A PEGlação é uma bem sucedida estratégia nano-biotecnológica que envolve a ligação covalente do polietilenoglicol (PEG) a uma droga para melhorar sua farmacocinética, farmacodinâmica e perfil imunológico, e portanto, aumentar seu efeito terapêutico. Atualmente, a PEGlação é usada para modificar proteínas, peptídeos, oligonucleotídeos e fragmentos de anticorpos. A Uricase (EC 1.7.3.3, UC) é uma enzima pertencente à classe das oxidorredutases, responsável pela oxidação do ácido úrico, produzindo alantoína. Essa enzima é encontrada em muitos organismos vivos como: bactérias, leveduras, fungos, vegetais e animais. Entretanto, durante a evolução das espécies o gene da UC tornou-se inativo, por isso, em humanos a UC é inativa. Nesse sentido, a UC adquiriu destaque como um potencial fármaco uricolítico, devido à necessidade do desenvolvimento de novos agentes terapêuticos no tratamento de hiperuricemia e gota. Neste estudo, a uricase recombinante purificada de Candida sp (UC-r) e a de rim bovino (UC-b) foram modificadas por PEGlação com mPEG-p-nitrofenil carbonato (mPEG-pNP) e 2-O-mPEG-4,6-dicloro-s-triazina (mPEG-CN), produzindo conjugados com considerável atividade enzimática residual UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) e UC-b-mPEG-pNP (75%), UC-b-mPEG-CN (50%).Além disso, os conjugados obtidos com a UC-r e UC-b apresentaram valores de KM menores do que as enzimas nativas, indicando que a PEGlação conferiu uma interessante propriedade aos conjugados, que permitiu um aumento da afinidade da UC-r e UC-b pelo ácido úrico. O efeito do pH e da temperatura sobre a UC-r e UC-b modificadas indicou que os conjugados obtidos foram mais ativos em pH próximo ao fisiológico e mais estáveis do que a respectiva enzima nativa. As formas PEGladas da UC-r e UC-b foram mais resistentes à ação de diferentes proteases e mantiveram-se estáveis em soro humano, indicando que a PEGlação favoreceu a resistência a degradação proteolítica. Análises espectroscópicas de dicroísmo circular (CD) e infravermelho (FTIR) não apresentaram nenhuma diferença relevante entre a estrutura protéica da UC-r nativa e PEGlada. Estudos in vivo com coelho e camundongos Balb/c mostraram que a UC-r nativa induziu uma intensa resposta imune sendo altamente imunogênica. Por outro lado, a UC-r PEGlada quando injetada cronicamente em camundongos não induziu qualquer resposta detectável de anticorpos. Esses resultados indicam uma suficiente redução da imunogenicidade dessa enzima, devido à conjugação do mPEG-pNP ou mPEG-CN, tornando-a adequada para um possível uso terapêutico. Portanto, nesse trabalho, os resultados obtidos com a UC-r de Candida sp, mostram que dois conjugados apresentaram interessantes propriedades físico-química, biológicas e imunológicas, que permitiram um significativo avanço na transformação de uma enzima de origem fúngica em uma droga, com uma possível aplicação terapêutica no tratamento de hiperuricemia e gota. / PEGylation is a successful nanobiotechnology strategy that involves the covalent attachment of polyethylene glycol (PEG) to a drug to improve its pharmacokinetic, pharmacodynamic, and immunological profiles, and thus, enhance its therapeutic effect. Currently, PEGylation is used to modify proteins, peptides, oligonucleotides, antibody fragments, and small organic molecules. Uricase (EC 1.7.3.3, UC) is an enzyme belonging to the class of oxidorreductases responsible for the oxidation of uric acid, producing allantoin. This enzyme is found in many living organisms such as bacteria, yeasts, fungi, plants and animals. However, during the evolution of the species gene became inactive UC, therefore, in humans UC is inactive. Accordingly, UC has acquired prominence as a potential drug uricolytic due to the need of developing new therapeutic agents for the treatment of hyperuricemia and gout. In this study, purified recombinant uricase from Candida sp (UC-r) and ox kidney (UC-b) were modified by PEGylation with mPEG-p-nitrophenyl-carbonate (mPEG-pNP) and 2-O-mPEG-4,6-dichloro-s-triazine (mPEG-CN), producing conjugates with considerable residual enzyme activity UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) and UC-b-mPEG-pNP (75%),UC-b-mPEG-CN (50%). In addition, conjugates obtained with the UC-r and UC-b had lower KM values than native enzymes, indicating that the PEGylation gave an interesting property the conjugate that increased the affinity of UC-r and UC-b by uric acid. The effect of pH and temperature on the modified UC-r and UC-b indicated that the conjugates were more active at pH close to the physiological and more stable than its native enzyme. PEGylated forms of UC-r and UC-b were more resistant to the action of different proteases and remained stable in human serum, indicating that the PEGylation favored resistance to proteolytic degradation. Spectroscopic analysis of circular dichroism (CD) and infrared (FTIR) did not show any relevant difference in protein structure between native and PEGylated UC-r. In vivo studies with rabbit and Balb/c mice showed that UC-r native elicited an intense immune response being highly immunogenic. On the other hand, the PEGlated UC-r when chronically injected into mice did not induce any detectable response to antibodies. These results indicate a sufficient reduction of immunogenicity of this enzyme, due to conjugation of mPEG-pNP or mPEG-CN, making it suitable for possible therapeutic use. Therefore, the results obtained with the UC-r of Candida sp, showed that two conjugates have interesting physical-chemical, biological and immunological, which allowed a significant advance in the transformation of an enzyme of fungal origin in a drug with a possible application therapeutic in the treatment of hyperuricemia and gout.

Introdução: O diabetes tipo 1 é uma doença auto-imune cuja suscetibilidade é determinada pela combinação de fatores químicos, genéticos e ambientais. Neste estudo avaliamos a resposta de ratos diabéticos frente a lesão muscular através de parâmetros bioquímicos e funcionais. Materiais e métodos: Ratos Wistar machos dos grupos lesão e lesão+diabético foram submetidos a lesão por estiramento. Cada animal foi posicionado em decúbito dorsal com o membro posterior direito firmemente preso com uma linha, que passa por uma roldana, e se prende a uma pisseta com volume de água correspondente a 150% do peso corporal do animal. Esta linha foi fixada sobre o dorso da pata, realizando uma flexão plantar, alongando o músculo tibial anterior. O animal recebeu a tração durante 40 minutos. Foram realizadas análises de extravasamento protéico, níveis de TNF-a pelo teste imunoenzimático, expressão gênica de miostatina por real time RT-PCR, índice funcional e estudo eletromiográfico. Resultados e discussão: O diabetes promove um prejuízo na resistência à fadiga muscular e na recuperação funcional, elevação na expressão gênica de miostatina e na expressão protéica de TNF-a, além de aumento do extravasamento protéico. / Introduction: Type I diabetes is a autoimmune disease where its susceptibility is determined by combination of chemical, genetic and environmental factors. In this study we evaluated the response of diabetic rats to muscle injury by biochemical and functional parameters. Materials and methods: Male Wistar rats of injury and injury+diabetes groups were submitted to stretching induced muscle injury. Each animal was positioned in dorsal decubitus with right posterior member firmly attached with a line, passing by a sheave, and attaching to a bottle with a water volume corresponding to 150% of animal body weight. The line was attached on the dorsal side of the paw, leading to a plantar flexion, and stretching the tibial anterior muscle. The animal received traction during 40 minutes. Protein extravasation, TNF-a by immune-enzimatic test, myostatin genic expression by real time PCR, functional index, and electromyographic analysis were performed. Results and discussion: Diabetes promotes a loss in resistance to muscle fatigue and in functional recovery, enhancement in myostatin genic expression and in TNF-a protein expression, besides increasing protein extravasation.

Introdução: O diabetes tipo 1 é uma doença auto-imune cuja suscetibilidade é determinada pela combinação de fatores químicos, genéticos e ambientais. Neste estudo avaliamos a resposta de ratos diabéticos frente a lesão muscular através de parâmetros bioquímicos e funcionais. Materiais e métodos: Ratos Wistar machos dos grupos lesão e lesão+diabético foram submetidos a lesão por estiramento. Cada animal foi posicionado em decúbito dorsal com o membro posterior direito firmemente preso com uma linha, que passa por uma roldana, e se prende a uma pisseta com volume de água correspondente a 150% do peso corporal do animal. Esta linha foi fixada sobre o dorso da pata, realizando uma flexão plantar, alongando o músculo tibial anterior. O animal recebeu a tração durante 40 minutos. Foram realizadas análises de extravasamento protéico, níveis de TNF-a pelo teste imunoenzimático, expressão gênica de miostatina por real time RT-PCR, índice funcional e estudo eletromiográfico. Resultados e discussão: O diabetes promove um prejuízo na resistência à fadiga muscular e na recuperação funcional, elevação na expressão gênica de miostatina e na expressão protéica de TNF-a, além de aumento do extravasamento protéico. / Introduction: Type I diabetes is a autoimmune disease where its susceptibility is determined by combination of chemical, genetic and environmental factors. In this study we evaluated the response of diabetic rats to muscle injury by biochemical and functional parameters. Materials and methods: Male Wistar rats of injury and injury+diabetes groups were submitted to stretching induced muscle injury. Each animal was positioned in dorsal decubitus with right posterior member firmly attached with a line, passing by a sheave, and attaching to a bottle with a water volume corresponding to 150% of animal body weight. The line was attached on the dorsal side of the paw, leading to a plantar flexion, and stretching the tibial anterior muscle. The animal received traction during 40 minutes. Protein extravasation, TNF-a by immune-enzimatic test, myostatin genic expression by real time PCR, functional index, and electromyographic analysis were performed. Results and discussion: Diabetes promotes a loss in resistance to muscle fatigue and in functional recovery, enhancement in myostatin genic expression and in TNF-a protein expression, besides increasing protein extravasation.

A PEGlação é uma bem sucedida estratégia nano-biotecnológica que envolve a ligação covalente do polietilenoglicol (PEG) a uma droga para melhorar sua farmacocinética, farmacodinâmica e perfil imunológico, e portanto, aumentar seu efeito terapêutico. Atualmente, a PEGlação é usada para modificar proteínas, peptídeos, oligonucleotídeos e fragmentos de anticorpos. A Uricase (EC 1.7.3.3, UC) é uma enzima pertencente à classe das oxidorredutases, responsável pela oxidação do ácido úrico, produzindo alantoína. Essa enzima é encontrada em muitos organismos vivos como: bactérias, leveduras, fungos, vegetais e animais. Entretanto, durante a evolução das espécies o gene da UC tornou-se inativo, por isso, em humanos a UC é inativa. Nesse sentido, a UC adquiriu destaque como um potencial fármaco uricolítico, devido à necessidade do desenvolvimento de novos agentes terapêuticos no tratamento de hiperuricemia e gota. Neste estudo, a uricase recombinante purificada de Candida sp (UC-r) e a de rim bovino (UC-b) foram modificadas por PEGlação com mPEG-p-nitrofenil carbonato (mPEG-pNP) e 2-O-mPEG-4,6-dicloro-s-triazina (mPEG-CN), produzindo conjugados com considerável atividade enzimática residual UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) e UC-b-mPEG-pNP (75%), UC-b-mPEG-CN (50%).Além disso, os conjugados obtidos com a UC-r e UC-b apresentaram valores de KM menores do que as enzimas nativas, indicando que a PEGlação conferiu uma interessante propriedade aos conjugados, que permitiu um aumento da afinidade da UC-r e UC-b pelo ácido úrico. O efeito do pH e da temperatura sobre a UC-r e UC-b modificadas indicou que os conjugados obtidos foram mais ativos em pH próximo ao fisiológico e mais estáveis do que a respectiva enzima nativa. As formas PEGladas da UC-r e UC-b foram mais resistentes à ação de diferentes proteases e mantiveram-se estáveis em soro humano, indicando que a PEGlação favoreceu a resistência a degradação proteolítica. Análises espectroscópicas de dicroísmo circular (CD) e infravermelho (FTIR) não apresentaram nenhuma diferença relevante entre a estrutura protéica da UC-r nativa e PEGlada. Estudos in vivo com coelho e camundongos Balb/c mostraram que a UC-r nativa induziu uma intensa resposta imune sendo altamente imunogênica. Por outro lado, a UC-r PEGlada quando injetada cronicamente em camundongos não induziu qualquer resposta detectável de anticorpos. Esses resultados indicam uma suficiente redução da imunogenicidade dessa enzima, devido à conjugação do mPEG-pNP ou mPEG-CN, tornando-a adequada para um possível uso terapêutico. Portanto, nesse trabalho, os resultados obtidos com a UC-r de Candida sp, mostram que dois conjugados apresentaram interessantes propriedades físico-química, biológicas e imunológicas, que permitiram um significativo avanço na transformação de uma enzima de origem fúngica em uma droga, com uma possível aplicação terapêutica no tratamento de hiperuricemia e gota. / PEGylation is a successful nanobiotechnology strategy that involves the covalent attachment of polyethylene glycol (PEG) to a drug to improve its pharmacokinetic, pharmacodynamic, and immunological profiles, and thus, enhance its therapeutic effect. Currently, PEGylation is used to modify proteins, peptides, oligonucleotides, antibody fragments, and small organic molecules. Uricase (EC 1.7.3.3, UC) is an enzyme belonging to the class of oxidorreductases responsible for the oxidation of uric acid, producing allantoin. This enzyme is found in many living organisms such as bacteria, yeasts, fungi, plants and animals. However, during the evolution of the species gene became inactive UC, therefore, in humans UC is inactive. Accordingly, UC has acquired prominence as a potential drug uricolytic due to the need of developing new therapeutic agents for the treatment of hyperuricemia and gout. In this study, purified recombinant uricase from Candida sp (UC-r) and ox kidney (UC-b) were modified by PEGylation with mPEG-p-nitrophenyl-carbonate (mPEG-pNP) and 2-O-mPEG-4,6-dichloro-s-triazine (mPEG-CN), producing conjugates with considerable residual enzyme activity UC-r-mPEG-pNP (87%), UC-r-mPEG-CN (75%) and UC-b-mPEG-pNP (75%),UC-b-mPEG-CN (50%). In addition, conjugates obtained with the UC-r and UC-b had lower KM values than native enzymes, indicating that the PEGylation gave an interesting property the conjugate that increased the affinity of UC-r and UC-b by uric acid. The effect of pH and temperature on the modified UC-r and UC-b indicated that the conjugates were more active at pH close to the physiological and more stable than its native enzyme. PEGylated forms of UC-r and UC-b were more resistant to the action of different proteases and remained stable in human serum, indicating that the PEGylation favored resistance to proteolytic degradation. Spectroscopic analysis of circular dichroism (CD) and infrared (FTIR) did not show any relevant difference in protein structure between native and PEGylated UC-r. In vivo studies with rabbit and Balb/c mice showed that UC-r native elicited an intense immune response being highly immunogenic. On the other hand, the PEGlated UC-r when chronically injected into mice did not induce any detectable response to antibodies. These results indicate a sufficient reduction of immunogenicity of this enzyme, due to conjugation of mPEG-pNP or mPEG-CN, making it suitable for possible therapeutic use. Therefore, the results obtained with the UC-r of Candida sp, showed that two conjugates have interesting physical-chemical, biological and immunological, which allowed a significant advance in the transformation of an enzyme of fungal origin in a drug with a possible application therapeutic in the treatment of hyperuricemia and gout.

Sabe-se que a atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase eritrocitária do marsupial brasileiro Didelphis marsupialis é cerca de 15 a 20 vezes a encontrada nos eritrócitos humanos. Pretendendo-se investigar se esta hiperatividade também se encontra ou não aumentada nas outras enzimas eritrocitárias, levou-se a efeito a dosagem das atividades das enzimas glicolíticas bem de outras enzimas relacionadas ao metabolismo óxido-redutor do eritrócito do marsupial. Alguns dados bioquímicos sorológicos, hematológicos e imunológicos foram também obtidos. Assim sendo, as seguintes enzimas eritrocitárias foram estudadas: hexoquinase, glicose fosfato isomerase, fosfofrutoquinase, aldolase, triose fosfato isomerase, gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, fosfogliceratoquinase, difosfoglicerato mutase, monofosfoglicerato mutase, enolase, piruvato quinase, lactato desidrogenase, glicose-6-fosfato desidrogenase, 6-fosfogliconato desidrogenase, glutationa redutase, glutationa peroxidase, glutationa S-transferase, nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato diaforase, nicotinamida adenina dinucleotideo meta-hemoglobina redutase, superóxido dismutase, aspartato aminotransferase, adenilato quinase, adenosina desaminase e acetilcolinesterase. Embora a maioria das enzimas estudadas tenham revelado atividades semelhantes às encontradas nos eritrócitos humanos, foram observados aumentos significativos da hexoquinase, piruvato quinase e glutationa S-transferase. Entretanto, a atividade da glutationa peroxidase apresentou grande aumento de atividade, cerca de dez a doze vezes a encontrada nos eritrócitos humanos, talvez agindo em conjunto com a hiperatividade da glicose-6-fosfato desidrogenase da ordem de dez a quinze vezes já descrita nos eritrócitos humanos / It is known that erythrocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase specific activity of Didelphis marsupialis is about 15-20 times higher than human red cells. In order to investigate whether this hyperactivity is extended or not to other red cell enzymes, it was proposed to ascertain the activity of the glycolytic enzymes as well as other related to the redox metabolism of the opossum erythrocyte. Some biochemical, hematological and immunological data were also assayed as well. That being so, the following red cell enzymes were assayed: hexokinase, glucose phosphate isomerase, phosphofructokinase, aldolase, triose phosphate isomerase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, phosphoglycerate kinase, diphosphoglycerate mutase, monophosphoglycerate mutase, enolase, pyruvate kinase, lactate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase, glutathione reductase, glutathione peroxidase, glutathione S-transferase, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase, nicotinamide adenine dinucleotide metahemoglobin reductase, superoxide dismutase, aspartate amino-transferase, adenylate kinase, adenosine deaminase and acetylcholinesterase . Although most of the enzymatic activities disclosed to be similar to humans, some enzymes exhibited high activities as the hexokinase, pyruvate kinase and glutathione-S-transferase, about three to four times in relation to human. However the glutathione peroxidase presented overwhelming activity, at the order of ten-twelve times the human enzyme, perhaps working together the glucose-6-phosphate dehydrogenase hyperactivity at the order of ten-fifteen times already described in the marsupial erythrocytes

Sabe-se que a atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase eritrocitária do marsupial brasileiro Didelphis marsupialis é cerca de 15 a 20 vezes a encontrada nos eritrócitos humanos. Pretendendo-se investigar se esta hiperatividade também se encontra ou não aumentada nas outras enzimas eritrocitárias, levou-se a efeito a dosagem das atividades das enzimas glicolíticas bem de outras enzimas relacionadas ao metabolismo óxido-redutor do eritrócito do marsupial. Alguns dados bioquímicos sorológicos, hematológicos e imunológicos foram também obtidos. Assim sendo, as seguintes enzimas eritrocitárias foram estudadas: hexoquinase, glicose fosfato isomerase, fosfofrutoquinase, aldolase, triose fosfato isomerase, gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, fosfogliceratoquinase, difosfoglicerato mutase, monofosfoglicerato mutase, enolase, piruvato quinase, lactato desidrogenase, glicose-6-fosfato desidrogenase, 6-fosfogliconato desidrogenase, glutationa redutase, glutationa peroxidase, glutationa S-transferase, nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato diaforase, nicotinamida adenina dinucleotideo meta-hemoglobina redutase, superóxido dismutase, aspartato aminotransferase, adenilato quinase, adenosina desaminase e acetilcolinesterase. Embora a maioria das enzimas estudadas tenham revelado atividades semelhantes às encontradas nos eritrócitos humanos, foram observados aumentos significativos da hexoquinase, piruvato quinase e glutationa S-transferase. Entretanto, a atividade da glutationa peroxidase apresentou grande aumento de atividade, cerca de dez a doze vezes a encontrada nos eritrócitos humanos, talvez agindo em conjunto com a hiperatividade da glicose-6-fosfato desidrogenase da ordem de dez a quinze vezes já descrita nos eritrócitos humanos / It is known that erythrocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase specific activity of Didelphis marsupialis is about 15-20 times higher than human red cells. In order to investigate whether this hyperactivity is extended or not to other red cell enzymes, it was proposed to ascertain the activity of the glycolytic enzymes as well as other related to the redox metabolism of the opossum erythrocyte. Some biochemical, hematological and immunological data were also assayed as well. That being so, the following red cell enzymes were assayed: hexokinase, glucose phosphate isomerase, phosphofructokinase, aldolase, triose phosphate isomerase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, phosphoglycerate kinase, diphosphoglycerate mutase, monophosphoglycerate mutase, enolase, pyruvate kinase, lactate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase, glutathione reductase, glutathione peroxidase, glutathione S-transferase, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase, nicotinamide adenine dinucleotide metahemoglobin reductase, superoxide dismutase, aspartate amino-transferase, adenylate kinase, adenosine deaminase and acetylcholinesterase . Although most of the enzymatic activities disclosed to be similar to humans, some enzymes exhibited high activities as the hexokinase, pyruvate kinase and glutathione-S-transferase, about three to four times in relation to human. However the glutathione peroxidase presented overwhelming activity, at the order of ten-twelve times the human enzyme, perhaps working together the glucose-6-phosphate dehydrogenase hyperactivity at the order of ten-fifteen times already described in the marsupial erythrocytes