No presente trabalho foram avaliados os aspectos biológicos básicos e as atividades lignocelulósicas de fungos isolados a partir de indústrias de celulose. Para o isolamento foi descrito um método seletivo, obtendo um total de 115 isolados, dos quais 12 foram selecionados quanto a produção de celulase. Todos os isolados selecionados apresentavam atividades β-glicosidase (Salicinase), Exoglucanase (Avicelase) e Endoglucanase (CMCase) semelhantes à linhagem QM9414 de T. reesei. Quanto a atividade ligninolítica foi estabelecido um método preliminar identificando as linhagens de Aspergillus fumigatus e Fusarium solani, como capazes de degradar lignina. Os isolados selecionados foram classificados e caracterizados biologicamente envolvendo observações citológicas e avaliação do desenvolvimento, estabelecendo o período e as condições adequadas para o cultivo. Entre as linhagens analisadas somente Trichoderma pseudokoningii e Fusarium solani apresentaram conídios uninucleados. A avaliação do crescimento e esporulação das linhagens selecionadas em diferentes meios de cultivo demonstrou que o pH é um fator limitante em meio contendo celulose como fonte de carbono e que todas as linhagens selecionadas podem ser utilizadas para se obter mutações auxotróficas, uma vez que se desenvolvem bem em meio mínimo. Os padrões eletroforéticos para α e β esterase das linhagens selecionadas apresentaram diferentes perfis de bandas, permitindo correlacioná-los com as características morfológicas dos esporos das linhagens e serem utilizados como um dos parâmetros auxiliares na classificação dos fungos isolados. Entre as linhagens selecionadas, a Fusarium solani foi considerada a melhor quanto a produção de enzimas lignocelulolíticas e se mostrou promissora para estudos genéticos e de melhoramento, uma vez que esta linhagem apresenta conídios brancos e uninucleados, facilidade na obtenção de mutantes morfológicos com luz ultra-violeta e crescimento em meio mínimo. / This work was carried out aiming to eva1uate the basic bio1ogica1 aspects and the 1ignocellulolytic activities in fungi isolated from cellulose industries. It was described a selective isolation method and from a total of 115 isolates, 12 of them were selected according to their cellu1ase production. All the selected isolates showed β-glicosidade (salicinase), exog1ucanase (avicelase) and endoglucanase (CMCase) activities similar to Trichoderma reesei QM94l4 strain. A preliminary method was stablished for testing ligninolytic activity and according to it, strains of Aspergillus fumigatus and Fusarium solani are invo1ved in the degradation of lignin. The selected isolates were classified and bio1ogically characterized according to cytologica1 observations and their deve1opment eva1uation leading to stablish the best cultivation conditions. Among the ana1ysed strains only Trichoderma pseudokoningii and Fusarium solani showed 100% uninucleated conidia. The evaluation of growing and sporulation of the selected strains ln different culture media showed that pH is the limiting factor in a medium containing cellulose as the sole carbon source. All the selected strains grow well in minimal medium and can be used to get auxotrophic mutants. The α and βesterase electrophoretic patterns of the selected strains were shown to have different band profiles and it allows to correlate them with the spore morphological characteristics, and to be used as one of the useful parameters in classifying the isolated fungi. Among the selected strains, Fusarium solani was considered to be the best lignocellulolytic enzymes producer and it might be very useful for further genetics and breeding studies since it has uninucleated white conidia, it is easy to induce UV morphological mutants and it grows very well in minimal medium.

Orientador: Renato Wendhausen Jr.. / Co-orientador: Paulo Cesar de Jesus. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional Blumenau, Centro de Ciências Exatas e Naturais, Programa de Pós-Graduação em Química.

Orientador: Lorena Benathar Ballod Tavares. / Co-orientador: Cristiane Vieira Helm. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Tecnológicas, Programa de Pós-Graduação de Engenharia Ambiental.

Orientador: Paulo Arruda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T05:18:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dante_RicardoAugusto_M.pdf: 3047440 bytes, checksum: d07e6d661d90e857dc49807527d8c607 (MD5) Previous issue date: 1997 / Mestrado

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é amplamente empregado comercialmente como agente biocontrolador de artrópodes em pragas na agricultura e pecuária, abrangendo vasta gama de hospedeiros. Para que o processo infectivo tenha sucesso, é necessário que o fungo atravesse a cutícula, a primeira e principal defesa do artrópode. A transposição dessa primeira barreira ocorre pela secreção de proteases, lipases e quitinases para degradar seus principais componentes estruturais. Dentre as proteases expressas por M. anisopliae, a família Pr1 de serino-proteases está associada à virulência. Essa família possui 11 isoformas - Pr1A a Pr1K - em M. anisopliae, sendo subdivididas em duas classes. A Classe II compreende 10 isoformas subdivididas em três subfamílias. Essas isoformas agem de forma sinergística entre si e com outros fatores, conferindo maior virulência e permitindo a infecção de diferentes hospedeiros. É suposto que a virulência coevolui por seleção recíproca com o hospedeiro, havendo seleção positiva para a evolução de novas proteases ou isoformas que não sejam inativadas por inibidores do hospedeiro. O presente trabalho busca testar essa hipótese na Classe II da família Pr1, com especial foco em M. anisopliae, utilizando diferentes métodos de inferência filogenética em conjuntos de aminoácidos e nucleotídeos das isoformas individuais, bem como agrupadas por subfamílias, abrangendo homólogos do gênero Metarhizium e fungos relacionados. As árvores obtidas e seus respectivos alinhamentos nucleotídicos foram analisados quanto à substituições sinônimas e não sinônimas para inferência de seleção positiva. Tanto para os conjuntos de dados individuiais quanto para aqueles agrupados por subfamília, as filogenias retratam grupos com alto suporte estatístico condizentes com a taxonomia dos organismos que sintetizam essas proteínas, embora contendo pequenas discrepâncias. Foram identificados sítios sob seleção positiva em seis das nove isoformas avaliadas, em sua maioria localizados no domínio proteolítico. Esses resultados indicam que existe pressão seletiva diferenciada para gerar novas variações de Pr1, com efeito potencial na especificidade por hospedeiros, aumento de virulência, ou adaptação a outros estilos de vida hospedeiro-independente. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisoplie is widely applied as a pest-arthropod biocontrol agent in crops and animal production, encompassing a wide array of hosts. For a successful infection, it is vital that the fungus breaches the host’s cuticle, the first and main defense of artrhopods. Transposing this first barrier requires secreted proteases, lipases and chitinases that degrade the cuticle’s main structural components. Among the expressed proteases of M. anisopliae, the Pr1 family of serine proteases is related to its virulence. In M. anisopliae, this family contains 11 isoforms – Pr1A through Pr1K – divided into two classes. Class II comprises 10 isoforms further divided into three subfamilies. It is believed that these isoforms act synergistically and with other virulence fators, allowing the infection of different hosts. Presumably, virulence coevolves through reciprocal selection with the host, where positive selection occurs for the evolution of new proteases or isoforms that are not inactivated by the host’s inhibitors. The current work tests this hypothesis in Class II of the Pr1 family, with a special focus in M. anisopliae, employing different methods for phylogenetic inference in aminoacid and nucleotide datasets alike for each isoform individually as well as grouped by subfamily, encompassing homologs for the Metarhizium genus and related fungi. The inferred trees and their respective alignments were analyzed regarding synonymous and non-synonymous substitutions to detect positive selection. For each individual dataset, as well as for their subfamily groups, phylogenies depict groups that match the taxonomy of their respective organisms with high statistical support, albeit with minor discrepancies. Positively selected sites were identified in six out of nine Pr1 isoforms, most of them located within the proteolytic domain. These results imply that there exists a differential selective pressure for the evolution of novel Pr1 variations, potentially affecting host specificity, increasing virulence or adapting the fungus to different host-independent lifestyles.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-06-29Bitstream added on 2014-06-13T20:21:37Z : No. of bitstreams: 1 goulart_aj_dr_araiq.pdf: 655423 bytes, checksum: 42bb817e04bb39a55667ebbe452f2ca0 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A utilização de açúcar invertido apresenta uma série de vantagens em relação à acarose diluída e a hidrólise enzimática é superior em rendimento à hidrólise ácida, lém de fornecer um produto de melhor qualidade e não gerar resíduos tóxicos. este sentido, o objetivo deste trabalho foi imobilizar multipontualmente uma nvertase comercial e uma inulinase produzida por uma cepa de Kluyveromyces arxianus em suporte glioxil-agarose, amino-agarose, glutaraldeído-agarose e com uportes epóxidos Sepabeads, Sepabeads-amino e Eupergit C, e determinar as tividades, estabilidades e capacidade de reuso dos derivados. Os derivados foram btidos através de diferentes protocolos e suas propriedades cinéticas Km e Vmax oram determinadas. Os resultados obtidos com os derivados foram comparados com os obtidos com as enzimas solúveis. Quando a invertase foi imobilizada no suportes agarose usando 5mg de enzima/g de suporte, os derivados possibilitaram ao menos duas reutilizações com manutenção da atividade, o que não ocorreu quando alta concentração de enzima foi colocada para reagir com o suporte, tanto usando agarose CL6B como a CL4B. Esta mesma enzima forneceu derivados com alta atividade quando foi realizado crosslinking com glutaraldeído, usando agarose CL6B e CL4B, cujas atividades foram as mais elevadas entre todos os derivados (21,643 e 14,984 U/mg prot, respectivamente). Foram obtidos seis derivados de invertase com estabilidade à temperatura de 50°C po r 1440 min e com atividade relativa acima de 80% nas reutilizações; no entanto, não foram obtidos derivados estabilizados com a enzima inulinase. A partir da análise destes resultados foi possível determinar que os derivados amino+glutaraldeído CL6B e amino+glutaraldeído CL4B foram os melhores derivados ativos estabilizados, apresentando eficiência catalítica (Vmax/Km) 0,59 e 0,52,... / The use of inverted sugar presents a series of advantages in relation to diluted sucrose and the enzymatic hydrolysis have a superior yield over acid hydrolysis, beyond supplying a product of better quality and do not generate toxic residues. In this way, the objective of this work was to immobilize by multipoint linkages a commercial invertase and an inulinase produced by a Kluyveromyces marxianus strain on glyoxyl-agarose, amine-agarose, glutaraldehyde-agarose supports and Sepabeads, Sepabeads-amine and Eupergit C epoxy supports, and to determine the activities, stabilities and the capability of reutilization of the derivatives. The derivatives were obtained through different protocols and kinetic parameters Km and Vmax were determined. The results of the derivatives were compared with the ones obtained with soluble enzymes. When invertase was immobilized on agarose using 5mg of enzyme/g of support, it was possible to reutilize the derivatives at least two times with maintenance of the activity, what it was not possible when high enzyme concentration was placed to react with the support, using agarose CL6B or CL4B. This same enzyme supplied derivatives with high activity when glutaraldehyde was used to crosslink the enzyme and agarose CL6B and CL4B supports, with the higher activity of all (21,643 and 14,984 U/mg prot, respectively). Six invertase derivatives were obtained with stability to the temperature of 50°C and for the period of 1440 min, with relative activity above 80% in the reutilizations, but no one inulinase stabilized derivative was obtained. Analyzing these results, it was possible to conclude that the amine+glutaraldehyde CL6B and amine+glutaraldehyde CL4B were the best active stabilized derivatives, presenting catalytic efficiency (Vmax/Km) of 0,59 and 0,52, respectively, corresponding to 59% and 52% of the soluble enzyme efficiency. Keywords: Enzyme immobilization, ...(Complete abstract click electronic access below)

Resumo: Este trabalho tem como objetivo estudar a produção da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) empregando culturas de Bacillus sp subgrupo alcalophilus utilizando como fonte de carbono fécula de mandioca (polvilho) proveniente de uma fecularia de mandioca. Nos ensaios foram empregados Bacillus sp subgrupo alcalophilus, isolado de água residuária de uma fecularia de mandioca. Para avaliar a produção de CGTase mediante a atividade enzimática pelo Bacillus sp subgrupo alcalophilus foi utilizado um planejamento fatorial a dois (2) níveis, estudando como variáveis as concentrações da fonte de carbono (polvilho), de nitrogênio e de carbonato de sódio. Os experimentos foram realizados em Erlenmeyers de 300 mL de capacidade contendo 100 mL do meio de produção com pH inicial de 9,2, a 150 rpm e temperatura de 35 ± 1ºC durante 72 horas de fermentação. A produção de CGTase foi monitorada pela determinação da atividade enzimática (U/mL). Após os ensaios realizados em frascos foram realizados experimentos em biorreator de 5 L de volume útil, contendo 2 L do meio de produção, pH de 9,20, agitação de 150 rpm e temperatura de 35 ± 1ºC durante 72 h de fermentação, utilizando um planejamento fatorial a dois (2) níveis, estudando como variáveis as taxas de aeração e a velocidade de agitação. A otimização das concentrações da fonte de carbono, nitrogênio e carbonato de sódio foram obtidas a partir de um planejamento experimental composto central (PCC) e seus resultados analisados pelas superfícies de resposta. Os melhores resultados do planejamento encontrados no ponto central, corresponderam a 6,96 g/L da fonte de carbono, 8,07 g/L de nitrogênio e 9,45 g/L de carbonato de sódio. A maior produtividade obtida de CGTase após 72 horas de fermentação, foi 98,86 U/mL com valor teórico de 98,87 U/mL. A partir do melhor resultado obtido no PCC, determinou-se... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to investigate the Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) enzyme production by Bacillus sp subgroup alcalophilus using cassava starch (manioc flour) as a carbon source. Bacillus sp subgroup alcalophilus was isolated from wastewater of cassava flour industry. To evaluate the assays results, two (2) levels of complete factorial experimental design was used, studying the variables: carbon source, nitrogen and sodium carbonate concentrations. The experiments were performed in 300 mL erlenmeyer flasks containing 100 mL of medium production with initial pH of 9.2, at 150 rpm and 35±1ºC, during 72 hour. CGTase production was monitored by measurements of enzymatic activity (U/mL). After the flasks experiments, assays was running in 5 L containing 2 L of medium production, pH 9.2, 35 ± 1ºC during 72-hours using a factorial design at two (2) levels for aeration and agitation rate. The optimization of carbon source, nitrogen and sodium carbonate concentrations was obtained by a central composite design and their results analyzed by surface response. The best results was located on the central point, 6.96 g/L of carbon source, 8.07 g/L of nitrogen and 9.45 g/L of sodium carbonate. The CGTase activity predicted by model was 98.86 U/mL and the experimental activity obtained was 98,87 U/mL. After the best results obtained by PCC, the conditions of aeration (vvm) and agitation (rpm) rates was determined in bioreactor using a complete factorial experimental design. The best conditions, of 2.18 vvm and agitation of 157.07 rpm gave a experimental predicted CGTase activity of 130.36 U/mL, which was very close to the theoric CGTase activity of 130.33 U/mL. / Orientador: Antonio Carlos Simões Pião / Coorientador: Jonas Contiero / Banca: Heloiza Ferreira Alves do Prado / Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini / Mestre

A doença periodontal inflamatória envolve mecanismos imunopatológicos e inflamatórios contra microrganismos da placa dentobacteriana, sendo que diversas células, tanto residentes quanto inflamatórias, e mediadores químicos participam ativamente da resposta do hospedeiro. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o modelo experimental da doença periodontal inflamatória induzida por ligadura em ratos, com ênfase na avaliação clínica e microscópica, bem como no estudo quantitativo dos mastócitos e da presença de RNA mensageiro (RNAm) codificador das enzimas óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e metaloproteinases (MMPs) -2 e –9. Para este fim, as amostras correspondentes foram obtidas em diferentes períodos de indução da doença periodontal inflamatória experimentalmente induzida (1, 3, 7, 14, 28, 42 e 56 dias ou 1, 3, 7, 14 e 30 dias) e avaliadas microscopicamente por meio das colorações de hematoxilina-eosina e azul de toluidina, bem como semi-quantitativamente por meio de Reação em Cadeia da Polimerase precedida por Transcrição Reversa (RT-PCR). Para fins comparativos, foram utilizadas amostras de tecido gengival normal do mesmo animal. Microscopicamente, observou-se exuberante presença de polimorfonucleares (PMNs) nos tecidos afetados pela doença periodontal inflamatória, especialmente nos períodos inicias. Detectou-se ainda a expressão aumentada de RNAm para MMP-9 apenas nos tecidos afetados pela doença periodontal nos períodos de 3 e 7 dias, porém não se observou aumento estatisticamente significativo na expressão de RNAm para MMP-2 em nenhuma das comparações analisadas. Com relação à iNOS, a expressão de seu RNAm foi maior nos tecidos doentes quando comparados com os tecidos gengivais controle no período de 3 dias, assim como nos tecidos afetados pela doença periodontal no período de 3 dias ao se comparar com os tecidos doentes aos 7 dias após a indução. Ainda, o número de mastócitos/mm2 na região adjacente aos epitélios sulcular e juncional, bem como na área de inserção conjuntiva, apresentou-se diminuído na doença periodontal inflamatória experimentalmente induzida em ratos, com relação aos tecidos gengivais saudáveis, tanto no lado vestibular quanto no lingual. Nossos resultados sugerem que a doença periodontal experimentalmente induzida em ratos caracteriza-se por lesões inflamatórias com predomínio de células PMNs e áreas de reabsorção óssea alveolar desde as primeiras 24 horas após a indução, porém sem progressão para um infiltrado inflamatório linfoplasmocitário organizado focalmente que caracteriza a doença humana. Provavelmente, a MMP-9 e o óxido nítrico (NO) têm participação na evolução e patogênese da doença periodontal experimentalmente induzida por ligadura, incluindo destruição tecidual e perda óssea alveolar. De forma contrária, os mastócitos parecem ter limitada participação na referida doença, não constituindo, provavelmente, fonte significativa da iNOS e da MMP-9. / Inflammatory periodontal disease envolves imunopathological and inflammatory mechanisms against bacterial dental plaque, including the participation of host resident as well as inflammatory cells and chemical mediators. The present work characterized a ligature-induced model of experimental inflammatory periodontal disease, emphasysing clinical and microscopic valuation as well as quantitative study of the number of mast cells and the presence of expression of mesanger RNA (mRNA) of inducible nitric oxide (iNOS) and metalloproteinases (MMPs) -2 and -9. Samples were obtained from different periods and microscopically analysed trough hematoxylin-eonin and toluidin blue stainings, and quantitatively estimated through Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT-PCR). The results revealed the presence of numerous polymorphonuclear (PMN) cells on tissues affected by inflammatory periodontal disease, mainly on initial periods. Significant expression of MMP-9 was still detected on tissues affected by inflammatory periodontal disease on day 3 and 7, with no significant difference on the expression of MMP-2. iNOs expression was also higher on diseased tissues compared to controls on day 3 and between days 3 and 7 diseased tissues themselves. Mast cells numbers were reduced on the dentogengival area of diseased tissues compared to controle ones, on buccal and ligual sides. Our results suggest that experimentally induced inflammatory periodontal disease are characterized by inflammatory lesions with the predominance of PMNs and bone resorption areas since the first day of induction, although without a progression to a lymphocyte / plasma cells inflammatory infiltrate characteristic of human disease. Probably, MMP-9 and iNOS participate on the evolution and pathogenesis of ligature-induced periodontal disease, including tissue destruction and alveolar bone resorption. On the other hand, mast cells seem no to be a significant source of iNOS and MMP-9.

Orientador: Paulo César de Jesus. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Exatas e Naturais, Programa de Pós-Graduação em Química.

Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) - Centro Universitário FEI, São Bernardo do Campo, 2016.