Orientador: Roberto da Silva / Banca: Maria de Lourdes T.M. Polizeli / Banca: Adalberto Pessoa Júnior / Banca: Rubens Monti / Banca: Mauricio Boscolo / Resumo: Neste trabalho as ß-glicosidases produzidas pelos microrganismos Thermoascus aurantiacus e Aureobasidium pullulans foram purificadas, caracterizadas termodinamicamente, físico-quimicamente e aplicadas em terpenos e isoflavonas. O processo de purificação da enzima do T. aurantiacus apresentou rendimento final de 63,6% e fator de purificação de 46,3 vezes. Após a purificação da enzima do A. pullulans, esta apresentou fator de purificação de 35,5 vezes e rendimento de 19%. A ß-glicosidase do T. aurantiacus apresentou atividade ótima em pH 4,5 a temperatura de 75ºC. Esta manteve-se estável na faixa de pH 4,5 a 6,5 e reteve sua atividade original após 1 hora a 70ºC. A enzima purificada do A. pullulans apresentou maior atividade catalítica nos valores de pH 4,0-4,5 a temperatura de 80ºC. A mesma foi estável em ampla faixa de pH 4,0 a 9,5, e, reteve sua atividade original após 1 hora a 75ºC. A maior termoestabilidade, da enzima produzida pelo microrganismo mesofílico, A. pullulans, foi comprovada pela análise dos parâmetros termodinâmicos. A ß-glicosidase do T. aurantiacus apresentou valores menores de t(1/2), ∆G, ∆H e Ea em todas as temperaturas analisadas. As duas enzimas foram fortemente inibidas por Hg+2 e Ag+, sugerindo que o grupo tiol (SH) é essencial para atividade das mesmas. O pNPßG foi utilizado para a determinação dos parâmetros cinéticos, os valores de Km e Vmax obtidos foram 0,53 mM e 590,8 μmol/ min/mg de proteína para a enzima do T. aurantiacus, e, 0,93 mM e 29,9 μmol/ min/mg de proteína para a enzima do A. pullulans. A presença de etanol no meio de reação ativou a ß-glicosidase do T. aurantiacus, indicando atividade glicosil transferase, o mesmo não foi observado para enzima do A. pullulans. As duas ß-glicosidases atuaram em diferentes substratos glicosídicos, inclusive sobre terpenos e isoflavonas, o que confirma a ampla especificidade das enzimas. / Abstract: In this work, ß-glucosidases produced by the microorganisms Thermoascus aurantiacus and Aureobasidium pullulans were purified, thermodynamically and physical-chemically characterized and applied on terpenes and isoflavones. Purification process of the enzyme from T. aurantiacus exhibited final yield of 63.6% and purification factor of 46.3 -fold. Purification process of the enzyme from A. pullulans resulted in 19% yield and purification factor of 35.5-fold. ßglucosidase from T. aurantiacus exhibited optimum activity at pH 4.5 and at temperature of 75ºC. It remained stable at pH range of 4.5 to 6.5 and maintained its original activity after 1 hour at 70ºC. Purified enzyme from A. pullulans exhibited a higher catalytic activity in pH values of 4.0-4.5 at an optimum temperature of 80ºC. It was stable over a wide pH range, from 4.0 to 9.5, and, maintained its original activity after 1 hour at 75ºC. The higher thermal stability of the enzyme produced by the mesophilic microorganism, A. pullulans, was confirmed by analysis of the thermodynamic parameters. ß-glucosidase from T. aurantiacus exhibited lower values for t(1/2), ∆G, ∆H and Ea in all temperatures tested. Both enzymes were strongly inhibited by Hg+2 and Ag+, suggesting that a thiol group (SH) is essential for their activities. pNPßG was used for the kinetic parameters determination and the values for Km and Vmax were 0.53 mM and 590.8 μmol/ min/mg of protein for the enzyme from T. aurantiacus, and, 0.93 mM and 29.9 μmol/ min/mg of protein for the enzyme from A. pullulans. The presence of ethanol in the reaction mixture activated the ß-glucosidase from T. aurantiacus, indicating glucosil transferase activity, which was not observed for the enzyme from A. pullulans. Both ß-glucosidases exhibited activity on different glucosidic substrates, including terpenes and isoflavones, confirming the broad specificity of the enzymes. / Doutor

Orientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: João Atilio Jorge / Banca: Rosa dos Prazeres Melo Furriel / Resumo: As lipases (triacilglicerol acil hidrolases, E.C. 3.1.1.3) catalisam a hidrólise das ligações éster de triacigliceróis, operando na interface água/óleo. Estas são enzimas ubíquas, porém as de origem microbiana têm se destacado no cenário industrial atual devido ao seu amplo espectro de aplicação. Dessa maneira, a prospecção de novas fontes de lipases com propriedades distintas é uma linha de pesquisa importante. Dentre os micro-organismos, os fungos vêm sendo explorados para a produção de enzimas por secretarem grandes quantidades de proteínas no meio extracelular que não são nocivas à saúde humana, em sua grande maioria. Este trabalho se insere neste contexto, uma vez que visa purificar e caracterizar as principais propriedades bioquímicas da lipase produzida pelo fungo filamentoso Penicillium sect. Gracilenta CBMAI 1583, isolado de solo de Mata Atlântica e ainda não estudado em relação a essa enzima. O pH e a temperatura ótimos de atividade lipásica foram 4,0 e 70 °C, respectivamente, tanto para a enzima presente no filtrado de cultura quanto para a enzima purificada. As energias de ativação da reação de hidrólise do p-nitrofenil palmitato catalisada pela lipase presente no filtrado de cultura e pela lipase purificada foram 27,01 e 8,77 kJ.mol-1, respectivamente. A enzima do filtrado se mostrou mais estável em relação à temperatura (T(1/2) de 1,5 h, 6,3 e 2,3 min a 50, 60 e 70 °C, respectivamente) e menos estável em relação ao pH (estável apenas entre os pH 5,0 e 7,0) que a enzima purificada. A enzima purificada apresentou T(1/2) de 8,5 min, 33,6 e 15,4 s nas mesmas temperaturas e estabilidade em pH de 2,0 a 8,5. Em relação à estabilidade na presença de surfactantes, os detergentes aniônicos desestabilizaram a estrutura proteica, com consequente perda de atividade, enquanto detergentes não iônicos a 1 % (m/v) ativaram a enzima. A lipase foi purificada em uma única etapa, através de... / Abstract: Lipases (triacylglycerol acyl hydrolases, EC 3.1.1.3) are ubiquitous enzymes. However microbial enzymes stand out on the current industrial scenario, due to their wide spectrum of application. In this sense, prospection of new sources of lipases with distinct characteristics is an important research field. Among microorganisms, fungi are being explored for enzyme production, because they secrete high amounts of proteins to extracellular medium that are generally regarded as safe for human health. This work is inserted in this context once it aims to purify and to characterize the main biochemical properties of lipase produced by the filamentous fungus Penicillium sect Gracilenta CBMAI 1583, isolated from soil under Atlantic Rainforest and yet not studied in respect to this enzyme. Optima pH and temperature of activity were 4.0 and 70 °C, respectively, for both crude and purified lipase. Activation energys of hydrolysis of pNPP catalyzed by crude and purified lipase were 27.01 and 8.77 KJ.mol-1, respectively. Crude lipase was more stable to temperature (T(1/2) of 1.5 h, 6.3 and 2.3 min at 50, 60 and 70 °C, respectively) and less stable to pH (stable only at pH 5.0 to 7.0), while purified lipase showed the opposite behavior (T(1/2) of 8.5 min, 33.6 and 15.4 s at the same temperatures; and stable at pH 2.0 to 8.5). Regarding the stability in presence of surfactants, anionic detergents destabilized the protein structure with consequent loss of activity, while nonionic detergents at 1 % (w/v) activated the enzyme. Lipase was purified to homogeneity by one step, through a hydrophobic interaction chromatography at low ionic strength using the Phenyl Sepharose resin, as revealed by SDS-PAGE. By this strategy it was possible to recover 80.8 % of initial activity and achieve a purification factor of 516.1. Enzyme molecular mass was estimated to be 52.9 kDa by SDS-PAGE and 85.3 kDa by size exclusion chromatography, suggesting the formation of ... / Mestre

Orientador: Hiroshi Aoyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T14:51:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_MariaAngelica_M.pdf: 9143256 bytes, checksum: aa14d687161f89068c82024fdc8fdc9c (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Quatro isoformas APl, AP2Al, AP2A2 e AP2B da fosfatase ácida (E.C. 3.1.3.2.) de fígado de cação (Rhizoprionodon lalandei) foram detectadas e parcialmente purificadas através de bath em Hidroxiapatita, cromatografias em colunas de SP-Sephadex, DEAE-Sephadex, Sephacryl S200 e Concanavalina A-Sepharose 4B. As isoformas AP2Al, AP2A2 e AP2B foram parcialmente purificadas cerca de 68_ 57 e 34 vezes, com atividades específicas de 5,6_ 4,7 e 2,8 !lmol min-l . mg-l respectivamente. Neste estágio de purificação, estas isoformas mostraram-se altamente instáveis. A isoforma APl foi parcialmente purificada cerca 20 vezes, com atividade específica de 1,66 !lmol min-1. mg-l. A massa molecular relativa da isoforma APl, determinada por HPLC da Shimadzu (coluna Shim pack diol 150), foi de 58 kDa. Esta isoforma mostrou-se mais estável que as isoformas AP2. As propriedades cinéticas da fração APl foram estudadas. A enzima apresentou alta atividade em pH 4,7 - 5,0_ a temperatura ótima obtida foi de 65°C. A hidrólise a 37°C e pH 5,0 foi linear até 45 minutos e a energia de ativação para a hidrólise do pNPP, determinada pela equação de Arrhenius, foi de 39,37 kJ.mor1. Um valor da Km de 0,97 mM foi obtido utilizando-se pnitrofenilfosfato como substrato. Dentre os substratos testados, a isoforma API apresentou maior especificidade pelo PPi. Utilizando-se pNPP como substrato vários compostos foram testados como potenciais inibidores. Molibdato (O,lmM) e NaF (5mM) inibiram 100%, pCMB (lmM) e NaF (1mM) inibiram cerca de 80%, o-vanadato (0,1 mM) e tartarato (5mM) , cerca de 500/0. Baseado no estudo de inibidores a isoforma APl da fosfatase ácida de cação apresenta características mais similares as fosfatases ácidas de Imamíferos de alta massa molecular / Abstract: Four isoforms API, AP2AI, AP2A2 and AP2B of acid phosphatase (E.C. 3.1.3.2.) were detected and partially purified from shark (Rhizoprionodon Ia/andei) liver through bath Hydroxyapatite, cromatography columns of SP-Sephadex, DEAE-Sephadex, Sephacryl S-200 and Concanavalin A-Sepharose 4B.The fractions AP2AI, AP2A2 and AP2B were purified 68.3; 57.3 and 34.2-fold, with specific activities of 5.6; 4.7 and 2.8 Jlmol min-1.mg-l respectively. The fraction APl was partially purified 20-fold, with specific activity of 1,66 Jlmol min-1.mg-l. The relative molecular mass ofthis fraction, determined by HPLC (Shim pack diol 150 column), was 58 kDa. At this stage of purification the fraction APl has shown to be more stable than the isoforms AP2. The kinetic properties of the API fraction were determined using pnitrophenyl phosphate (pNPP) as substrate. High activities were observed at pH around 4.7 - 5.0, and temperature of 65° C, at temperature of 37°C, pH 5.0 the hidrolysis was linear up to 45 minutes. The activation energy value of 39,37 kJ.mor1 for the hidrólysis ofpNPP, was calculated from the Arrhenius equation. An apparent Km value of 0.97 mM was determined for pNPP. From the substrates tested, inorganic pyrophosphate was the best substrate, whit a 5-fold lower Km and 2-fold higher specificity constant, when compared with pNPP. Several compounds were tested as potential inhibitors, with pNPP as substrate. Molybdate (O.lmM) and fluoride (5mM) inhibited 100%; p-CMB (lmM) and NaF (ImM) inhibited about 80%, and o-vanadate (0.1 mM) and tartrate (5mM), about 50%. Based on inhibitors studies the API isoform of acid phosphatase purified from shark liver presents more similar characteristics the fosfatases acid of mammals of high molecular mass / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores : Everson Alves Miranda, Gustavo Paim Valença / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-02T16:31:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HaberPerez_Victor_D.pdf: 3235735 bytes, checksum: c84db1347546f8cb4db20cc0b7e2df85 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A conversão enzimática de substratos gasosos constitui um avanço recente na engenharia de bioprocessos. Estes sistemas apresentam importantes vantagens quando comparados com os sistemas líquidos (aquosos ou em fase orgânica), as quais incluem condições de transferência de massa mais favoráveis, possibilidade de reciclo do biocatalisador e uma recuperação mais simples dos produtos, entre outras. Algumas das aplicações potencias da biocatálise em fase gasosa incluem a destoxificação de correntes gasosas, o desenvolvimento de biossensores e a síntese de diversos produtos orgânicos incluindo fármacos, fragrâncias e aromas para a indústria de cosméticos e de alimentos. Este trabalho apresenta, os resultados experimentais do estudo cinético da reação de esterificação e hidrólise de acetato de etila em fase gasosa catalisada por dois biocatalisadores: a) Lipase PS (Amano, Japão) imobilizada em suportes de óxidos puros e mistos de Si/Mg com tamanhos de poros controlados e b) Lipozyme IM (Novo Nordisk, Dinamarca). O sistema experimental, operando continuamente em regime diferencial, é constituído por três blocos: 1) bloco de preparação dos substratos, onde é usado He como gás de arraste que gera correntes gasosas em equilíbrio com as fases líquidas; 2) bloco de reação, formado por um reator tubular de vidro; e 3) bloco de aquisição de dados, constituído por um cromatógrafo a gás e um computador, conectados em linha. Variações na quantidade de biocatalisador não mostraram a existência de limitações por transferência de massa para as mesmas condições de reação. Desta forma, a cinética da reação foi estudada em função da concentração de acetato de etila e do teor de água no sistema, mantendose constante a temperatura de reação a 45°C, sendo que o teor de água no sistema mostrou ser um parâmetro importante no processo, conforme relatado na literatura. Foi proposto um mecanismo de reação, cuja equação da taxa avaliada em função da temperatura, para este sistema Bi-Bi, permitiu estimar a energia de ativação como sendo 24,8 kJ/kmol. A ordem de reação global caracterizada como de primeira ordem mostrou uma dependência de primeira ordem em relação às concentrações dos substratos. Finalmente, são discutidos os resultados do efeito do comprimento das cadeias do substrato sobre o desempenho da reação a partir da hidrólise do acetato de etila e butila / Abstract: Enzymes supported in a solid phase catalyzing reactions with substrates and products in gaseous phase constitute a recent progress in the biotechnology. It has technological applications that include: toxic gas remediation, biosensors and synthesis of pharmaceutical, fragrances and aromas for the food industry and cosmetics. This work presents, the experimental results of the kinetic study of the esterification and hydrolysis reactions of ethyl acetate in gaseous phase catalyzed by two biocatalysts: the) Lipase PS (Amano, Japan) immobilized in supports of pure and mixed oxides of Si/Mg with controlled pore and b) Lipozyme 1M (Novo Nordisk, Denmark). The experimental system is formed by three blocks: the first is responsible for the preparation of the substrates in gaseous phase, considering that a carrier gas, after bubbling in a substrate, is in equilibrium with the liquid phase, and so the partial pressure of the substrate in the gas leaving the saturation flask is equal to the vapor pressure corresponding to the bubble point pressure above the pure compound. The second is the reaction block and the last block is formed by the gas chromatography and acquisition of data systems on-line connected. Variations in the amount of biocatalyst did not show the existence of limitations for mass transfer for the same reaction conditions. This way, the reaction kinetics was studied as a function of the ethyl acetate and water concentration with a constant reaction temperature of the 45°C. The water showed to be an important parameter in the process, as reported in the literature. A reaction mechanism Bi-Bi was proposed. The activation energy as being 24,8 kJ/kmol was calculated. The order of global reaction (determined as 1) showed a dependence of first order in relation to the substrate concentrations. Finally, the results of the effect of the length of the chains of the substrate in the hydrolysis reactions of the ethyl and butyl acetate are discussed. / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

De los 120 microorganismos aislados de suelos de cítricos de la localidad de Huaral, se identificaron 46 cepas con capacidad de hidrólisis sobre el almidón que representan el 38.33%, existiendo un predominio de B. circulans, con 28.33%; B. Firmus, 23.91%; Faenibacillus spp. 17.39%; B. coagulns, 15.22%,; B. megaterium, 8.70%; B. alvei, 4.35%; B. Lentus, 2.17%. En la fermentación conducida en matraz agitado con caldo almidón modificado según Achi, (1992) B. megaterium MFFB-UNMSM-39 alcanza la mayor actividad de amilasa con 16.10 U/mL., a 45ºC, pH 7.5, y 150 rpm; mientras que en biorreactor de tanque agitado registra una producción de 25.38 U/mL. a 45ºC, pH 7.5, 150 rpm, y 1.5 vvm, que representa un incremento de 9.28 U/mL. (57.63%) por efecto de la aereación y agitación. En el screening al evaluar los ingredientes del sustratos almidón de yuca a 45ºC; pH 7.5; 75 rpm y 1.5 vvm, se encuentra significancia estadística con un α = 0.05, para almidón de yuca; extracto de levadura; citrato de sodio y cloruro de calcio. En la etapa de optimización ascendente, cuando los factores se incrementa en base al cloruro de calcio en 0.3 g/L, se logra incrementar la producción de amilasa y se acorta el periodo de latencia. En la etapa de optimización final se ha encontrado los valores óptimos de los factores; almidón de yuca (X1 = 25.41 g) y cloruro de calcio (X2 = 2.87 g), estos valores corresponden a la cima de la superficie respuesta descrita por el modelo matemático estimado. La enzima amilasa en biorreactor de tanque agitado con caldo almidón almidón de yuca tanto en la fase del screening, optimización ascendente, y optimización final, fueron de 27.40 U/mL; 32.84 U/mL; 33.22 U/mL respectivamente, y la aparición de la producción de amilasa se observó a las 20 horas hacia finales de la fase logarítmica, incrementándose rápidamente de las 28 a las 40 horas y de las 28 a las 36 horas en la fase estacionaria, alcanzando la máxima producción a las 60 horas, para el Screening y optimización ascendente; sin embargo en la optimización final, la enzima hace su aparición a las 16 horas hacia finales de la fase logarítmica, incrementándose aceleradamente de las 24 a las 36 horas para alcanzar su máxima producción a las 60 horas en la fase estacionaria. / Of the 120 isolated microorganisms of floors of citric of the town of Huaral, 46 stumps were identified with hidrólisis capacity on the starch that they represent 38.33%, existing a prevalence of B. circulans, with 28.33%; B. Firmus, 23.91%; Faenibacillus spp. 17.39%; B. coagulns, 15.22%,; B. megaterium, 8.70%; B. alvei, 4.35%; B. Lentus, 2.17%. In the fermentation driven in upset flask with broth starch modified according to Achi, (1992) B. megaterium MFFB-UNMSM-39 reaches the biggest amylase activity with 16.55 U/mL., at 45ºC, pH 7.5, and 150 rpm; while in biorreactor of upset tank it registers a production of amylase with 25.38 U/mL., at 45ºC, pH 7.5, and 150 rpm; that represents an increment of 57.82% for effect of the aereación and agitation. In the screening when evaluating the ingredients of the substrates cassaava starch to 45ºC; pH 7.5; 75 rpm and 1.5 vvm, It meets statistical significance with α = 0.05, for cassava starch; yeast extract; sodium of citrate and chloride of calcium. In the stage of upward optimization, when the chloride of calcium is increased in 0.3 g/L, the amylase production is increased in 1% and shortens the period of latency. In the stage of final optimization has been the good values of those factors; yucca starch (X1 = 25.41 g) and chloride of calcium (X2 = 2.87 g), these values correspond to the summit of the surface answer described by the dear mathematical pattern. The enzyme amylase in biorreactor upset tank with broth starch so much of the screening, upward optimization, and final optimization, the maximum productions of the amylase enzyme were of 27.40 U/mL; 32.84 U/mL; 33.22 U/mL respectively, and the appearance of the amylase production was observed at the 20 hours toward final of the logarithmic phase, increased fasted at the 28 at 40 hours and 28 at 36 hours reaching the maximum production at the 60 hours in the stationary phase for screening and upward optimization; however in the final optimization the enzyme appears at the 16 hours toward final of the logarithmic phase, increased fasted at the 24 at 36 hours for to reach the maximum production at the 60 hours in the stationary phase.

Mundialmente los residuos lignocelulósicos constituyen el recurso renovable más importante que existen y está compuesto en su mayor parte por celulosa la que es degradada principalmente por hongos. En el Perú se conoce poco acerca del potencial celulolítico de las cepas fúngicas nativas en las distintas regiones de nuestro país. Este trabajo tuvo como objetivo seleccionar cepas fúngicas productoras de celulasas de los mantenidos en el cepario del laboratorio de micología aplicada, identificarlas morfológicamente y evaluar su actividad enzimática. Se evaluaron 289 cepas semicuantitativamente mediante la técnica de difusión radial en agar czapeck Na-CMC y cuantitativamente por el método de Somogy Nelson. Se seleccionaron cinco cepas: tres del genero Paecilomyces sp (SA – 726; SA - 668; SA – 651), una de Fusarium sp (SA - 683) y una de Aspergillus sp HN – 566), los que presentaron áreas de hidrólisis de 14.9; 12.5, 12.0, 14.4 y 12.7 x 10² mm² respectivamente. La actividad enzimática de las cepas seleccionadas mostró los siguientes valores: 0.048, 0.042, 0.042, 0.080 y 0.048 UI/mL respectivamente. Los resultados muestran que existen cepas nativas en las zonas de Satipo y Huancayo con buena actividad enzimática, las cuales tienen un alto potencial para la producción o la investigación. Palabras claves: Celulasas, Czapeck, difusión radial, Somogy Nelson, actividad enzimática. / --- Lignocellulosic residues are the largest renewable resource that exists in the world, for the most part composed of cellulose and is degraded mainly by fungi. In the Peru, little is known about the cellulolytic potential of native fungal strains in the different regions of our country. The objective of this work was to make a selection of cellulolytic fungal strains, identify them morphologically, and evaluate their enzymatic activity. Two hundred and eightynine strains were reactivated and evaluate semi quantitatively and qualitatively by the radial diffusion technique in czapeck agar Na-CMC and Nelson-Somogy method respectively. Five strains were selected: from sort Paecilomyces sp (SA-726; SA-668; SA-651) a Fusarium sp (SA-683) and an Aspergillus sp (HN-566), with hydrolysis of 14.9; 12.5; 12.0; 14.4 and 12.7 x 10² mM². Enzyme activity was evaluated revealing the following values: 0.048, 0.042, 0.080, and 0.048 UI/mL, respectively. Results show that exist native strains with good enzymatic activity which have high potential for production and investigation.

Doctor en Bioquímica / La riboquinasa humana (RK) (E.C. 2.7.15) pertenece a la superfamilia riboquinasa y cataliza la fosforilación de la D-ribosa usando MgATP como cosustrato, produciendo D-ribosa-5-P y ADP. Aunque la D-ribosa participa en importantes etapas metabólicas, los estudios cinéticos en la RK humana son escasos y preliminares. Alineamientos de secuencia por superposición estructural entre varios miembros de la superfamilia, han mostrado que existen dos motivos de secuencia muy conservados, el motivo NXXE y el motivo GXGD, que se encuentran en el sitio activo de las estructuras de los miembros de la superfamilia. Los residuos Asn y Glu del motivo NXXE estarían relacionados con la unión y uso apropiado de los iones Mg+2 y PO4-3, mientras que el residuo Asp del motivo GXGD actuaría como la base catalítica, que desprotonaría el hidroxilo del sustrato que va a ser fosforilado. En este trabajo determinamos el efecto del K2HPO4 sobre la actividad enzimática, y caracterizamos cinéticamente a la RK humana. A través de mutagénesis sitio dirigida evaluamos el papel de los residuos Asn199, Glu202 y Asp269, en la catálisis y en la unión y regulación por PO4-3 y Mg+2. Los resultados muestran que la RK humana posee una regulación compleja, en la que tanto el PO4-3 como el Mg+2 actúan como activadores, mientras que ambos sustratos y el Mn+2 libre actúan como inhibidores. La caracterización cinética de las mutantes de los motivos NXXE y GXGD muestran que las mutantes N199L y E202L muestran un descenso dramático en la kcat y un aumento de entre 50-70 veces el valor de la KM para MgATP, mientras que la mutante D269N tiene una kcat cerca de 55 veces menor que la enzima silvestre, sin cambios en los valores de KM para ambos sustratos. Sorpresivamente, ninguna de las mutantes es activada por K2HPO4 y todas requieren de una concentración de Mg+2 libre mucho mayor que la requerida por la enzima silvestre, para obtener la actividad máxima. En base al análisis de la estructuras cristalográficas de RK de E. coli (PDBID: 1RKD) y RK de H. sapiens (PDBID: 2FV7) se ha visto que la RK humana uniría al PO4-3 y al Mg+2 dentro del sitio activo, y que esta unión estaría mediada por moléculas de aguas estructurales conservadas que permitirían la formación de puentes de hidrógeno entre el PO4-3 y el Mg+2 y los residuos conservados Asn 199 y Glu202 que se ubican dentro del sitio activo de la enzima, y que forman parte del motivo NXXE. Además, estos residuos participarían en la unión de ATP al sitio activo. Por último, usando el método de acoplamiento molecular del PO4-3 fue posible inferir que el PO4-3 regulador se uniría dentro del sitio activo de la RK humana. Estos resultados demuestran que los residuos Asn199 y Glu202 juegan un rol importante en la catálisis y en la regulación por PO4-3 and Mg+2 y que aunque se ha señalado que el residuo Asp sería la base catalítica para mucho miembros de la familia riboquinasa, su rol en la RK humana no es concluyente / Ribokinase (RK) (E.C. 2.7.15) belongs to the ribokinase superfamily and catalyzes the phosphorylation of the D-ribose using MgATP as cosubstrate, producing D-ribose-5-P and ADP. Even though D-ribose acts in important metabolic steps, kinetic studies of human RK are scarce and preliminary. Structural based sequence alignments of several members of this superfamily have shown two conserved sequence motifs, the NXXE and GXGD motifs, localized at the active site of its members. It has been suggested that the Asn and Glu residues from the NXXE motif are related with Mg2+ and PO43- proper use and binding, while the Asp residue from the GXGD is proposed to act like the catalytic base withdrawing a proton in the substrate to be phophorylated. In this work we have studied the effect exerted by K2HPO4 on human RK activity, and we performed a kinetic characterization of this enzyme. Also, using site-directed mutagenesis we evaluate the role of residues Asn199, Glu202 and Asp269, in catalysis, phosphate and magnesium regulation and binding, The results shown a complex interplay of regulators of RK activity where phosphate and K+ act as activators while both substrates and free Mn2+ acts as inhibitors. Kinetic characterization of mutants of the conserved NXXE and GXGD motifs shows that N199L and E202L enzymes display a dramatic decrease in the kcat value and an increase between 50-70 times in the KM for MgATP, whereas the D269N mutant display a kcat value around 55 times lower than the wild type with almost none changes in the KM values for both substrates. Interestingly, all the mutants lack the activating effect of phosphate and require higher free Mg2+ concentrations than the wild type enzyme to obtain maximal activity. Additionally, molecular docking assays have shown that probably the regulatory PO43- binds inside the active site in human RK. Analysis of the crystallographic structures of E. coli RK (PDBid: 1RKD) and H. sapiens RK (PDBid: 2FV7) shows that PO43- and Mg2+ bind at the active site of human RK, and that several conserved water molecules facilitate interactions between PO43- and Mg2+ and the conserved residues Asn199 and Glu202 trough H bonding. In addition, these residues participate in the ATP binding in human RK active site. These results demonstrated that residues Asn199 and Glu202 play an important role in catalysis and PO43- and Mg2+ regulation and although the conserved Asp residue has been pointed out as the catalytic base in many members of the ribokinase family its role in human ribokinase is not fully understood / FONDECYT

No presente trabalho foram avaliados os aspectos biológicos básicos e as atividades lignocelulósicas de fungos isolados a partir de indústrias de celulose. Para o isolamento foi descrito um método seletivo, obtendo um total de 115 isolados, dos quais 12 foram selecionados quanto a produção de celulase. Todos os isolados selecionados apresentavam atividades β-glicosidase (Salicinase), Exoglucanase (Avicelase) e Endoglucanase (CMCase) semelhantes à linhagem QM9414 de T. reesei. Quanto a atividade ligninolítica foi estabelecido um método preliminar identificando as linhagens de Aspergillus fumigatus e Fusarium solani, como capazes de degradar lignina. Os isolados selecionados foram classificados e caracterizados biologicamente envolvendo observações citológicas e avaliação do desenvolvimento, estabelecendo o período e as condições adequadas para o cultivo. Entre as linhagens analisadas somente Trichoderma pseudokoningii e Fusarium solani apresentaram conídios uninucleados. A avaliação do crescimento e esporulação das linhagens selecionadas em diferentes meios de cultivo demonstrou que o pH é um fator limitante em meio contendo celulose como fonte de carbono e que todas as linhagens selecionadas podem ser utilizadas para se obter mutações auxotróficas, uma vez que se desenvolvem bem em meio mínimo. Os padrões eletroforéticos para α e β esterase das linhagens selecionadas apresentaram diferentes perfis de bandas, permitindo correlacioná-los com as características morfológicas dos esporos das linhagens e serem utilizados como um dos parâmetros auxiliares na classificação dos fungos isolados. Entre as linhagens selecionadas, a Fusarium solani foi considerada a melhor quanto a produção de enzimas lignocelulolíticas e se mostrou promissora para estudos genéticos e de melhoramento, uma vez que esta linhagem apresenta conídios brancos e uninucleados, facilidade na obtenção de mutantes morfológicos com luz ultra-violeta e crescimento em meio mínimo. / This work was carried out aiming to eva1uate the basic bio1ogica1 aspects and the 1ignocellulolytic activities in fungi isolated from cellulose industries. It was described a selective isolation method and from a total of 115 isolates, 12 of them were selected according to their cellu1ase production. All the selected isolates showed β-glicosidade (salicinase), exog1ucanase (avicelase) and endoglucanase (CMCase) activities similar to Trichoderma reesei QM94l4 strain. A preliminary method was stablished for testing ligninolytic activity and according to it, strains of Aspergillus fumigatus and Fusarium solani are invo1ved in the degradation of lignin. The selected isolates were classified and bio1ogically characterized according to cytologica1 observations and their deve1opment eva1uation leading to stablish the best cultivation conditions. Among the ana1ysed strains only Trichoderma pseudokoningii and Fusarium solani showed 100% uninucleated conidia. The evaluation of growing and sporulation of the selected strains ln different culture media showed that pH is the limiting factor in a medium containing cellulose as the sole carbon source. All the selected strains grow well in minimal medium and can be used to get auxotrophic mutants. The α and βesterase electrophoretic patterns of the selected strains were shown to have different band profiles and it allows to correlate them with the spore morphological characteristics, and to be used as one of the useful parameters in classifying the isolated fungi. Among the selected strains, Fusarium solani was considered to be the best lignocellulolytic enzymes producer and it might be very useful for further genetics and breeding studies since it has uninucleated white conidia, it is easy to induce UV morphological mutants and it grows very well in minimal medium.

Coenzimas piridínicos desempenham papel fundamental relacionado à suas propriedades de óxido-redução. Assim, participam da cadeia respiratória, onde se situam, devido ao valor do potencial de óxido-redução do par, logo no início, sendo os primeiros intermediários entre certos substratos e oxigênio. Constituem-se também no primeiro local de síntese de ATP; muito importante, presumivelmente em conexão com a função respiratória, é de fato de os coenzimas piridínicos intervirem nos sistemas de algumas transhidrogenases. / Not available

A doença periodontal inflamatória envolve mecanismos imunopatológicos e inflamatórios contra microrganismos da placa dentobacteriana, sendo que diversas células, tanto residentes quanto inflamatórias, e mediadores químicos participam ativamente da resposta do hospedeiro. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o modelo experimental da doença periodontal inflamatória induzida por ligadura em ratos, com ênfase na avaliação clínica e microscópica, bem como no estudo quantitativo dos mastócitos e da presença de RNA mensageiro (RNAm) codificador das enzimas óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e metaloproteinases (MMPs) -2 e –9. Para este fim, as amostras correspondentes foram obtidas em diferentes períodos de indução da doença periodontal inflamatória experimentalmente induzida (1, 3, 7, 14, 28, 42 e 56 dias ou 1, 3, 7, 14 e 30 dias) e avaliadas microscopicamente por meio das colorações de hematoxilina-eosina e azul de toluidina, bem como semi-quantitativamente por meio de Reação em Cadeia da Polimerase precedida por Transcrição Reversa (RT-PCR). Para fins comparativos, foram utilizadas amostras de tecido gengival normal do mesmo animal. Microscopicamente, observou-se exuberante presença de polimorfonucleares (PMNs) nos tecidos afetados pela doença periodontal inflamatória, especialmente nos períodos inicias. Detectou-se ainda a expressão aumentada de RNAm para MMP-9 apenas nos tecidos afetados pela doença periodontal nos períodos de 3 e 7 dias, porém não se observou aumento estatisticamente significativo na expressão de RNAm para MMP-2 em nenhuma das comparações analisadas. Com relação à iNOS, a expressão de seu RNAm foi maior nos tecidos doentes quando comparados com os tecidos gengivais controle no período de 3 dias, assim como nos tecidos afetados pela doença periodontal no período de 3 dias ao se comparar com os tecidos doentes aos 7 dias após a indução. Ainda, o número de mastócitos/mm2 na região adjacente aos epitélios sulcular e juncional, bem como na área de inserção conjuntiva, apresentou-se diminuído na doença periodontal inflamatória experimentalmente induzida em ratos, com relação aos tecidos gengivais saudáveis, tanto no lado vestibular quanto no lingual. Nossos resultados sugerem que a doença periodontal experimentalmente induzida em ratos caracteriza-se por lesões inflamatórias com predomínio de células PMNs e áreas de reabsorção óssea alveolar desde as primeiras 24 horas após a indução, porém sem progressão para um infiltrado inflamatório linfoplasmocitário organizado focalmente que caracteriza a doença humana. Provavelmente, a MMP-9 e o óxido nítrico (NO) têm participação na evolução e patogênese da doença periodontal experimentalmente induzida por ligadura, incluindo destruição tecidual e perda óssea alveolar. De forma contrária, os mastócitos parecem ter limitada participação na referida doença, não constituindo, provavelmente, fonte significativa da iNOS e da MMP-9. / Inflammatory periodontal disease envolves imunopathological and inflammatory mechanisms against bacterial dental plaque, including the participation of host resident as well as inflammatory cells and chemical mediators. The present work characterized a ligature-induced model of experimental inflammatory periodontal disease, emphasysing clinical and microscopic valuation as well as quantitative study of the number of mast cells and the presence of expression of mesanger RNA (mRNA) of inducible nitric oxide (iNOS) and metalloproteinases (MMPs) -2 and -9. Samples were obtained from different periods and microscopically analysed trough hematoxylin-eonin and toluidin blue stainings, and quantitatively estimated through Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction (RT-PCR). The results revealed the presence of numerous polymorphonuclear (PMN) cells on tissues affected by inflammatory periodontal disease, mainly on initial periods. Significant expression of MMP-9 was still detected on tissues affected by inflammatory periodontal disease on day 3 and 7, with no significant difference on the expression of MMP-2. iNOs expression was also higher on diseased tissues compared to controls on day 3 and between days 3 and 7 diseased tissues themselves. Mast cells numbers were reduced on the dentogengival area of diseased tissues compared to controle ones, on buccal and ligual sides. Our results suggest that experimentally induced inflammatory periodontal disease are characterized by inflammatory lesions with the predominance of PMNs and bone resorption areas since the first day of induction, although without a progression to a lymphocyte / plasma cells inflammatory infiltrate characteristic of human disease. Probably, MMP-9 and iNOS participate on the evolution and pathogenesis of ligature-induced periodontal disease, including tissue destruction and alveolar bone resorption. On the other hand, mast cells seem no to be a significant source of iNOS and MMP-9.