Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) - Centro Universitário FEI, São Bernardo do Campo, 2016.

Orientador: Thales Rocha de Mattos Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-03T20:19:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goulart_MariadasGracasVilela_D.pdf: 1642987 bytes, checksum: fe38a17584e1588a4dd449524166738d (MD5) Previous issue date: 2004 / Doutorado

Orientador : Graciliano de Oliveira Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-13T23:54:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_ValdineteLinsda_D.pdf: 3383607 bytes, checksum: 7f0160b6620a8f046ea43c3f16a5fe39 (MD5) Previous issue date: 1991 / Doutorado

Orientador: Francisco Maugeri Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:42:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Contiero_Jonas_D.pdf: 6240338 bytes, checksum: dbd339aaa2fb31f23f673d121a70050b (MD5) Previous issue date: 1992 / Resumo: O principal objetivo deste trabalho, foi estudar a produção da enzima invertase por Kluyveromyces bulgaricus utilizando diferentes processos de fermentação com células livres e imobilizadas. Estudou-se igualmente a influência dos substratos sacarose, glicose e frutose na cinética de crescimento do microrganismo e de produção da enzima, além de procurar caracteriza-la cineticamente. As fermentações foram realizadas á temperatura de 30°G e aeração entre 0,2 a 0,3 vvm, sendo que dos processos estudados, os melhores resultados foram obtidos- para reator contínuo com células imobilizadas, com volume liquido de 530 ml, utilizando melaço como fonte de carbono e agua de maceração de milho como fonte de nitrogênio. Os valores de atividade enzimática, produtividade e rendimento para os diferentes processos foram: para o processo batelada simples respectivamente 9,17 U.I/ml, 0,19 U.I/ml.h e 424,34 U.I/g ART; para processo batelada alimentada 11,0 U l/mi, 1,3 U.I/ml.h e 883,66 Ul/g ART; para processo em reator contínuo duplo estágio 32,0 U.I/ml, S,30 U.I/ml.h e 1749,60 U.I/g ART e para reator contínuo com células imobilizadas 97,3 U.I/ml , 5,74 U.I/ml.h e 5322,97 U.I/g AKT. Para o estudo da influência do substrato na produção da enzima, verificou-se tratar-se de enzima constitutiva e que a produção é inibida pela presença em excesso de sacarose, glicose e frutose. Através da técnica de perturbação por degrau, em fermentação contínua determinou-se µmax constante de saturação Ks para o microrganismo. As constantes cinéticas de crescimento µmax (velocidade específica de crescimento máxima) e Ks ( constante de saturação ) foram deter terminadas em fermentação contínua. Verificou-se que para qualquer dos substratos utilizados (sacarose, glicose e frutose) µmax foi aproximadamente constante e igual a 0,24 h-1, enquanto que Ks foi 1,4*10-4, 1,15*10-3 e si 1,77*10-3 mol/l, respectivamente para sacarose, glicose e frutose. Os valores das constantes cinéticas µmax e Ks para a produção da enzima nos diferentes substratos foram: 3099,51 U.I/gcel . h e 0,0181 mol/l; 5264,8 U.I/g h e 0,0023 mol/l e 14S0.99 U.I/g . h e 0.0097 mol/l para a sacarose, glicose e frutose respectivamente. Quanto a caracterização da enzima foram encontrados os valores da energia de desativação para a enzima precipitada com álcool e após passsagem por coluna de DEAE- celulose, 61043 cal/g.mol e 93861,9 cal/g.mol respectivamente. Para a enzima bruta (após precipitação com álcool) foram encontrados os valores de Km igual 0,0662 mol/l e Vmax igual a 2037 U.I/ml / Abstract: The main objective of this work was to study the production of enzyme invertase by Kluyveromyces bulgaricus using immobilized cell and free cell fermentations. Parallel with this, it was studied the influence of the substrates sucrose, glucose and fructose on the kinetics of cell growth and enzyme production. The fermentations were carried out at a temperature of 30°C and with aeration at a level between 0.2 and 0.3 vvm. The best results were obtained utilizing the continuous reactor operating with immobilized cells and a liquid volume of 530 ml. Molasse from sugar cane juice was the carbon source and the nitrogen source was the corn steep liquor. The values found f or enzyme production, and productivity and yield for the various process studied were as follows: for the simple batch process respectively 9.17 U.I./ml, 0.19 U.I./ml.h and 424.34 U.I./g ART; for fed batch 11.0 U.I./ml, 1.3 U.I/ml.h and 883.66 U.I/g ART; for 2 stage continuous culture 32.0 U.I.Xml, 5.30 l).I./ml.h and 1749.60 U.I/g ART; and for continuous culture with immobilized cells 97.3 U.l./ml, 5.74 U.I./ml.h and 5322.97 U.I./g ART. The study of influence on enzyme production confirmed that the enzyme is produced constitutively and is inhibited by excess sucrose, glucose or fructose. Using the technique of graded perturbation in continuous culture, values for umax (specific growth rate) and Ks (Saturation constant) of the microorganism were determined, umax found to be approximately constant at 0,24 h-1 while Ks was found to be 1.4x10-4, 1.15x10-9 and 1.77x10-9 mol/l for sucrose, glucose and fructose respectively. The kinetcs constant umax and Ks for enzyme production were: 3099.51 U.I/gcells.h and 0.0181 mol/l; 5264.8 U.I/gcells.h and 0.0023 mol/l, and 1450.99 U.I./gcells .h and 0.0097 mol/I for sucrose, glucose and fructose respectively. With respect the characterization of the enzyme itself, the deactivation of the energy of the purified enzyme after precipitation with ethanol was 61043 cal/gmol wile after further purification using a DEAE-celulose column was 93861.9 cal/mol For the raw enzyme (after simpy precipitating with ethanol) a Km value of 0.0662 mol/l and Vmax value of 2037U.I./ml / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-05-13T13:13:32Z No. of bitstreams: 1 2016_DiegoEliasHonda.pdf: 2169221 bytes, checksum: 3f749f9435181b7433ed52f969f2025d (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-20T21:34:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DiegoEliasHonda.pdf: 2169221 bytes, checksum: 3f749f9435181b7433ed52f969f2025d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T21:34:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DiegoEliasHonda.pdf: 2169221 bytes, checksum: 3f749f9435181b7433ed52f969f2025d (MD5) / O inibidor de serinoproteases da família Bowman-Birk Black eyed-pea Trypsin/Chymotrypsin Inhibitor (BTCI), encontrado em grãos de feijão de corda Vigna unguiculata, é uma proteína com enorme potencial biotecnológico, sendo destacado seu aspecto farmacológico. Sua estrutura possuí sete ligações dissulfeto que estendem sua ação a condições mais extremas de temperatura e pH. Toda sua aplicabilidade decorre do fato de inibir as enzimas tripsina e quimotripsina. Neste trabalho, buscou-se encontrar metodologia semi-empírica que fosse capaz de extrair informações químicas sobre o processo inibitório que ocorre entre o BTCI e a tripsina, bem como a construção de um sistema que permita um olhar mais detalhado sobre os fenômenos que ocorrem na interface entre o inibidor e a enzima a ser inibida. Neste sentido, as propriedades avaliadas foram os orbitais de fronteira e seus quatro vizinhos imediatos. Não obstante, também foi mensurada a força de cada uma das sete ligações dissulfeto. Observou-se que, para o estudo do BTCI no vácuo, diferentes metodologias semi-empíricas forneceram resultados adversos. Conclusão semelhante foi observada para o caso do BTCI complexado com a tripsina. Todavia, quando se analisou a interface entre essas duas proteínas, os métodos em questão tiveram grande correspondência entre si, indicando que a Cys22 é um dos resíduos mais importantes na interface, provavelmente ajudando a manter a conformação durante o processo de ancoragem. Quanto às ligações dissulfeto, não foi possível afirmar sobre qual delas maior impacta a estrutura do BTCI. Contudo, verificou-se que as ligações entre os resíduos Cys34 e Cys19, e Cys61 e Cys46 foram as de menor contribuição energética. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Bowman-Birk Trypsin/Chymotrypsin inhibitor from Vigna unguiculata seeds (BTCI) is a protein with high biotechnological potential, especially due to its pharmacological aspects. Its structure has seven disulfide bonds which extends BTCI working range to some severe temperature and pH conditions. All BTCI applicability is due to its trypsin and chymotrypsin inhibition. This way, we tried to find some semi-empirical methodology capable to give chemical information about the inhibition process between BTCI and trypsin, as well as to construct a system that allows a closer look about what happens within those proteins interface. To accomplish this objective, we looked to the frontier orbitals and their four immediate neighbors. Likewise, each of its seven disulfide bonds had their energy determined. We conclude that the study of BTCI in vacuum with different methodologies give different results. Similar conclusion was seen for BTCI complexed with trypsin. However, when we analyzed the interface between those two proteins all methods are in agreement, pointing that Cys22 is responsible to maintain the interface conformation during the enzyme-inhibitor docking. About the disulfide bonds, it wasn’t possible to confirm which one has the greatest impact on BTCI structure. Nevertheless, we saw that bonds between Cys34 and Cys19, and Cys61 and Cys46 residues had the lowest energy contribution.

Orientador : Reginaldo Bruno Gonçalves / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-01T00:30:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosa_RosimeireTakaki_M.pdf: 2559685 bytes, checksum: 43d521518e2961f1a362b4f397ea0a89 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A presente pesquisa teve por objetivo analisar a variabilidade infraespecífica de cepas de Streptococcus mutans isoladas de indivíduos livres de cárie. Foram coletadas amostras de saliva total não estimulada, placa dental e de dorso de língua de indivíduos que apresentavam índice CPOD igual a zero. Após dispersão e diluição seriada das amostras, alíquotas de cada diluição foram inoculadas em meio Mitis Salivarius Bacitracina Agar (MSB). Após incubação em estufa de pC02 10% a 37°C, foram isoladas do meio colônias com morfologia típica de estreptococos, para posterior identificação por provas bioquímicas. As amostras foram incubadas em caldo de Infusão de Cérebro e Coração (BHI), centrifugadas e lavadas, sendo os sedimentos obtidos submetidos ao processo de extração das proteínas intracelulares. Os extratos protéicos foram separados por eletroforese em gel de amido e corados especificamente para a detecção do polimorfismo isoenzimático. Os géis foram analisados através dos sistemas enzimáticos: leucina aminopeptidase (LAP), manitol 1-fosfato desidrogenase (MIP), manose fosfato isomerase (MPI), nucleosídio fosforilase (NSP), fenilalanil leucina peptidase (PLP) e transaminase glutâmico-oxalacética (GOT). A análise comparativa dos perfis da eletroforese de isoenzimas (Multilocus Enzyme Electrophoresis-MLEE) dos isolados, acessada pela soma de todos sistemas enzimáticos, permitiu observar a ocorrência de dois ou mais clones de S. mutans nos diferentes sítios nestes voluntários. Os resultados obtidos mostram que pode ser encontrado mais de um tipo genético de S. mutans colonizando os diferentes sítios em um mesmo indivíduo / Abstract: The current research had as aim to analyze the infra-specific variability of Streptococcus mutans strains obtained from caries-free individuals. Non-stimulated whole saliva, dental biofilm and tongue dorsum samples were collected from subjects with DMFT = O. After dispersing and decimal dilutions, aliquots from each dilution were inoculated in Mitis Salivarius Bacitracin (MSB) agar plates, in duplicate. After growing at pCO2 100,/0 and 37°C, it was taken some S. mutans suspect colonies that were biochemically identified. S. mutans-positive colonies were grown in Brain Heart Infusion (BHI) broth, they were centrifuged and washed. The pellets were submitted to cell disruption and protein extraction. Protein extracts were separated by starch gel electrophoresis and specifically stained in order to obtain the isoenzymic polymorphism. The gels were analyzed for enzymatic systems: leucine amino peptidase (LAP), mannitol-l-phosphate dehydrogenase (MIP), mannose phosphate isomerase (MPI), nucleoside phosphorylase (NSP), phenylalanyl leucine peptidase (PLP) e glutamic-oxalacetic transaminase (GOT). The comparative analysis of MLEE profiles assessed by the sum of all enzymatic systems allowed the observation of occurrence of one or more S. mutans dones, varying in the different intra oral sites among these volunteers. The obtained results showed that it may be found more than one genetic type of such S. mutans colonizing different sites in a same subject / Mestrado / Mestre em Biologia e Patologia Buco-Dental

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-10-04T15:58:08Z No. of bitstreams: 1 2016_JulianaCarvalhoRochaAlvesdaSilva.pdf: 855628 bytes, checksum: 823ea873caefea29e8d4a65f4c6465a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-16T17:57:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JulianaCarvalhoRochaAlvesdaSilva.pdf: 855628 bytes, checksum: 823ea873caefea29e8d4a65f4c6465a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-16T17:57:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JulianaCarvalhoRochaAlvesdaSilva.pdf: 855628 bytes, checksum: 823ea873caefea29e8d4a65f4c6465a6 (MD5) / A leucemia linfoide crônica (LLC) é uma doença linfoproliferativa que resulta no acúmulo de células B monoclonais na medula óssea, sangue periférico, linfonodos e baço. O diagnóstico dessa doença costuma ocorrer após os 70 anos de idade, sendo mais frequente em homens do que em mulheres. Além disso, esta é a leucemia mais prevalente nos países ocidentais. Embora a etiologia da doença seja desconhecida, alguns fatores prognósticos são bem conhecidos como a expressão da proteína ZAP-70, alta contagem de células malignas (leucocitose) associado ao tempo de duplicação linfocitária e alterações cariotípicas específicas ou aquisição de cariótipo complexo (3 ou mais alterações cariotípicas). Atualmente, a fisiopatologia de diversos tipos de neoplasias tem sido relacionada a mecanismos epigenéticos. Nesse sentido, foi demonstrado que a expressão das enzimas Histona Metiltransferases (HMTs) das famílias Euchromatic Histone-Lysine N-Methyltransferase (EHMT) e Suppressor Of Variegation (SUV) podem estar relacionadas à instabilidade genômica e ao pior prognóstico de alguns tipos de câncer. Considerando essas associações, investigamos nesse trabalho a expressão dos genes membros das famílias EHMT e SUV em pacientes com LLC e associamos esses achados a marcadores de prognóstico, como: expressão da proteína ZAP-70, cariótipo e leucometria desses pacientes. Nesse trabalho, observamos que a baixa expressão do gene SUV39H1 está associada à aquisição de anormalidades citogenéticas em pacientes com LLC. A expressão elevada de SUV39H2 está associada à baixa contagem de plaquetas e a um maior número de casos com alterações cariotípicas. A baixa expressão de SUV4-20H1 está relacionada com maior leucometria, enquanto que a baixa expressão de SUV4-20H2 está associada à expressão elevada de ZAP-70. EHMT1 se mostrou com expressão elevada nas amostras de LLC, enquanto que EHMT2, embora não tenha apresentado expressão diferencial entre LLC e pacientes saudáveis, está associado à aquisição de cariótipo complexo nessa doença. Nossos dados evidenciam que as famílias de metiltransferases SUV e EHMT estão associadas à aquisição de indicadores de mau prognóstico na LLC, como contagem de plaquetas, maior número de células malignas, expressão de ZAP-70 e aquisição de cariótipo complexo. Esses dados contribuem para a área de epigenética e câncer, podendo servir de base para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que visem controlar processos epigenéticos na LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a lymphoproliferative disease that results in accumulation of monoclonal B cells in bone marrow, peripheral blood, lymph nodes and spleen. The diagnosis of LLC occurs, normally, after 70 years, affects slightly more men and this disease is the most common leukemia in Western countries. Although the etiology of the CLL is unknown, some prognostic factors are well known as the expression of ZAP-70, the high quantity of malignant cells (leukocytosis) associated with lymphocyte duplicating time and karyotype changes or acquisition of complex karyotype (three or more karyotype alterations). Currently, the pathophysiology of various types of cancers has been linked to epigenetic mechanisms. In this line, it was shown that the expression of the enzymes histone methyl Transferases (HMTs) of Euchromatic Histone-Lysine N-Methyltransferase (EHMT) and Suppressor Of Variegation (SUV) families may be related to genomic instability and to bad prognosis markers of some cancers. Considering these associations, we investigated in this study the expression of EHMT and SUV members in CLL samples. Furthermore, we investigated the association of gene expression analysis and prognosis markers, like: ZAP-70 expression, karyotype and white blood cell count of these patients. In this study, we found that low expression of SUV39H1 gene is associated with the presence of cytogenetic abnormalities in patients with CLL. The high expression of SUV39H2 is associated with low platelet count and with the presence of cytogenetic abnormalities. Low SUV4-20H1 expression is related to the accumulation of leukocytes, while the low SUV4-20H2 expression influences the expression of ZAP-70. EHMT1 was high expressed in LLC, while EHMT2 was associated with the presence of complex karyotype in this disease. Our data clearly show that the methyltransferases SUV and EHMT influence generally in CLL, being associated with the presence of bad prognosis markers in this disease, including platelet count, accumulation of malignant cells, expression of ZAP-70 and abnormal karyotype. These results may provide the basis for the development of new therapeutic strategies to prevent CLL progression.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-07T20:21:05Z No. of bitstreams: 1 2018_AntonielleVieiraMonclaro.pdf: 9739696 bytes, checksum: fb2e730ea94e180181077962c855b712 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-08T19:09:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_AntonielleVieiraMonclaro.pdf: 9739696 bytes, checksum: fb2e730ea94e180181077962c855b712 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:09:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_AntonielleVieiraMonclaro.pdf: 9739696 bytes, checksum: fb2e730ea94e180181077962c855b712 (MD5) Previous issue date: 2018-08-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / Nesta tese foram feitos estudos mais aprofundados de enzimas produzidas pelo fungo Aspergillus tamarii em diferentes contextos de degradação de biomassa lignocelulósica. O primeiro trabalho avaliou a influência de condições de cultivo na ação de celulases e xilanases e demonstrou que ferramentas estatísticas (CCD e CCRD) são necessárias para avaliar o comportamento da enzima em diferentes condições. Os resultados demonstraram que utilização de triptona como fonte de nitrogênio inibiu fortemente a atividade das celulases, enquanto aumentou das xilanases. Além disso, a suplementação com CuSO4 aumentou a atividade de todas as enzimas. Sugere-se que influência dos componentens do meio de culturam devem ser considerados ao fazer um planjamento de coquetel enzimático de fungo. O segundo trabalho avaliou os parâmetros termodinâmicos de uma xilanase pura de baixa massa molecular (22 kDa) de A. tamarii ativa em ácido ferúlico. Após análise de molecular docking de uma xilanase de A. niger com ácido ferúlico, identificou-se que o possível sítio de ligação do ácido ferúlico é no sítio catalítico da enzima. Baseado nisso, foi feita uma avaliação dos parâmetros termodinâmicos de ligação do ácido ferúlico na xilanase de A. tamarii e demonstrou-se que há uma mudança conformacional da enzima na presença do ácido ferúlico, que influencia no encaixe do substrato no sítio catalítico, e dessa forma a enzima se torna ativa ou tolerante. Por fim, dois genes de LPMOs da família AA9 foram clonadas e expressas em Pichia pastoris da linhagem PichiaPink™. As enzimas foram expressas apenas com seus domínios catalíticos. As duas AA9, nomeadas AtAA9.1_SD e AtAA9.2_SD, foram caracterizadas em função da regioseletividade e especificidade ao substrato. AtAA9.1_SD é uma AA9 com oxidação na posição C4 que possui atividade em celulose (PASC), celopentose, xiloglucana e possivelmente xilana e liquenana. AtAA9.2_SD é uma AA9 com oxidação na posição C1/C4 e que possui atividade em celulose (PASC), xiloglucana e possivelmente xilana. Utilizando o fungo A. tamarii como objeto de estudo, mostrou-se que ele possui potencial na aplicação da degradação da biomassa por possuir enzimas com características únicas. / This thesis discusses in-deep studies from enzymes produced by Aspergillus tamari in different contexts of lignocellulose biomass degradation. The first part of this work evaluated the influence of different conditions in cellulase and xylanase activity. Statistic tools (CCD and CCRD) demonstrated their importance to evaluate the behavior of these enzymes in different conditions. The results showed that the use of tryptone as a nitrogen source inhibited cellulase activity while activated xylanase activity. Supplementation with CuSO4 increased activity of both enzymes. The influence of culture medium composition in the enzymatic activity might be considered when designing enzymatic cocktail from fungi. The second part of this work evaluated thermodynamic parameters of a pure low molecular-weight xylanase (22 kDa) from A. tamarii that was active in the presence of ferulic acid. Molecular docking of a xylanase from A. niger with ferulic acid displayed that most probably the ligand interacts with the catalytic site of the enzyme. Based on this, thermodynamic parameters of the xylanase from A. tamarii with ferulic acid were assessed. The results indicated that there was a conformational change of the enzyme in the presence of ferulic acid, and this influenced the fitting of the substrate in the catalytic site, making the enzyme active in or tolerante to the presence of ferulic acid. The last part of this work studied two AA9 LPMOs from A. tamarii. They were cloned and expressed in PichiaPink™. These two enzymes were expressed in a truncated version, with only the catalytic domain, because the vector could not express the proteins’s full length. They were named AtAA9.1_SD and AtAA9.2_SD and were characterized based on their regioselectivity and specificity to substrate. AtAA9.1_SD is a C4-oxidizer with activity in cellulose (PASC), cellopentaose, xyloglucan and probably xylan and lichenan. AtAA9.2_SD is a C1/C4-oxidizer with activity in cellulose (PASC), xyloglucan and probably xylan. This thesis showed that A. tamarii has potential in biomass degradation mainly due to its enzymes with exclusive features.

Orientador : Ricardo Antunes de Azevedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T20:45:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lugli_Juverlande_D.pdf: 4954766 bytes, checksum: b3132d4ab3c7474e41b4c3a950bffe9a (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-10-14T20:14:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseElementosModuladores.pdf: 1035006 bytes, checksum: 86c60d7f9c600a6ddcc7567806c112f3 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-10-29T18:49:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseElementosModuladores.pdf: 1035006 bytes, checksum: 86c60d7f9c600a6ddcc7567806c112f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-29T18:49:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseElementosModuladores.pdf: 1035006 bytes, checksum: 86c60d7f9c600a6ddcc7567806c112f3 (MD5) Previous issue date: 2014 / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é responsável por uma significante mortalidade e morbidade nas Américas Central e do Sul, afetando um número significativo da população mundial. A doença desenvolveu-se ao longo de décadas e a presença de mediadores inflamatórios e a hipertrofia cardíaca são características comuns. Buscando uma compreensão dos mecanismos moleculares que ocorrem no processo inflamatório e que subsidiem a caracterização de marcadores moleculares na patologia chagásica, a proteína COX-2 tornou se objeto de estudo. Sabe- se que a regulação desta proteína pode se dar a nível transcricional e/ou pós traducional, envolvendo um conjunto de fatores protéicos e incluindo a participação de miRNAs. Estudos recentes tem mostrado uma possível co-regulação indireta entre os níveis de PTEN e de COX-2, mas até o momento, os resultados preliminares ainda não elucidaram esses mecanismos. Particularmente, em relação à Doença de Chagas, poucos são os estudos que focam na elucidação do processamento do mRNAs na doença e nos fatores que co-regulam a proteína COX-2. Sendo assim, objetivou se nesse estudo analisar os moduladores do processo pró-inflamatório/ hipertrófico em células H9c2 infectadas pela cepa Berenice-62 do T.cruzi, buscando a caracterização de marcadores moleculares do processo inicial da Doença de Chagas. Para isso, os tempos de infecção de 0, 2, 6, 12, 24 e 48 horas foram estudados, logo após 2 horas de interação com o parasito. A comprovação da infectividade foi feita por ensaios de microscopia pela coloração com Giemsa e Dapi. A análise transcricional de genes correlatos ao processo inflamatório/ hipertrófico e de microRNAs foram realizados por ensaios de qRT-PCRs e as análises das proteínas COX-2, PTEN, P-PTEN foram investigadas nos ensaios de Western blots. Outros ensaios bioquímicos, como o de viabilidade celular e o de mensuração de prostaglandina E2, foram realizados. Com os resultados, conclui-se que a infecção com a cepa Be-62 diminui a viabilidade celular após 48 horas de infecção e modula os níveis de expressão dos marcadores de hipertrofia cardíaca Anf, Bnp e β –myhc, além de modular o ambiente pró-inflamatório nos intervalos iniciais de infecção, considerando-se o aumento da expressão e da atividade da proteína COX-2 e no aumento na produção de PGE2. Os resultados também demonstraram uma relação entre os genes Cox-2, Pten, Akt, sugerindo uma possível correlação cruzada entre COX-2 e PTEN. Os microRNAs-26b, -463,-1 e -21, respectivamente, indicaram uma possível regulação pós-traducional das proteínas COX-2 e PTEN, demonstrando um papel fundamental na instalação do quadro de hipertrofia. Estudos futuros poderão validar o papel dessas moléculas como marcadores moleculares e espera-se que os resultados do presente estudo possam direcionar a caracterização de moléculas que auxiliem no prognóstico e tratamento da doença de maneira direcionada, considerando-se a grande variabilidade genética das cepas do T. cruzi. ____________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is responsible for significant mortality and morbidity in Central and South America, affecting a significant number of the world population. The disease develops over decades and the presence of inflammatory mediators and cardiac hypertrophy are common features. Searching for an understanding of the molecular mechanisms that occur during the inflammatory process, and that subsidize the characterization of molecular markers in Chagas disease, COX - 2 protein became an object of study. It is known that the regulation of this protein can occur at transcriptional and/ or post- translational level, involving a number of protein factors and including the involvement of miRNAs. Recent studies have shown a possible indirect co-regulation in the levels of PTEN and COX - 2, but so far the preliminary results not yet elucidated these mechanisms. Particularly in relation to Chagas disease, there are few studies that focus on the elucidation of the processing of mRNAs in this disease and in the factors that co - regulate COX - 2 protein. Therefore, this study was aimed to analyze the hypertrophic/ proinflammatory process modulators in H9c2 cells infected with strain Berenice -62 of the Trypanosoma cruzi, searching for characterize the molecular markers of the initial process of Chagas disease. For this reason, the time of infection of 0, 2, 6, 12, 24 and 48 hours were studied soon after 2 hours from the interaction with the parasite. The proof of the infectivity was performed by microscopy assays by the staining with Giemsa and Dapi. The transcriptional analysis of genes related to the inflammatory / hypertrophic process and microRNAs were performed by qRT- PCR assays and the analyzes of COX-2, PTEN, PTEN - P proteins were explored in Western blots assays. Other biochemical assays such as cell viability and measurement of prostaglandin E2 were performed. From the results, it is concluded that infection with Be- 62 strain decreases cell viability after 48 hours of infection and modulates the levels of expression of markers of cardiac hypertrophy Anf and Bnp β - myhc, in addition to modulate the environment pro-inflammatory in the initial intervals of infections, considering the increased expression and COX -2 protein activity and in the increased production of PGE2. The results also demonstrated a relationship among cox-2, pten, akt genes suggesting a possible cross- correlation between COX-2 and PTEN. MicroRNAs-26b, - 463, -21 and -1 respectively indicate a possible posttranslational regulation of COX-2 and PTEN protein, demonstrating a crucial role in the installation of hypertrophy. Future studies could validate the role of these molecules as molecular markers and it is expected that the results of this study may direct the characterization of molecules that assist in the prognosis and treatment of disease in targeted way, considering the high genetic variability of strains of T. cruzi.