzyme production. The fermentations were carried out at a temperature of 30°C and with aeration at a level between 0.2 and 0.3 vvm. The best results were obtained utilizing the continuous reactor operating with immobilized cells and a liquid volume of 530 ml. Molasse from sugar cane juice was the carbon source and the nitrogen source was the corn steep liquor. The values found f or enzyme production, and productivity and yield for the various process studied were as follows: for the simple batch process respectively 9.17 U.I./ml, 0.19 U.I./ml.h and 424.34 U.I./g ART; for fed batch 11.0 U.I./ml, 1.3 U.I/ml.h and 883.66 U.I/g ART; for 2 stage continuous culture 32.0 U.I.Xml, 5.30 l).I./ml.h and 1749.60 U.I/g ART; and for continuous culture with immobilized cells 97.3 U.l./ml, 5.74 U.I./ml.h and 5322.97 U.I./g ART. The study of influence on enzyme production confirmed that the enzyme is produced constitutively and is inhibited by excess sucrose, glucose or fructose. Using the technique of graded perturbation in continuous culture, values for umax (specific growth rate) and Ks (Saturation constant) of the microorganism were determined, umax found to be approximately constant at 0,24 h-1 while Ks was found to be 1.4x10-4, 1.15x10-9 and 1.77x10-9 mol/l for sucrose, glucose and fructose respectively. The kinetcs constant umax and Ks for enzyme production were: 3099.51 U.I/gcells.h and 0.0181 mol/l; 5264.8 U.I/gcells.h and 0.0023 mol/l, and 1450.99 U.I./gcells .h and 0.0097 mol/I for sucrose, glucose and fructose respectively. With respect the characterization of the enzyme itself, the deactivation of the energy of the purified enzyme after precipitation with ethanol was 61043 cal/gmol wile after further purification using a DEAE-celulose column was 93861.9 cal/mol For the raw enzyme (after simpy precipitating with ethanol) a Km value of 0.0662 mol/l and Vmax value of 2037U.I./ml / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

Orientador: Renato Wendhausen Júnior. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Exatas e Naturais, Programa de Pós-Graduação em Química.

As enzimas da via do ácido chiquímico constituem um excelente alvo para o desenho de novos agentes antibacterianos. Esta rota é encontrada em bactérias, fungos, plantas e parasitas do filo apicomplexa, mas está ausente em mamíferos. A Corismato sintase (CS) catalisa o último passo desta rota, produto que é utilizado em outras reações biossintéticas, como biossíntese de aminoácidos aromáticos, folato, vitamina K e ubiquinona. Esta reação é a mais incomum de toda rota e é unica na natureza. Ela converte 5-enolpiruvil-chiqiuimato-3-fosfato (EPSP) em corismato na presença de uma flavina mononucleotídeo reduzida (FMNH2) como coenzima. A predição da estrutura tridimensional (3D) da enzima CS de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) foi feita pela técnica de modelagem comparativa por homologia, utilizando a estrutura cristalográfica de CS de Streptococcus pneumoniae (PDB ID: 1QX0) como molde (≈ 42% de identidade), e o programa MODELLER6v2. Adicionalmente, com o intuito de entender as possíveis formas de ligação do substrato e da coenzima a enzima EPSP e flavina mononucleotídeo (FMN), repectivamente, foi feito um docking geométrico. A minimização de energia de todo o complexo mostrou, como esperado, que a maioria das interações ocorridas no molde são preservadas na estrutura de Mtb, exceto pela His11, Arg139 e Gln255. Entretanto, novas interações envolvendo Arg111, Gli113 e Ser317 também foram observadas. Este conhecimento poderá facilitar na busca por novos inibidores para esta enzima como fármacos alternativos no tratamento da tuberculose (Tb). / The enzymes of the shikimate pathway constitute an excellent target for the design of new antibacterial agents. This pathway is found in bacteria, fungi, plants and apicomplexan parasites but is absent in mammals. Chorismate synthase (CS) catalyzes the last step of this pathway, the product of which is utilized in other enzymatic transformations like the biosynthesis of aromatic amino acids, folate, vitamin K and ubiquinone. This reaction is the most unusual of the entire pathway and is unique in nature. It converts EPSP to chorismate in the presence of a reduced FMN coenzime. Structure prediction used the comparative protein structure modeling methodology. The three-dimensional (3D) structure prediction of the enzyme CS of Mycobacterium tuberculosis was performed using the crystal structure (PDB ID: 1QX0) of CS from Streptococcus pneumoniae as template (≈ 42% identity), and the MODELLER6v2 package. Additionally, in order to understand the possible binding modes of substrate and coenzime to the enzyme, EPSP and FMN, respectively, were geometrically docked to CS. Energy minimization of the whole complex showed, as expected, that most of the template interactions are preserved in the Mtb structure, except for His11, Arg139 and Gln255. However, novel interactions involving Arg111, Gly113 and Ser317 were also observed. This knowledge should facilitate the search for inhibitors of this enzyme as alternative agents to treat tuberculosis.

As enzimas da via do ácido chiquímico constituem um excelente alvo para o desenho de novos agentes antibacterianos. Esta rota é encontrada em bactérias, fungos, plantas e parasitas do filo apicomplexa, mas está ausente em mamíferos. A Corismato sintase (CS) catalisa o último passo desta rota, produto que é utilizado em outras reações biossintéticas, como biossíntese de aminoácidos aromáticos, folato, vitamina K e ubiquinona. Esta reação é a mais incomum de toda rota e é unica na natureza. Ela converte 5-enolpiruvil-chiqiuimato-3-fosfato (EPSP) em corismato na presença de uma flavina mononucleotídeo reduzida (FMNH2) como coenzima. A predição da estrutura tridimensional (3D) da enzima CS de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) foi feita pela técnica de modelagem comparativa por homologia, utilizando a estrutura cristalográfica de CS de Streptococcus pneumoniae (PDB ID: 1QX0) como molde (≈ 42% de identidade), e o programa MODELLER6v2. Adicionalmente, com o intuito de entender as possíveis formas de ligação do substrato e da coenzima a enzima EPSP e flavina mononucleotídeo (FMN), repectivamente, foi feito um docking geométrico. A minimização de energia de todo o complexo mostrou, como esperado, que a maioria das interações ocorridas no molde são preservadas na estrutura de Mtb, exceto pela His11, Arg139 e Gln255. Entretanto, novas interações envolvendo Arg111, Gli113 e Ser317 também foram observadas. Este conhecimento poderá facilitar na busca por novos inibidores para esta enzima como fármacos alternativos no tratamento da tuberculose (Tb). / The enzymes of the shikimate pathway constitute an excellent target for the design of new antibacterial agents. This pathway is found in bacteria, fungi, plants and apicomplexan parasites but is absent in mammals. Chorismate synthase (CS) catalyzes the last step of this pathway, the product of which is utilized in other enzymatic transformations like the biosynthesis of aromatic amino acids, folate, vitamin K and ubiquinone. This reaction is the most unusual of the entire pathway and is unique in nature. It converts EPSP to chorismate in the presence of a reduced FMN coenzime. Structure prediction used the comparative protein structure modeling methodology. The three-dimensional (3D) structure prediction of the enzyme CS of Mycobacterium tuberculosis was performed using the crystal structure (PDB ID: 1QX0) of CS from Streptococcus pneumoniae as template (≈ 42% identity), and the MODELLER6v2 package. Additionally, in order to understand the possible binding modes of substrate and coenzime to the enzyme, EPSP and FMN, respectively, were geometrically docked to CS. Energy minimization of the whole complex showed, as expected, that most of the template interactions are preserved in the Mtb structure, except for His11, Arg139 and Gln255. However, novel interactions involving Arg111, Gly113 and Ser317 were also observed. This knowledge should facilitate the search for inhibitors of this enzyme as alternative agents to treat tuberculosis.

Orientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: João Atílio Jorge / Banca: Rubens Monti / Resumo: O fungo Aspergillus giganteus produz uma única poligalacturonase (PG) quando cultivado em meio líquido com pectina de citrus como única fonte de carbono, e pelo menos três pectina liases (PL) quando cultivado em meio líquido com resíduo de laranja como fonte de carbono. A PG de A. giganteus foi purificada em duas etapas: precipitação de proteínas com 70% de saturação com sulfato de amônio e troca aniônica. A PG purificada apresentou massa molar de 69,7±0,07 kDa. A máxima atividade da enzima foi observada em pH 6,0 a 55-60ºC, sendo essa estável em meio neutro e alcalino. A PG apresentou meias-vidas de 115, 18 e 6 min quando incubada a 40, 50 e 55 ºC, respectivamente. A enzima mostrou-se ativa sobre substratos de qualquer grau de metilação, com maior especificidade para substratos de baixa ou nenhuma metilação, apresentando Vmax 669,6 e 602,8 μmol/mg.min, Km 3,25 e 1,16 mg/mL, kcat 770 e 690 s-1 sobre pectina de citrus 34 % esterificada e ácido poligalacturônico, respectivamente. A PG apresentou atividade exo liberando apenas ácido galacturônico como produto de hidrólise. 2-Mercaptoetanol, DTT, Co2+, Mn2+, Mg2+, NH4 + e Na+ agiram como estimulantes da atividade PG. Já Hg2+, EDTA, citrato de sódio, ácido iodoacético, SDS, Ba2+, Cu2+, Pb2+ e Zn2+ inibiram essa atividade enzimática. A principal pectina liase de A. giganteus, a PL I, foi purificada em três etapas: troca aniônica, troca catiônica e filtração em gel. A massa molar da PL I foi estimada em 55,7±1,4 kDa. A máxima atividade da enzima foi obtida em pH 8,5 a 50ºC. A PL I apresentou meias-vidas de 19, 9 e 6 min a 40, 45 e 50ºC, respectivamente. As maiores atividades da PL I foram observadas em pectinas de citrus com 34 e 72% de metilação, nas quais apresentou Vmax 1.488,1 e 1.129,8 U/mg.min, respectivamente, e Km 4,8 mg/mL para ambos os substratos. O padrão de degradação da pectina...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Aspergillus giganteus produces one polygalacturonase (PG) on liquid medium with citrus pectin as the only carbon source, and at least three pectin lyases (PL) with orange waste. Homogenous PG was obtained after two steps: protein precipitation with 70 % ammonium sulphate saturation and anionexchange chromatography. The purified PG showed molecular weight of 69.7±0,07 kDa. The enzyme exhibited maximal activity at pH 6.0 and 55-60 °C, and was stable in neutral and alkaline medium. The half-live for PG at 40, 50 and 55 °C was 115, 18 and 6 min, respectively. The enzyme was active on substrates with any methyl-esterification degree, and hydrolysed better low esterified and not esterified substrates, showing Vmax 669.6 and 602.8 μmol. mg-1.min-1, Km 3.25 and 1.16 mg/mL, kcat 770 and 690 s-1 on 34 % esterified citrus pectin and polygalacturonic acid, respectively. The unique soluble product released in the reaction with pectin and polygalacturonic acid was monogalacturonic acid, and according to this results the enzyme can be classified as exoPG. PG activity enhanced in presence of 2-mercaptoethanol, DTT, Co2+, Mn2+, Mg2+, NH4 + and Na+, and was completely inhibited in presence of Hg2+. EDTA, sodium citrate, iodoacetic acid, SDS, Ba2+, Cu2+, Pb2+ and Zn2+ inhibited enzyme activity. The main PL from A. giganteus was called PL I and was purified after three steps: anion-exchange and cation-exchange chromatographies, and gel filtration. The purified PL I showed molecular weight of 55.7±1.4 kDa. The enzyme exhibited maximal activity at pH 8.5 and 50 °C, and was stable in neutral and acid medium. The half-live for PL I at 40, 45 and 50 °C was 19, 9 and 6 min, respectively. The enzyme was more active on citrus pectins with 34 and 72% of esterification, showing Vmax 1,488.1 and 1,129.8 U. mg-1.min-1, repectively, and Km 4.8 mg/mL on both substrates. The degradation pathern on 34% esterified...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-08-12T13:44:06Z No. of bitstreams: 1 2014_GiseleSoaresAnastacio.pdf: 1840535 bytes, checksum: 2912497e9fbaf7e46fa3f7c467f17b62 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-08-14T12:41:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_GiseleSoaresAnastacio.pdf: 1840535 bytes, checksum: 2912497e9fbaf7e46fa3f7c467f17b62 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-14T12:41:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_GiseleSoaresAnastacio.pdf: 1840535 bytes, checksum: 2912497e9fbaf7e46fa3f7c467f17b62 (MD5) / Quimosina, é uma aspartil protease utilizada como coagulante do leite na indústria de fabricação de queijo. Tradicionalmente, a quimosina é extraída a partir do abomaso de bezerro lactantes. Com o aumento da demanda desta enzima, as fábricas de queijos foram buscar outras fontes alternativas de baixo custo, entre elas a quimosina recombinante que surgiu como uma opção promissora. Neste trabalho, os cDNA de quimosina bovina e de camelo foram clonados em vetores de Pichia pastoris para a expressão constitutiva de elevado nível, sob o controle do promotor endógeno PPGK1. Os vetores foram integrados no genoma da levedura para expressão estável. Após crescimento, os sobrenadantes foram recolhidos e ambas as proteínas recombinantes foram purificadas num único passo de cromatografia com uma coluna de exclusão molecular (Sephacryl S-100) antes de caracterização enzimática. As quimosinas recombinantes apresentaram uma massa molecular entre 35 e 45 kDa. Quimosina bovina purificada exibiu uma atividade enzimática de cinco vezes superior a quimosina de camelo nas mesmas condições padrão. Ambas quimosinas apresentaram um pH ótimo de aproximadamente 4,0 e a temperatura ótima entre 55 e 60 °C. O efeito dos íons sobre a atividade das proteínas também foi estudado: maior atividade com Ca+2 foi observado entre 40-140 mM e o íon Mg+2 favoreceu um aumento da atividade enzimática de ~100% (bovina) e 66% (camelo), quando comparado com o íon Ca+2. Testes de especificidade de substrato revelaram que ambas as enzimas mostraram uma maior afinidade para k-caseína do que para α e β-caseína. Juntos, os resultados apresentados neste trabalho mostram que a quimosina bovina produzida por P. pastoris é uma fonte recombinante mais atraente do que a quimosina camelo para a fabricação de queijo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chymosin is an aspartic protease used as a milk coagulant in the cheese making industry. Tradicionally, chymosin is extracted from the abomasum of suckling calves. With the increasing demand for this enzyme, cheese manufactures seek other low cost alternative sources, among them recombinant chymosin has emerged as a promising option. In this work, bovine and camel chymosin cDNAs were cloned into a Pichia pastoris vectors for high level constitutive expression under the control of endogenous PPGK1 promoter. The vectors were integrated into the P. pastoris genome for stable expression. After growth, supernatants were collected and both recombinant proteins were purified in a single chromatographic step with an exclusion molecular column (Sephacryl S-100) prior to enzyme characterization. Recombinant chymosins showed a molecular mass between 35 kDa and 45 kDa. Purified bovine chymosin showed an enzymatic activity five times higher than camel chymosin under the same standard conditions. Both chymosins showed optimum pH around 4.0 and optimum temperature between 55 and 60°C. The effect of ions on protein activity was also studied: highest activity with Ca2+ was observed between 40-140 mM and Mg2+ favored an increase of enzyme activity of ~ 100% (bovine) and 66% (camel) when compared to Ca2+. Substrate specificity tests revealed that both enzymes showed a higher affinity for k-casein over the α and β-casein counterparts. Together, the results presented in this work show that bovine chymosin produced in P. pastoris is a more attractive recombinant source than camel chymosin for cheese manufacturing.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-10-05T19:44:57Z No. of bitstreams: 1 Dissert_GilAmaroSilva.pdf: 1315690 bytes, checksum: 66d23a16f1094e97923ce1de904317a8 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-10-19T15:21:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_GilAmaroSilva.pdf: 1315690 bytes, checksum: 66d23a16f1094e97923ce1de904317a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-19T15:21:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_GilAmaroSilva.pdf: 1315690 bytes, checksum: 66d23a16f1094e97923ce1de904317a8 (MD5) Previous issue date: 2007-07 / Uma das principais características da soja como alimento, é o seu alto teor de proteínas. Todavia a soja e, consequentemente, seus derivados, apresentam carboidratos (oligossacarídeos de rafinose: RO) que limitam seu consumo, causando restrições quanto ao seu uso na alimentação em função dos sintomas desagradáveis. Tais açúcares são, portanto, considerados fatores anti-nutricionais. A redução dos teores desses açúcares não digeríveis é de grande importância para a ampliação da utilização da soja. A redução dos teores dos RO poderá ser conseguida por meio da adição das enzimas α-galactosidases [α-D-galactosil galactohidrolases (E.C. 3.21.22)] ao processamento dos derivados de soja. Essas enzimas, hidrolisam a ligação α-1,6 que une o resíduo de galactose ao de glicose, produzindo galactose e sacarose livres, açúcares facilmente hidrolisados in vivo e absorvidos. Alfa-galactosidases são produzidas por diferentes organismos, entre estes estão leguminosas que produzem alfa-galactosidades durante a germinação das sementes para mobilizar o material de reserva contido no cotilédone. A alfa-galactosidase da semente de Guapuruvu, uma planta nativa da mata atlântica, foi parcialmente purificada com índice de purificação de 148 vezes e rendimento de 1,4%. A atividade máxima da alfagalactosidase foi detectada em pH 5,5 e 45°C. A enzima manteve 50% da atividade original após incubação por 150 minutos a 40°C. O KM para pNPGal foi de 1,68 mM e o VMAX foi de 0,18 μmol.min-1.mL-1. A atividade enzimática desta enzima foi inibida por FeCl3 ZnSO4, CuSO4, CaCl2, SDS, MnCl2, AlCl3, HgCl2, CuCl2, CoCl2 e AgNO3. A enzima não apresenta atividade de transglicosilação. Espectrometria de massa foi utilizada para determinar a massa molecular da enzima. Populações de proteína com valores de massa molecular de 20.179 kDa e 11.543 kDa foram encontrados, além de um possível peptídeo com massa molecular de 6.724 kDa. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / One of the main characteristics of the soy as food, is its high protein content. However the soy and, consequently, its derivatives, present carbohydrates (raffinose oligosaccharides: RO) that limit its consumption, causing restrictions to its use in the feeding in function of undesirable symptom, like the flatulence following ingestion of these soybean sugars. Due to the absence of α1-,6 galactosidase in the intestinal mucose which is required to hydrolyze the undesirable sugar. Such sugars also known as raffinoseoligosaccharides (ROs) are therefore, considered as anti-nutrient factors. The reduction of amount of these indigestible sugars is of great importance to increase the use of soybean. The reduction of RO in soybean and in its derivatives may be obtained by means of the addition of α-galactosidases enzymes [α-D-galactosil galactohidrolases (E.C. 3.21.22)] to the soybean derivatives preparation. These enzymes, hydrolise the α- 1,6 linkages that join the residue of galactose to the glucose present in the ROs, producing free galactose and sacarose, sugars that are easily hydrolyzed in vivo and absorbed. Alpha-galactosidase is produced by different organisms, among them, appears those plants that produces alpha-galactosidades during the germination of the seeds which is required to mobilize the material of reserve contained in the cotyledon. The alpha-galactosidase in the seed of a native plant of the Atlantic Forest, Guapuruvu, was partially purified with a purification factor of 148 times and yelding of 1,4%. Maximal activity of the alpha-galactosidase were detected at pH 5,5 and 45°C. The partially purified enzyme retained about 50% of the original activity after incubation for 150 minutes ate 40°C. KM values of 1,68 mM and VMAX values of 0,18 μmol.min-1.mL-1 were determined for conversion of pNPGal by algorithm for determination for non linear parameters. The alpha-galactosidase activity was substancially inhibited by FeCl3 ZnSO4, CuSO4, CaCl2, SDS, MnCl2, AlCl3, HgCl2, CuCl2, CoCl2 and AgNO3. The enzyme did not show, transglicosilation activity. Mass spectrometry was performed to determine the molecular mass. The partially purified alpha-galactosidase preparation contain at least 3 proteins with molecular mass of 20,179 kDa e 11,543 kDa and 6,724 kDa.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2014. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-05-21T13:16:22Z No. of bitstreams: 1 2014_JulianadaConceicaoInfantedeMarco.pdf: 1384831 bytes, checksum: 19d29fa75a797640daf649cbf9f9b262 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-21T14:44:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_JulianadaConceicaoInfantedeMarco.pdf: 1384831 bytes, checksum: 19d29fa75a797640daf649cbf9f9b262 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-21T14:44:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_JulianadaConceicaoInfantedeMarco.pdf: 1384831 bytes, checksum: 19d29fa75a797640daf649cbf9f9b262 (MD5) / A casca do grão da soja, um resíduo agroindustrial que possui em sua estrutura elevado teor de manana, foi utilizada no cultivo do fungo Aspergillus foetidus para a produção de mananases. A curva de indução enzimática demonstrou um aumento progressivo na produção de mananase, chegando ao máximo no 15° dia de cultivo, com atividade de 1,987 UI.mL-1 quando o fungo foi cultivado em casca do grão da soja. O concentrado, obtido pelo procedimento de ultrafiltração, quando incubado a 60°C em tampão acetato de sódio 50 mM pH 4,0 apresentou atividade de mananase de 6,392 UI.mL-1 e termoestabilidade a 60°C com atividade de 6,448 UI.mL-1 no 2° dia de incubação, perdendo 50% de atividade no 12º dia. O concentrado foi aplicado em coluna de filtração em gel do tipo Sephacryl S-100, e as frações apresentando atividade de mananase (58-65) foram submetidas à eletroforese em condições desnaturantes e análise por zimografia. A fração 58, denominada man 58, apresentou maior atividade de mananase, sendo selecionada para posteriores passos de caracterização. Man 58 foi mais ativa em tampão acetato de sódio 50 mM pH 4,0 a 60°C, atingindo maior atividade no 1° dia de incubação (1,015 UI.mL-1) e mantendo-se estável durante os 11 dias nos quais sua estabilidade à temperatura foi avaliada. Os valores de KM e Vmax de man 58 foram 3,29 mg/mL e 1,76 UI.mL-1, respectivamente. Man 58 foi ativada na presença de CaCl2, FeSO4 e NaCl, mas foi inibida por AgNO3, CoCl2, MgSO4, FeCl3, CuSO4, MgCl2, ZnCl2, ZnSO4, CuCl2, KCl, e EDTA. Os seis compostos fenólicos testados não apresentaram efeito inibitório significativo em man 58. Os licores de auto-hidrólise inibiram man 58. Quando avaliada por espalhamento de luz dinâmico (ELD), observou-se a presença de outras enzimas agregadas à man 58. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The soybean husk is an agricultural residue presenting in its structure a high level of mannan. It was used as carbon source in the cultivation of Aspergillus foetidus aiming the production of mannanase. The curve of enzyme induction showed a progressive production of mannanase, reaching a maximum on the 15th day of cultivation, on soybean husk. The concentrate obtained by ultrafiltration when incubated at 60°C in sodium acetate buffer pH 4.0 50 mM showed activity of mannanase of 6,392 UI.mL-1 and thermostability at 60°C with activity of 6,448 UI.mL-1 on the 2nd day of incubation, losing 50% activity on the 12th day. The concentrate was submitted to chromatography on Sephacryl S-100 gel filtration column, and the fractions showing the activity of mannanase (58-65) were submitted to electrophoresis under denaturing conditions and zymography analysis. The fraction 58 showed better activity of mannanase, called man 58, being selected for further characterization steps. Man 58 was most active at 50 mM sodium acetate buffer pH 4.0 50 mM at 60°C, reaching higher activity on 1st day of incubation (1.015 UI.mL-1) and remained stable during the 11 days when their temperature stability was evaluated. The KM and Vmax values were 3.29 mg/mL and 1.76 IU.mL-1, respectively. Man 58 was activated in the presence of CaCl2, FeSO4 and NaCl, but it was inhibited by AgNO3, CoCl2, MgSO4, FeCl3, CuSO4, MgCl2, ZnCl2, ZnSO4, CuCl2, KCl and EDTA. The six phenolic compounds tested showed little inhibitory effect on man 58. The auto-hydrolysis liquors inhibited man 58. When evaluated by dynamic light scattering (DLS), it was observed the presence of other enzymes aggregated with man 58.

As enzimas da via do ácido chiquímico constituem um excelente alvo para o desenho de novos agentes antibacterianos. Esta rota é encontrada em bactérias, fungos, plantas e parasitas do filo apicomplexa, mas está ausente em mamíferos. A Corismato sintase (CS) catalisa o último passo desta rota, produto que é utilizado em outras reações biossintéticas, como biossíntese de aminoácidos aromáticos, folato, vitamina K e ubiquinona. Esta reação é a mais incomum de toda rota e é unica na natureza. Ela converte 5-enolpiruvil-chiqiuimato-3-fosfato (EPSP) em corismato na presença de uma flavina mononucleotídeo reduzida (FMNH2) como coenzima. A predição da estrutura tridimensional (3D) da enzima CS de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) foi feita pela técnica de modelagem comparativa por homologia, utilizando a estrutura cristalográfica de CS de Streptococcus pneumoniae (PDB ID: 1QX0) como molde (≈ 42% de identidade), e o programa MODELLER6v2. Adicionalmente, com o intuito de entender as possíveis formas de ligação do substrato e da coenzima a enzima EPSP e flavina mononucleotídeo (FMN), repectivamente, foi feito um docking geométrico. A minimização de energia de todo o complexo mostrou, como esperado, que a maioria das interações ocorridas no molde são preservadas na estrutura de Mtb, exceto pela His11, Arg139 e Gln255. Entretanto, novas interações envolvendo Arg111, Gli113 e Ser317 também foram observadas. Este conhecimento poderá facilitar na busca por novos inibidores para esta enzima como fármacos alternativos no tratamento da tuberculose (Tb). / The enzymes of the shikimate pathway constitute an excellent target for the design of new antibacterial agents. This pathway is found in bacteria, fungi, plants and apicomplexan parasites but is absent in mammals. Chorismate synthase (CS) catalyzes the last step of this pathway, the product of which is utilized in other enzymatic transformations like the biosynthesis of aromatic amino acids, folate, vitamin K and ubiquinone. This reaction is the most unusual of the entire pathway and is unique in nature. It converts EPSP to chorismate in the presence of a reduced FMN coenzime. Structure prediction used the comparative protein structure modeling methodology. The three-dimensional (3D) structure prediction of the enzyme CS of Mycobacterium tuberculosis was performed using the crystal structure (PDB ID: 1QX0) of CS from Streptococcus pneumoniae as template (≈ 42% identity), and the MODELLER6v2 package. Additionally, in order to understand the possible binding modes of substrate and coenzime to the enzyme, EPSP and FMN, respectively, were geometrically docked to CS. Energy minimization of the whole complex showed, as expected, that most of the template interactions are preserved in the Mtb structure, except for His11, Arg139 and Gln255. However, novel interactions involving Arg111, Gly113 and Ser317 were also observed. This knowledge should facilitate the search for inhibitors of this enzyme as alternative agents to treat tuberculosis.

Orientador: Nelson Eduardo Duran Caballero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-22T03:16:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_MariaSilvaniaMarques_D.pdf: 6430228 bytes, checksum: fe0d05dd7fff83102af6fbbc503dff95 (MD5) Previous issue date: 1997 / Doutorado