A história evolutiva dos animais é altamente influenciada pela história do ambiente em que estes vivem. A floresta Atlântica é uma das mais biodiversas do mundo, e a segunda maior na região Neotropical. A história biogeográfica desta floresta é complexa, sendo que inúmeros fatores devem ter contribuído para a diversificação de sua biota. Esta dissertação estudou os padrões de distribuição da diversidade genética e morfológica em Didelphis aurita, uma espécie de marsupial didelfídeo, endêmico desta floresta, a fim de esclarecer eventos biogeográficos que tenham desempenhado um papel importante na história da floresta. A distribuição desta espécie é concordante com a distribuição da floresta, do norte do Rio Grande do Norte ao sul do Rio Grande do Sul. Os resultados mostraram que existe uma população muito divergente na porção nordeste desta distribuição (estados de Alagoas e Pernambuco), sendo que o grau de divergência tanto molecular quanto morfológica é um indicativo de que se trata de outra espécie. Além disso, os dados apontam que há pouco ou nenhum fluxo gênico entre as duas espécies. O relacionamento deste grupo do Nordeste com a espécie D. aurita e sua espécie irmã D. marsupialis, não pôde ser solucionado. No entanto, o evento de separação foi datado entre 800-500 mil anos, no período Quaternário. Uma vez que a Mata Atlântica e Floresta Amazônica sofreram vários eventos de expansão e retração nesta época, sugeriu-se que a dinâmica climática do Quaternário tenha desempenhado um importante papel na divergência deste grupos. Além disso, D. aurita (excluindo-se a população do Nordeste) foi estudado a fim de testar as predições da hipótese de Refúgios nesta floresta para este grupo. Os padrões de diversidade genética e morfológica dentro deste grupo foram concordante com várias das premissas da Hipótese de Refúgios, porém ao datar-se o evento de expansão, este, é mais antigo do que o previsto para a hipótese. Não obstante, dados de simulação mostraram que testes de refúgios baseados nestas premissas simplistas, podem não ser aplicáveis a história da Mata Atlântica. Desta forma, embora haja indícios de que a Hipótese de Refúgios tenha sido importante para a diversidade deste grupo, é necessário avaliar se esta expansão demográfica realmente deve-se a dinâmica climática do Quaternário e, portanto, avaliar se a diversidade encontrada nesta população pode ser explicada pela hipótese de Refúgios. / The evolutionary history of animals is highly influenced by the history of the environment where these animals live. The Atlantic rainforest is one of the most diverse in the world, and the second largest forest in the Neotropics. The biogeographical history of this forest is complex, and numerous factors might have played a role in the diversification of the biota. This dissertation has studied the patterns of distribution of the genetics and morphological variation in Didelphis aurita, a Didelphidae marsupial, endemic from this forest. This study aims to clarify the biogeographical events that have been important in the diversification of the Atlantic biota. D. aurita distribution is concordant with the forest distribution, going from the north of Rio Grande do Norte state to the south of Rio Grande do Sul state. The results have showed a very diverging population in the northeast distribution (Alagoas and Pernambuco states), and both molecular and morphological divergences indicate that it might be a different species. Moreover, both species might have very low or none gene flow between them. The phylogenetic relationship between this population with the other two species (D. aurita and D. marsupialis), cannot be solved. Even so, the separation event has been dated about 500-800 hundreds years ago, in the Quaternary period. Seeing that both Neotropical forests (Atlantic and Amazonian forests) have experienced several expansions and retractions events in this period, it has been suggested that the climatic dynamics of this period might have played a key role in the divergence of the three species. Moreover, D. aurita (excluding the Northeast population) has been studied with the purpose of testing the Refugee hypothesis in this forest. The genetic and morphological and molecular variations patterns are in agreement with several of this Hypothesis premises. However, the dating of the expansion event is not in agreement with the hypothesis, once it\'s much older than expected. Moreover, simulated data showed that this Refugee tests based in such simplistic assumptions might not be applicable to the history of the Atlantic forest. In this way, even though there are evidences supporting that the Quaternary climate oscillations have been important for this group, it is necessary to evaluate if this demographic expansion is really due to the cyclic glaciations events, and hence evaluate the roll of the Refugee hypothesis for this population.

A história evolutiva dos animais é altamente influenciada pela história do ambiente em que estes vivem. A floresta Atlântica é uma das mais biodiversas do mundo, e a segunda maior na região Neotropical. A história biogeográfica desta floresta é complexa, sendo que inúmeros fatores devem ter contribuído para a diversificação de sua biota. Esta dissertação estudou os padrões de distribuição da diversidade genética e morfológica em Didelphis aurita, uma espécie de marsupial didelfídeo, endêmico desta floresta, a fim de esclarecer eventos biogeográficos que tenham desempenhado um papel importante na história da floresta. A distribuição desta espécie é concordante com a distribuição da floresta, do norte do Rio Grande do Norte ao sul do Rio Grande do Sul. Os resultados mostraram que existe uma população muito divergente na porção nordeste desta distribuição (estados de Alagoas e Pernambuco), sendo que o grau de divergência tanto molecular quanto morfológica é um indicativo de que se trata de outra espécie. Além disso, os dados apontam que há pouco ou nenhum fluxo gênico entre as duas espécies. O relacionamento deste grupo do Nordeste com a espécie D. aurita e sua espécie irmã D. marsupialis, não pôde ser solucionado. No entanto, o evento de separação foi datado entre 800-500 mil anos, no período Quaternário. Uma vez que a Mata Atlântica e Floresta Amazônica sofreram vários eventos de expansão e retração nesta época, sugeriu-se que a dinâmica climática do Quaternário tenha desempenhado um importante papel na divergência deste grupos. Além disso, D. aurita (excluindo-se a população do Nordeste) foi estudado a fim de testar as predições da hipótese de Refúgios nesta floresta para este grupo. Os padrões de diversidade genética e morfológica dentro deste grupo foram concordante com várias das premissas da Hipótese de Refúgios, porém ao datar-se o evento de expansão, este, é mais antigo do que o previsto para a hipótese. Não obstante, dados de simulação mostraram que testes de refúgios baseados nestas premissas simplistas, podem não ser aplicáveis a história da Mata Atlântica. Desta forma, embora haja indícios de que a Hipótese de Refúgios tenha sido importante para a diversidade deste grupo, é necessário avaliar se esta expansão demográfica realmente deve-se a dinâmica climática do Quaternário e, portanto, avaliar se a diversidade encontrada nesta população pode ser explicada pela hipótese de Refúgios. / The evolutionary history of animals is highly influenced by the history of the environment where these animals live. The Atlantic rainforest is one of the most diverse in the world, and the second largest forest in the Neotropics. The biogeographical history of this forest is complex, and numerous factors might have played a role in the diversification of the biota. This dissertation has studied the patterns of distribution of the genetics and morphological variation in Didelphis aurita, a Didelphidae marsupial, endemic from this forest. This study aims to clarify the biogeographical events that have been important in the diversification of the Atlantic biota. D. aurita distribution is concordant with the forest distribution, going from the north of Rio Grande do Norte state to the south of Rio Grande do Sul state. The results have showed a very diverging population in the northeast distribution (Alagoas and Pernambuco states), and both molecular and morphological divergences indicate that it might be a different species. Moreover, both species might have very low or none gene flow between them. The phylogenetic relationship between this population with the other two species (D. aurita and D. marsupialis), cannot be solved. Even so, the separation event has been dated about 500-800 hundreds years ago, in the Quaternary period. Seeing that both Neotropical forests (Atlantic and Amazonian forests) have experienced several expansions and retractions events in this period, it has been suggested that the climatic dynamics of this period might have played a key role in the divergence of the three species. Moreover, D. aurita (excluding the Northeast population) has been studied with the purpose of testing the Refugee hypothesis in this forest. The genetic and morphological and molecular variations patterns are in agreement with several of this Hypothesis premises. However, the dating of the expansion event is not in agreement with the hypothesis, once it\'s much older than expected. Moreover, simulated data showed that this Refugee tests based in such simplistic assumptions might not be applicable to the history of the Atlantic forest. In this way, even though there are evidences supporting that the Quaternary climate oscillations have been important for this group, it is necessary to evaluate if this demographic expansion is really due to the cyclic glaciations events, and hence evaluate the roll of the Refugee hypothesis for this population.

Submitted by Jorge Cativo (jorge.cativo@inpa.gov.br) on 2018-08-23T16:14:09Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO_GILSON-NETO_1007.pdf: 3774554 bytes, checksum: 90eaf1e85836c7b1801ee42c8df658f3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-23T16:14:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO_GILSON-NETO_1007.pdf: 3774554 bytes, checksum: 90eaf1e85836c7b1801ee42c8df658f3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-06-28 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The key factors driving species distribution within fluvial island systems worldwide are poorly known. Previous studies have shown that herbivore abundance and proportion in the mammal assemblage can be indirectly influenced by soil fertility via production of nutritious fruits and leaves and higher ecosystem dynamics linked to vegetation growth on more productive soils.The goal of this study was to investigate which environmental (soil fertility, tree basal area, forest cover and distance from sampling point to nearest mainland) and anthropogenic factors (logging, distance from the sampling point to nearest human community) were most closely-linked to observed patterns of mammalian abundance and proportions of omnivorous and herbivorous mammals on fluvial islands of the Rio Negro, Amazonas State, Brazil. Several of these islands are located on the left bank of the river, and so receive nutrient-rich sediments from the Rio Branco. We expected that our chosen environmental and anthoropogenic factors could predict island mammalian abundance patterns. We used camera traps to examine this, surveying 49 sampling sites across 60 days when water levels were seasonally low.We calculated the proportion of herbivorous and omnivorous mammals per site, and assayed their relationships to predictor variables with a series of generalized linear models (GLM). As expected, the number of records was low on all studied fluvial islands, compared with upland terra-firme studies. In 70,560 sampling hours we obtained 126 independent camera trap records, for a total of 11 mammal species. Total mammal abundance and proportion of the generalist omnivore Didelphis marsupialis was not affected by our chosen environmental and antropic variables. However, soil fertility played a central role in determining the proportion of herbivorous species.Thus, gradients of soil fertility can help to explain herbivore distributions on riverine islands, and define crucial areas for conservation and future restoration.Additionally, logging, distance to the nearest human community and to the mainland had a positive effect, and forest cover a negative effect, on the proportion of herbivorous mammals, but did not affect generalist omnivorous species. Therefore, results suggest that island soil fertility can differentialy impact proportions of mammals from the same feeding guild. / Os principais mecanismos que regulam a distribuição das espécies em ilhas fluviais são pouco conhecidos. Entender como os ciclos biogeoquímicos afetam a biosfera é um fator-chave para a compreensão do funcionamento dos ecossistemas. Na Amazônia, em uma escala regional, poucos estudos investigaram como a fertilidade do solo pode influenciar a abundância de mamíferos. Estudos prévios têm demonstrado que os mamíferos herbívoros podem ser indiretamente influenciados pela fertilidade do solo por meio de maior investimento das plantas em frutos e maior qualidade nutricional de folhas e frutos. A maioria desses estudos compararam extremos de gradientes ambientais (terra-firme e várzea e Amazônia sentido lesteoeste). Neste trabalho objetivamos investigar como a variação pequena de nutrientes encontrada nos solos, e adicionalmente outros aspectos da paisagem e fatores antrópicos, em ilhas fluviais, podem afetar as assembleias de mamíferos. A nossa expectativa era de que a fertilidade do solo, área basal de árvores, área florestada e distância do ponto de amostragem para a comunidade humana mais próxima influenciassem positivamente, enquanto que a exploração madeireira nestes ambientes e distância do ponto de amostragem a áreas de terra firme influenciassem negativamente a abundância total de mamíferos e proporção de herbívoros. Ainda, para espécies generalistas e onívoras estas relações seriam nulas. Os dados de abundancia relativa das espécies de mamíferos foram estimados utilizando 49 armadilhas fotográficas espaçadas cerca de 2km umas das outras no arquipélago, as quais operaram 24 horas durante 60 dias de amostragem. As relações entre as variáveis preditoras e a abundância relativa foram investigadas por uma série de modelos lineares generalizados (GLM). A espécie onívora Didelphis marsupialis contabilizou 60% dos registros totais de mamíferos. Nenhuma das variáveis preditoras, tanto ambientais quanto antrópicas foram capazes de explicar a abundância total de indivíduos e a proporção de Didelphis marsupialis na assembleia. Por outro lado, ao considerar somente as espécies herbívoras nas análises, a fertilidade do solo foi a variável explicativa com o maior poder preditivo e influenciou positivamente a proporção de mamíferos herbívoros. Os resultados deste trabalho indicam que a fertilidade do solo, em ilhas fluviais que recebem diferentes aportes de nutrientes, afeta de forma diferencial a proporção de indivíduos dentro de grandes agrupamentos taxonômicos, como os mamíferos terrestres.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) monique_trugilho_ioc_dout_2009.pdf: 10986205 bytes, checksum: 7de098da6c6025322360c2bb8516382d (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A proteína antiofídica DM43 isolada do soro do gambá Didelphis aurita inibe o efeito hemorrágico e a atividade proteolítica de metaloproteases de venenos de serpentes (SVMPs). Ao se ligar às SVMPs, o homodímero de DM43 se dissocia e cada monômero se liga a uma molécula de metaloprotease. O monômero é composto de três domínios tipo-imunoglobulina, dois dos quais são glicosilados. Para investigar a relação estrutura-função de DM43, os genes codificantes para esta proteína e para seus domínios foram clonados nos vetores pET101D/TOPO ou pET102D/TOPO; neste último, a proteína recombinante foi expressa em fusão com a tiorredoxina. Expressamos as construções obtidas em bactérias competentes da linhagem BL21 Star (DE3) de E. coli, na forma de corpúsculos de inclusão. Após purificação e reenovelamento por diálise, os espectros de dicroísmo circular (CD) na região do ultravioleta distante indicaram uma mistura de \03B1-hélices e folhas \03B2 pregueadas para os domínios recombinantes expressos em fusão com a tiorredoxina. A identidade das proteínas recombinantes foi confirmada, tanto por immunoblotting com anticorpo policlonal contra DM43, quanto por espectrometria de massas (MS/MS). Entretanto, nenhum dos domínios recombinantes, isolados ou combinados, foi capaz de inibir a atividade proteolítica da jararagina, uma metaloprotease de Bothrops jararaca. Ao contrário, os domínios fusionados com a tiorredoxina foram degradados quando incubados com esta SVMP. Estes resultados podem indicar que a glicosilação é funcionalmente importante e/ou que a conformação nativa multidomínio é necessária para a atividade biológica deste inibidor. Para melhor entender seus requisitos estruturais, estudamos a DM43 nativa após degradação proteolítica. Sob condições nativas, a digestão limitada de DM43 com tripsina ou quimotripsina gerou vários fragmentos, mas nenhum peptídeo ativo contra a SVMP foi obtido. Sob condições desnaturantes, a digestão extensiva de DM43 pela endoproteinase Lys-C produziu peptídeos menores. Mesmo sem atividade biológica contra a jararagina, três destes peptídeos foram capazes de interagir com esta SVMP. Após sequenciamento por MS/MS, cada peptídeo foi localizado em um domínio diferente de DM43. Estes resultados parecem sugerir a participação conjunta dos três domínios na interação com as SVMPs / The antiophidic protein DM43 isolated from Didelphis aurita serum inhibits the hemorrhagic effect and the proteolytic activity of snake venom metalloproteinases (SVMPs). Upon SVMP addition, DM43 homodimer dissociates and one subunit binds to one SVMP. The 43 kDa monomer is composed of three immunoglobulin-like domains, two of which are glycosylated. To investigate the structure-function relationship in this protein, the genes encoding DM43 and its domains were separately cloned into pET101D/TOPO or pET102D/TOPO vector, this last with the fusion partner thioredoxin. The obtained constructions were expressed in BL21 Star (DE3) competent E. coli cells as inclusion bodies. After purification and dialysis refolding, circular dichroism (CD) spectra in the far UV region of the recombinants domains with fusion partner indicated the presence of folded proteins with both alpha-helix and beta-sheet. The identities of the recombinant proteins were confirmed by immunoblotting with polyclonal antibodies against serum DM43 and by mass spectrometry (MS/MS). However, none of the domains either isolated or in combination, were able to inhibit the proteolytic activity of jararhagin. In contrast, thioredoxin-fused domains were readily digested by this SVMP. These results may indicate that glycosylation is functionally important for DM43 and/or that a multidomain native conformation is necessary for the biological activity of the inhibitor. To better understand its structural requirements, serum DM43 was studied after proteolytic degradation. Under native conditions, limited digestion of DM43 by trypsin or chymotrypsin generated various fragments, but no active peptide against SVMP was obtained. Extensive digestion of denatured DM43 by Lys-C endopeptidase produced smaller peptides. Even though not able to neutralize the proteolytic activity of jararhagin, three DM43 Lys-C peptides were able to bind to SVMP. After sequencing by MS/MS, each peptide was localized to one DM43 domain. Taken together, these results seem to reinforce the participation of all three domains of DM43 in the interaction with SVMPs

Eighty-three Didelphis virginiana from the Portland metropolitan area were collected and studied from December 1974 through May 1976. Males averaged 3394 g, females 2318 g. An annual sex ratio of 68.7:31.3 was recorded. Data indicate the possibility of a year-round breeding season and suggest the occurrence of three peaks of reproductive activity: January-February, April-May and October-November. The six primary foods consumed annually are: leaf litter, mammals, gastropods, earthworms, grasses and pet food. Seasonal composition and diversity in the diet is marked. Five new parasite-host records were established. These include mites: Androlaelaps fahrenholsi, Haemogamasus nidi, Eulaelape stabularis tick, Ixodes angustus, and a nematode, Toxocara canis. Both minimum and maximum temperature, and perhaps precipitation to a lesser degree, affect the activity of the species. Nest building by an immature opossum is described.

Por que os trópicos sustentam tanta diversidade? Essa é a pergunta principal que motivou este trabalho. Uma das frentes para contribuir ao entendimento deste fenômeno é estudar a origem da diversidade. Diversas hipóteses de diversificação existem, e existe também uma acalorada discussão no campo de estudo que busca testar essas diferentes hipóteses. Uma das hipóteses mais conhecida, se também não a mais polêmica, é a Hipótese de Refúgios. O objetivo deste trabalho foi, portanto, testar a Hipótese de Refúgios na Floresta Atlântica através de um estudo de caso. Para tanto, inicialmente os padrões de distribuição morfológica e genética do marsupial Didelphis aurita Wied, 1826 foram investigados através do método de quadrantes. As medidas cranianas revelaram uma correlação longitudinal para fêmeas, mas ausência de associação geográfica na variação do crânio dos machos. Entretanto, complementarmente, outro critério foi utilizado. Através de uma Análise de Componentes Principais sobre a variação da latitude e longitude resumiu-se a variação geográfica em apenas uma variável. Esta acaba se refletindo em uma diagonal da latitude e longitude, que acompanha a própria distribuição da Floresta Atlântica na costa brasileira. Agora, os grupos são formados se apresentam diferenças significativas ao longo desta diagonal, permitindo que populações biológicas distintas, mas próximas geograficamente, sejam separadas. Assim, verificou-se que a associação longitudinal das fêmeas provém basicamente da diferenciação das populações da Bahia, e mais, isso também afeta os machos. Contudo, o sinal não aparece através do outro critério devido ao fato de machos também apresentarem diferenciações em menor escala dentro da distribuição ao sul da Bahia, possivelmente devido à presença do ecótone entre a Floresta Atlântica e o cerrado latu sensu. Por usa vez, os dados genéticos como explorados através da variação geográfica do marcador mitocondrial citocromo B, revelaram que também existe uma associação com a longitude, e novamente, ela provém principalmente da diferenciação dos extremos da distribuição. Aqui, não só a mesma quebra na Bahia aparece, mas também uma outra quebra mais ao norte, de indivíduos provenientes de Alagoas. Tanto para os dados morfológicos quanto para os moleculares, demonstrou-se que há isolamento por distância no gambá, entretanto, toda a distribuição ao sul da Bahia se comporta como uma grande população panmítica. Essa ausência de estruturação geográfica, também aparente em análises de diferenciação (Fst), unidas aos testes de neutralidade (D de Tajima e F de Fu) negativos e significativos, que dão sinal de expansão demográfica recente mostram, juntos, as assinaturas esperadas pela Hipótese de Refúgios. Contudo, a divergência entre as populações deste sul datam de aproximadamente 140.000≅60.000 anos, o que não pode ser atribuída como sendo reflexo do último interglacial, esperado em cerca de 20.000 anos. Explorando mais a fundo as análises de Fst e os testes de neutralidade, revelou-se que suas estimativas são altamente influenciadas por desbalanço no tamanho de amostras, assim como baixa representatividade e agrupamentos inadequados que unem populações biológicas distintas. Os aparentes sinais de refúgios obtidos foram, portanto, artefato de três população bem amostradas no Rio de Janeiro. Sendo assim, não se pode atribuir esta hipótese como tendo criado diversidade dentro da espécie D. aurita. / How can the tropics present such diversity? This question lies at the very core of this work. While for the origins of diversity, numerous hypotheses have been put forward over time, the pursuit of empirical proofs for them is almost as old as the hypotheses themselves. One of the better known such hypothesis, and at the same time one of the most controversial, is the Refugee Hypothesis. In this context, the main goal of this thesis has been to test the Refugee Hypothesis in the Atlantic Forest by means of a study case. Initially, the morphologic and genetic distribution patterns of Didelphis aurita Wied, 1826 marsupial have been investigated using the grids method. Cranial measurements revealed a longitudinal correlation for the females and, at the same time, the absence of any geographic correlation in the variation of male skulls. By means of a Principal Component Analysis, the latitudinal and longitudinal variations have been reduced to a geographical variation dependent on one variable only _ a diagonal that follows the extension of the Atlantic Forest along the Brazilian coast. Groups have been formed if they presented significant differences along this diagonal, thus allowing distinct, but geographically close populations, to be differentiated. It could hereby be proven that the longitudinal correlation for females reflects mainly the differentiation between populations from Bahia state, and even more, that this differentiation affects the males as well. The signature does not appear in the grid criterium for the males since they also present lower levels of differentiation in the south of Bahia, possibly due to the presence of the ecotone of the Atlantic Forest with the cerrado latu sensu biome. There is, nevertheless, a break in Bahia for both males and females. As for the geographic variation of the molecular mitochondrial marker cytochrome B, it also presented a longitudinal variation, and a clear differentiation between the two extremes of the analyzed distribution. Here, not only a similar break could be seen in Bahia, but another one further north in the specimens from Alagoas state. For both the morphological and the molecular data, while there is isolation by distance effect for the opossum, all the distribution south of Bahia behaves as a large panmitic population. This lack of geographical structuring, also apparent in differentiation analyzes (Fst), together with neutrality tests (Tajima\'s D and Fu\'s F) which point towards recent geographic expansion, show the signatures expected by the Refugee Hypothesis. Since, however, the data indicates that the divergence of southern populations occurred approximately 140,000≅60,000 years ago, the diversification cannot be due to the last inter-glacial period from 20,000 years ago. To understand this seeming contradiction, further in-depth investigations of the Fst analyzes and the neutrality tests revealed that the estimations had been highly influenced by the heterogeneity in the number of samples, as well as by the low representability of some localities and also inadequate grouping of specimens, which mixed distinct biological populations. The apparent refugee signatures have thus been the misleading consequence of three well-sampled populations from Rio de Janeiro state. Therefore, the Refugee Hypothesis cannot be regarded as an explanation for the existing diversity of the species D. aurita.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-19T17:20:40Z No. of bitstreams: 1 Fred da Silva Juliao Uso de método de biologia molecular....pdf: 3387831 bytes, checksum: 0efc6396d21a6e8a634b8026665afe7c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-19T17:20:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fred da Silva Juliao Uso de método de biologia molecular....pdf: 3387831 bytes, checksum: 0efc6396d21a6e8a634b8026665afe7c (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / A leishmaniose visceral (LV) é uma zooantroponose sistêmica de importância reconhecida em saúde pública, 90% dos casos no novo mundo são oriundos do Brasil. Os cães domésticos e as raposas são considerados como os principais reservatórios. A persistência da Leishmania em áreas endêmicas e o insucesso das medidas de prevenção, dirigidas exclusivamente ao reservatório canino, sugerem que outros animais podem ter importância na manutenção do ciclo de transmissão da LV. OBJETIVO: Avaliar potenciais reservatórios para LV numa área endêmica, utilizando método de biologia molecular quantitativo (PCR real-time). MÉTODOS: Foram estudados animais domésticos (bovinos, equídeos, caprinos e ovinos) e animais silvestres (marsupial), no município de Salinas da Margarida, Bahia, de 2007 a 2009. Todos os animais domésticos de produção mantidos e/ou pernoitando nas áreas urbanas do município foram incluídos. Os marsupiais foram capturados com armadilha animal modelo Tomahawk colocadas no peridomicílio das residências onde ocorreram casos de LV humana e/ou canina na localidade de Encarnação. Nos animais domésticos de produção foi coletado apenas amostra de sangue periférico e nos marsupiais, além de sangue, foi obtida uma amostra de pele através de biópsia da orelha. Em todas as amostras foi realizado PCR real-time para investigar a presença de DNA do parasito e estimar a carga parasitária. Os primers e sondas utilizados foram selecionados em gene SSU rRNA, que aparece 160 vezes no genoma de Leishmania spp. e é altamente conservado entre as espécies de Leishmania. RESULTADOS: No total, foram avaliados 80 animais domésticos (20 bovinos, 33 equídeos, 20 caprinos e 7 ovinos) e 103 marsupiais, todos da espécie Didelphis albiventris. Cinco bovinos foram positivos no teste de PCR real-time com carga parasitária variando de 12,7 a 183,5 parasitos/mL. Apenas um marsupial apresentou amostra de sangue positiva (6,0 parasitos/mL). Todos os demais animais testaram negativo. CONCLUSÃO: A técnica de PCR real-time pode ser uma ferramenta útil para avaliar o papel de potenciais reservatórios domésticos e silvestres para LV. A execução do PCR real-time é menos trabalhosa e mais prática do que a realização do teste de xenodiagnóstico, além disso, ela poder ser automatizada, permitindo a análise de grande número de amostras em estudos epidemiológicos. A detecção de carga parasitária de Leishmania em sangue de bovinos, em quantidade comparável à encontrada em cães, sugere que eles podem ser reservatórios para LV. A relativa abundância de bovinos nas áreas endêmicas para LV, assim como as evidências da preferência alimentar do vetor por estes animais, ressaltam a importância do papel que os bovinos podem ter na transmissão da LV. Mais trabalhos são necessários para elucidar estas questões. / Visceral leishmaniasis (VL) is a systemic zooantroponose of public health relevance, 90% of cases in the new world are from Brazil. Domestic dogs and foxes are considered the main reservoirs. The persistence of Leishmania in endemic areas and the failure of preventive measures, directed exclusively to the canine reservoir, suggest that other animals may be important in maintaining the transmission cycle of Leishmania. OBJECTIVE: To investigate potential reservoirs for VL in an endemic area, using molecular biology quantitative method (real-time PCR). METHODS: We studied domestic animals (cattle, horses, goats and sheeps) and wildlife (marsupial), in the city of Salinas da Margarida, Bahia, from 2007 to 2009. All livestock animals maintained and/or staying overnight in the urban areas of the municipality were included. The marsupials were captured with Tomahawk model animal traps placed outside the home of homes where there were human and/or dog VL cases in the locality of the Encarnação. In livestock animals, we collected only a sample of peripheral blood and in marsupials, in addition to blood we also collected a sample of ear skin biopsy. In all samples we carried out real-time PCR to detect the presence of parasite DNA and to estimate the parasite load. The primers and probes used were selected on SSU rRNA gene, which appears 160 times in the genome of Leishmania spp. and is highly conserved among species of Leishmania. RESULTS: In total, 80 livestock animals were evaluated (20 cattle, 33 horses, 20 goats and 7 sheep), and 103 marsupials, all Didelphis albiventris. Five cattle were positive by real-time PCR with parasite load ranging from 12.7 to 183.5 parasites/mL. Only one marsupial had a positive blood sample (6.0 parasites/mL). All other animals tested negative. CONCLUSION: The real-time PCR technique can be a useful tool for assessing the potential role of domestic and wild reservoir for LV. The implementation of real-time PCR is less laborious and more practical than the test of xenodiagnosis, in addition, it can be automated, allowing for the analysis of large number of samples in epidemiological studies. Detection of Leishmania parasite load in the blood of cattle, in an amount comparable to that found in dogs, suggests that they may be reservoirs for VL. The relative abundance of cattle in endemic areas for VL, as well as evidence of vector feeding preference for these animals, highlight the important role that cattle may exert in the transmission of VL. More research is needed to clarify these issues.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Floresta Tropical Atlântica apresenta uma enorme biodiversidade, e está atualmente sujeita a inúmeras pressões como a perda de área pela intensa ocupação humana, agricultura, pecuária, urbanização e industrialização. Esses impactos têm provocado desmatamento e fragmentação florestal, processos que interferem na manutenção das populações animais, inclusive afetando os ciclos silvestres de parasitas e microorganismos. Didelphis aurita é um marsupial da Mata Atlântica com alta capacidade adaptativa a ambientes perturbados. Esta espécie onívora é tolerante à fragmentação florestal, podendo sobreviver em ambientes silvestres, rurais, suburbanos e urbanos, tendo importância na conexão dos ciclos silvestres e urbanos de diversos agentes. Este trabalho teve por objetivo descrever aspectos hematológicos, bioquímicos e de hemoparasitas em Didelphis aurita de duas áreas da Serra dos Órgãos/ RJ, uma área fragmentada e outra de mata contínua. Entre julho de 2011 e fevereiro de 2012 foram capturados 61 animais que tiveram amostras de sangue avaliadas. Os resultados expressos como média desvio padrão foram: Volume Globular 38,66 % ( 4,97); Hemácias 5,40 ( 0,75) x106/mm3; Hemoglobina 12,78 ( 1,68) g/dL; VGM 71,69 ( 3,56) fl; CHGM 33,01 ( 0,63) %; Plaquetas 514,70 ( 323,10) x 103/mm3; Leucócitos 19.678,52 ( 10.152,26)/mm3; Basófilos 0,59 ( 0,72) %; Eosinófilos 13,79 ( 6,94)%; Bastonetes 0,77 ( 2,04) %; Segmentados 41,12 ( 13,95) %; Linfócitos 41,97 ( 12,97) %; Monócitos 1,75 ( 1,51)%. Para parâmetros bioquímicos encontramos os seguintes resultados: Proteínas totais 8,50 ( 1,68); albumina 3,03 ( 0,69); globulina 5,44 ( 1,66); uréia 83,57 ( 20,11); creatinina 0,44 ( 0,13); ALT 85,01 ( 65,65); AST 314,55 ( 130,58); FA 420,38 ( 371,89); GGT 19,40 ( 8,51). Os parâmetros hematócrito, hemoglobina, hematimetria, ALT, AST e FA foram maiores nos machos do que nas fêmeas. Adultos apresentaram valores de proteína plasmática total, leucócitos, hematócrito, hemoglobina, hematimetria, albumina, proteínas totais, creatinina e GGT maiores do que jovens, e o inverso ocorreu para plaquetas, globulina e FA. Animais do Fragmento apresentaram valores de massa corporal e albumina menores do que os do Garrafão, e o inverso ocorreu para GGT e globulina. Babesiasp. ocorreu em 26,6% da população, sendo mais freqüente em adultos. Estes resultados são os primeiros parâmetros de referência para Didelphis aurita na Serra dos Órgãos, contribuindo para o estudo desta espécie. / The Atlantic Forest is characterized by a high species diversity and endemism. This ecosystem is under human-induced threats for decades, loosing area to agriculture, pastures and urban areas.These threats have lead to habitat destruction and fragmentation, disturbing ecological processes and affecting the enzootic cycle of diseases. Didelphis aurita is an Atlantic Forest marsupial with synanthropic habit, capable of survive in disturbed and fragmented environments, including urban areas. The aim of this study was to describe haemoparasites, hematologic and serum chemistry aspects of D. aurita in Serra dos Órgãos/ RJ, comparing two areas, a conserved forest and a fragmented landscape. Between July 2011 and February 2012 61 specimens were studied. Results are given as mean standard deviation, as follows: Packed cell volume 38,66 % ( 4,97); erythrocytes 5,40 ( 0,75)x106/mm3; hemoglobin 12,78 ( 1,68) g/dL; MCV 71,69 ( 3,56) fl; MCHC 33,01 ( 0,63) %; Platelets 514,70 ( 323,10) x 103/mm3; Leukocytes 19.678,52 ( 10.152,26)/mm3; basophils 0,59 ( 0,72) %; eosinophils 13,79 ( 6,94)%; band neutrophils 0,77 ( 2,04) %; neutrophils 41,12 ( 13,95) %; lymphocytes 41,97 ( 12,97) %; monocytes 1,75 ( 1,51)%. The serum chemistry values were: total protein8,50 ( 1,68); albumin 3,03 ( 0,69); globulin 5,44 ( 1,66); BUN 83,57 ( 20,11); creatinine 0,44 ( 0,13); ALT 85,01 ( 65,65); AST 314,55 ( 130,58); AP 420,38 ( 371,89); GGT 19,40 ( 8,51). Packed cell volume, hemoglobin, erythrocytes, ALT, AST and AP were higher in males than in females. Adults have higher values of total plasmatic protein, leukocytes, packed cell volume, hemoglobin, erythrocytes, albumin, total protein and GGT than young animals. The Young have higher platelets, globulin and AP. Animals from the fragmented area present lower body mass and lower levels of albumin than those from the conserved Forest. The opposite occurred for GGT and globulin. Babesia sp. were found in 26.6% of specimens, more frequently in adults. These results are the very first reportof hematologic and serum chemistry values for D. aurita in Serra dos Órgãos.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Floresta Tropical Atlântica apresenta uma enorme biodiversidade, e está atualmente sujeita a inúmeras pressões como a perda de área pela intensa ocupação humana, agricultura, pecuária, urbanização e industrialização. Esses impactos têm provocado desmatamento e fragmentação florestal, processos que interferem na manutenção das populações animais, inclusive afetando os ciclos silvestres de parasitas e microorganismos. Didelphis aurita é um marsupial da Mata Atlântica com alta capacidade adaptativa a ambientes perturbados. Esta espécie onívora é tolerante à fragmentação florestal, podendo sobreviver em ambientes silvestres, rurais, suburbanos e urbanos, tendo importância na conexão dos ciclos silvestres e urbanos de diversos agentes. Este trabalho teve por objetivo descrever aspectos hematológicos, bioquímicos e de hemoparasitas em Didelphis aurita de duas áreas da Serra dos Órgãos/ RJ, uma área fragmentada e outra de mata contínua. Entre julho de 2011 e fevereiro de 2012 foram capturados 61 animais que tiveram amostras de sangue avaliadas. Os resultados expressos como média desvio padrão foram: Volume Globular 38,66 % ( 4,97); Hemácias 5,40 ( 0,75) x106/mm3; Hemoglobina 12,78 ( 1,68) g/dL; VGM 71,69 ( 3,56) fl; CHGM 33,01 ( 0,63) %; Plaquetas 514,70 ( 323,10) x 103/mm3; Leucócitos 19.678,52 ( 10.152,26)/mm3; Basófilos 0,59 ( 0,72) %; Eosinófilos 13,79 ( 6,94)%; Bastonetes 0,77 ( 2,04) %; Segmentados 41,12 ( 13,95) %; Linfócitos 41,97 ( 12,97) %; Monócitos 1,75 ( 1,51)%. Para parâmetros bioquímicos encontramos os seguintes resultados: Proteínas totais 8,50 ( 1,68); albumina 3,03 ( 0,69); globulina 5,44 ( 1,66); uréia 83,57 ( 20,11); creatinina 0,44 ( 0,13); ALT 85,01 ( 65,65); AST 314,55 ( 130,58); FA 420,38 ( 371,89); GGT 19,40 ( 8,51). Os parâmetros hematócrito, hemoglobina, hematimetria, ALT, AST e FA foram maiores nos machos do que nas fêmeas. Adultos apresentaram valores de proteína plasmática total, leucócitos, hematócrito, hemoglobina, hematimetria, albumina, proteínas totais, creatinina e GGT maiores do que jovens, e o inverso ocorreu para plaquetas, globulina e FA. Animais do Fragmento apresentaram valores de massa corporal e albumina menores do que os do Garrafão, e o inverso ocorreu para GGT e globulina. Babesiasp. ocorreu em 26,6% da população, sendo mais freqüente em adultos. Estes resultados são os primeiros parâmetros de referência para Didelphis aurita na Serra dos Órgãos, contribuindo para o estudo desta espécie. / The Atlantic Forest is characterized by a high species diversity and endemism. This ecosystem is under human-induced threats for decades, loosing area to agriculture, pastures and urban areas.These threats have lead to habitat destruction and fragmentation, disturbing ecological processes and affecting the enzootic cycle of diseases. Didelphis aurita is an Atlantic Forest marsupial with synanthropic habit, capable of survive in disturbed and fragmented environments, including urban areas. The aim of this study was to describe haemoparasites, hematologic and serum chemistry aspects of D. aurita in Serra dos Órgãos/ RJ, comparing two areas, a conserved forest and a fragmented landscape. Between July 2011 and February 2012 61 specimens were studied. Results are given as mean standard deviation, as follows: Packed cell volume 38,66 % ( 4,97); erythrocytes 5,40 ( 0,75)x106/mm3; hemoglobin 12,78 ( 1,68) g/dL; MCV 71,69 ( 3,56) fl; MCHC 33,01 ( 0,63) %; Platelets 514,70 ( 323,10) x 103/mm3; Leukocytes 19.678,52 ( 10.152,26)/mm3; basophils 0,59 ( 0,72) %; eosinophils 13,79 ( 6,94)%; band neutrophils 0,77 ( 2,04) %; neutrophils 41,12 ( 13,95) %; lymphocytes 41,97 ( 12,97) %; monocytes 1,75 ( 1,51)%. The serum chemistry values were: total protein8,50 ( 1,68); albumin 3,03 ( 0,69); globulin 5,44 ( 1,66); BUN 83,57 ( 20,11); creatinine 0,44 ( 0,13); ALT 85,01 ( 65,65); AST 314,55 ( 130,58); AP 420,38 ( 371,89); GGT 19,40 ( 8,51). Packed cell volume, hemoglobin, erythrocytes, ALT, AST and AP were higher in males than in females. Adults have higher values of total plasmatic protein, leukocytes, packed cell volume, hemoglobin, erythrocytes, albumin, total protein and GGT than young animals. The Young have higher platelets, globulin and AP. Animals from the fragmented area present lower body mass and lower levels of albumin than those from the conserved Forest. The opposite occurred for GGT and globulin. Babesia sp. were found in 26.6% of specimens, more frequently in adults. These results are the very first reportof hematologic and serum chemistry values for D. aurita in Serra dos Órgãos.

Por que os trópicos sustentam tanta diversidade? Essa é a pergunta principal que motivou este trabalho. Uma das frentes para contribuir ao entendimento deste fenômeno é estudar a origem da diversidade. Diversas hipóteses de diversificação existem, e existe também uma acalorada discussão no campo de estudo que busca testar essas diferentes hipóteses. Uma das hipóteses mais conhecida, se também não a mais polêmica, é a Hipótese de Refúgios. O objetivo deste trabalho foi, portanto, testar a Hipótese de Refúgios na Floresta Atlântica através de um estudo de caso. Para tanto, inicialmente os padrões de distribuição morfológica e genética do marsupial Didelphis aurita Wied, 1826 foram investigados através do método de quadrantes. As medidas cranianas revelaram uma correlação longitudinal para fêmeas, mas ausência de associação geográfica na variação do crânio dos machos. Entretanto, complementarmente, outro critério foi utilizado. Através de uma Análise de Componentes Principais sobre a variação da latitude e longitude resumiu-se a variação geográfica em apenas uma variável. Esta acaba se refletindo em uma diagonal da latitude e longitude, que acompanha a própria distribuição da Floresta Atlântica na costa brasileira. Agora, os grupos são formados se apresentam diferenças significativas ao longo desta diagonal, permitindo que populações biológicas distintas, mas próximas geograficamente, sejam separadas. Assim, verificou-se que a associação longitudinal das fêmeas provém basicamente da diferenciação das populações da Bahia, e mais, isso também afeta os machos. Contudo, o sinal não aparece através do outro critério devido ao fato de machos também apresentarem diferenciações em menor escala dentro da distribuição ao sul da Bahia, possivelmente devido à presença do ecótone entre a Floresta Atlântica e o cerrado latu sensu. Por usa vez, os dados genéticos como explorados através da variação geográfica do marcador mitocondrial citocromo B, revelaram que também existe uma associação com a longitude, e novamente, ela provém principalmente da diferenciação dos extremos da distribuição. Aqui, não só a mesma quebra na Bahia aparece, mas também uma outra quebra mais ao norte, de indivíduos provenientes de Alagoas. Tanto para os dados morfológicos quanto para os moleculares, demonstrou-se que há isolamento por distância no gambá, entretanto, toda a distribuição ao sul da Bahia se comporta como uma grande população panmítica. Essa ausência de estruturação geográfica, também aparente em análises de diferenciação (Fst), unidas aos testes de neutralidade (D de Tajima e F de Fu) negativos e significativos, que dão sinal de expansão demográfica recente mostram, juntos, as assinaturas esperadas pela Hipótese de Refúgios. Contudo, a divergência entre as populações deste sul datam de aproximadamente 140.000≅60.000 anos, o que não pode ser atribuída como sendo reflexo do último interglacial, esperado em cerca de 20.000 anos. Explorando mais a fundo as análises de Fst e os testes de neutralidade, revelou-se que suas estimativas são altamente influenciadas por desbalanço no tamanho de amostras, assim como baixa representatividade e agrupamentos inadequados que unem populações biológicas distintas. Os aparentes sinais de refúgios obtidos foram, portanto, artefato de três população bem amostradas no Rio de Janeiro. Sendo assim, não se pode atribuir esta hipótese como tendo criado diversidade dentro da espécie D. aurita. / How can the tropics present such diversity? This question lies at the very core of this work. While for the origins of diversity, numerous hypotheses have been put forward over time, the pursuit of empirical proofs for them is almost as old as the hypotheses themselves. One of the better known such hypothesis, and at the same time one of the most controversial, is the Refugee Hypothesis. In this context, the main goal of this thesis has been to test the Refugee Hypothesis in the Atlantic Forest by means of a study case. Initially, the morphologic and genetic distribution patterns of Didelphis aurita Wied, 1826 marsupial have been investigated using the grids method. Cranial measurements revealed a longitudinal correlation for the females and, at the same time, the absence of any geographic correlation in the variation of male skulls. By means of a Principal Component Analysis, the latitudinal and longitudinal variations have been reduced to a geographical variation dependent on one variable only _ a diagonal that follows the extension of the Atlantic Forest along the Brazilian coast. Groups have been formed if they presented significant differences along this diagonal, thus allowing distinct, but geographically close populations, to be differentiated. It could hereby be proven that the longitudinal correlation for females reflects mainly the differentiation between populations from Bahia state, and even more, that this differentiation affects the males as well. The signature does not appear in the grid criterium for the males since they also present lower levels of differentiation in the south of Bahia, possibly due to the presence of the ecotone of the Atlantic Forest with the cerrado latu sensu biome. There is, nevertheless, a break in Bahia for both males and females. As for the geographic variation of the molecular mitochondrial marker cytochrome B, it also presented a longitudinal variation, and a clear differentiation between the two extremes of the analyzed distribution. Here, not only a similar break could be seen in Bahia, but another one further north in the specimens from Alagoas state. For both the morphological and the molecular data, while there is isolation by distance effect for the opossum, all the distribution south of Bahia behaves as a large panmitic population. This lack of geographical structuring, also apparent in differentiation analyzes (Fst), together with neutrality tests (Tajima\'s D and Fu\'s F) which point towards recent geographic expansion, show the signatures expected by the Refugee Hypothesis. Since, however, the data indicates that the divergence of southern populations occurred approximately 140,000≅60,000 years ago, the diversification cannot be due to the last inter-glacial period from 20,000 years ago. To understand this seeming contradiction, further in-depth investigations of the Fst analyzes and the neutrality tests revealed that the estimations had been highly influenced by the heterogeneity in the number of samples, as well as by the low representability of some localities and also inadequate grouping of specimens, which mixed distinct biological populations. The apparent refugee signatures have thus been the misleading consequence of three well-sampled populations from Rio de Janeiro state. Therefore, the Refugee Hypothesis cannot be regarded as an explanation for the existing diversity of the species D. aurita.