Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente consideradas como potenciais sistemas de liberação de oligonucleotídeos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência da adição de quantidades crescentes dos lipídeos catiônicos estearilamina (EA), oleilamina (OA) ou DOTAP (DT) sobre propriedades físico-químicas de nanoemulsões como sistemas de liberação de um oligonucleotídeo modelo (pdT16). As formulações foram preparadas pelo procedimento de emulsificação espontânea. As nanoemulsões constituídas de triglicerídeos de cadeia média, lecitina de gema de ovo, glicerol, quantidades crescentes dos lipídeos catiônicos (até 20 mM) e água foram caracterizadas em termos de diâmetro médio, pH, potencial zeta e viscosidade. Baseado nos resultados obtidos, as formulações contendo EA, OA e DT na concentração de 2 mM foram selecionadas para a continuidade do trabalho, uma vez que apresentam diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e 40-50 mV, respectivamente. A taxa de associação do pdT16 às nanoemulsões foi determinada, indiretamente, pelo doseamento deste, na fase aquosa externa após separação em membranas de ultrafiltração/centrifugação, por meio de espectrofotometria no UV. A maior taxa de associação do pdT16 foi detectada para a formulação contendo o lipídeo catiônico DT (até ~70 mg/g de fase interna). Evidências adicionais da associação do pdT16 com as nanoemulsões foram detectadas pelo aumento do diâmetro de gotícula, inversão do potencial zeta e morfologia das gotículas. Em uma última etapa, um estudo preliminar da liberação do pdT16 foi realizado especialmente para a formulação contendo o lipídeo catiônico DT. O fator de diluição e relação de cargas [+/-] foram identificados como os principais parâmetros que influenciam a liberação do pdT16 a partir das nanoemulsões. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra a influência da concentração e da natureza do lipídeo catiônico empregado sobre as propriedades físico-químicas de nanoemulsões catiônicas como sistemas de liberação de oligonucleotídeos.

Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente consideradas como potenciais sistemas de liberação de oligonucleotídeos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência da adição de quantidades crescentes dos lipídeos catiônicos estearilamina (EA), oleilamina (OA) ou DOTAP (DT) sobre propriedades físico-químicas de nanoemulsões como sistemas de liberação de um oligonucleotídeo modelo (pdT16). As formulações foram preparadas pelo procedimento de emulsificação espontânea. As nanoemulsões constituídas de triglicerídeos de cadeia média, lecitina de gema de ovo, glicerol, quantidades crescentes dos lipídeos catiônicos (até 20 mM) e água foram caracterizadas em termos de diâmetro médio, pH, potencial zeta e viscosidade. Baseado nos resultados obtidos, as formulações contendo EA, OA e DT na concentração de 2 mM foram selecionadas para a continuidade do trabalho, uma vez que apresentam diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e 40-50 mV, respectivamente. A taxa de associação do pdT16 às nanoemulsões foi determinada, indiretamente, pelo doseamento deste, na fase aquosa externa após separação em membranas de ultrafiltração/centrifugação, por meio de espectrofotometria no UV. A maior taxa de associação do pdT16 foi detectada para a formulação contendo o lipídeo catiônico DT (até ~70 mg/g de fase interna). Evidências adicionais da associação do pdT16 com as nanoemulsões foram detectadas pelo aumento do diâmetro de gotícula, inversão do potencial zeta e morfologia das gotículas. Em uma última etapa, um estudo preliminar da liberação do pdT16 foi realizado especialmente para a formulação contendo o lipídeo catiônico DT. O fator de diluição e relação de cargas [+/-] foram identificados como os principais parâmetros que influenciam a liberação do pdT16 a partir das nanoemulsões. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra a influência da concentração e da natureza do lipídeo catiônico empregado sobre as propriedades físico-químicas de nanoemulsões catiônicas como sistemas de liberação de oligonucleotídeos.

Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente consideradas como potenciais sistemas de liberação de oligonucleotídeos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência da adição de quantidades crescentes dos lipídeos catiônicos estearilamina (EA), oleilamina (OA) ou DOTAP (DT) sobre propriedades físico-químicas de nanoemulsões como sistemas de liberação de um oligonucleotídeo modelo (pdT16). As formulações foram preparadas pelo procedimento de emulsificação espontânea. As nanoemulsões constituídas de triglicerídeos de cadeia média, lecitina de gema de ovo, glicerol, quantidades crescentes dos lipídeos catiônicos (até 20 mM) e água foram caracterizadas em termos de diâmetro médio, pH, potencial zeta e viscosidade. Baseado nos resultados obtidos, as formulações contendo EA, OA e DT na concentração de 2 mM foram selecionadas para a continuidade do trabalho, uma vez que apresentam diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e 40-50 mV, respectivamente. A taxa de associação do pdT16 às nanoemulsões foi determinada, indiretamente, pelo doseamento deste, na fase aquosa externa após separação em membranas de ultrafiltração/centrifugação, por meio de espectrofotometria no UV. A maior taxa de associação do pdT16 foi detectada para a formulação contendo o lipídeo catiônico DT (até ~70 mg/g de fase interna). Evidências adicionais da associação do pdT16 com as nanoemulsões foram detectadas pelo aumento do diâmetro de gotícula, inversão do potencial zeta e morfologia das gotículas. Em uma última etapa, um estudo preliminar da liberação do pdT16 foi realizado especialmente para a formulação contendo o lipídeo catiônico DT. O fator de diluição e relação de cargas [+/-] foram identificados como os principais parâmetros que influenciam a liberação do pdT16 a partir das nanoemulsões. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra a influência da concentração e da natureza do lipídeo catiônico empregado sobre as propriedades físico-químicas de nanoemulsões catiônicas como sistemas de liberação de oligonucleotídeos.

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4409_1.pdf: 676822 bytes, checksum: 4a1153b3912f6483c79f20c422b118f1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2002 / Oligonucleotídeos foram construídos com base na sequência primária do gene codificando o rRNA de Plasmodium para amplificar DNA de P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale, de maneira gênero-específica. Três sistemas de PCR foram utilizados: PCR simples, hemi-nested PCR convencional e hemi-nested PCR em um único tubo, desenvolvidos em nosso laboratório. Na PCR simples, composta de 30 ciclos, foram utilizados os oligonucleotídeos GJ1 e HR842 (20 pmol/50μl), já testados por nosso grupo. Na hemi-nested PCR convencional utilizou-se três oligonucleotídeos (GJ1, PGFO3 e HR842), em duas reações sequenciais, sendo o PGFO3 construído durante o desenvolvimento do presente trabalho, visando a detecção do gênero Plasmodium. O par GJ1 e HR842 foram utilizados como oligonucleotídeos externos na primeira reação, e o PGFO3 como interno, ancorado ao HR842 na segunda reação. A hemi-nested PCR em um único tubo consistiu em 60 ciclos (92ºC, 30s; 58ºC, 30s e 72ºC, 45s), e concentrações limitantes de oligonucleotídeos externos (4 pmols/50μl) participavam da PCR sem competição com os oligonucleotídeos internos durante os primeiros 15 ciclos da reação e 40 pmol/50μl de primers internos (imobilizados na face interna da tampa do microtubo) foram introduzidos na PCR no 16º ciclo. As concentrações dos outros componentes da reação foram as mesmas utilizadas nas reações convencionais de PCR. Observou-se que a quantidade mínima de DNA genômico detectada pela PCR simples, hemi-nested PCR e hemi-nested PCR em um único tubo foi de 10 pg; 0,01 pg e 0,1 pg, respectivamente. Apesar da hemi-nested PCR em um único tubo ter sido menos sensível que a heminested PCR convencional, é muito mais simples e conveniente, já que o risco de contaminação cruzada é bem menor. Esses sistemas moleculares de diagnóstico podem ser usados em situações quando se requer uma alta sensibilidade e especificidade, tais como na avaliação da eficiência de quimioterapia, detecção precoce de infecção e prevenção de transmissão a partir de pacientes hipoparasitêmicos

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-12-09. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:09Z : No. of bitstreams: 1 000870495.pdf: 1494495 bytes, checksum: 3b9f9ca073de023b7bdc8087537f82c7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Leishmaniasis, a disease caused by the protozoan Leishmania spp. is expanding in the world and affects millions of people annually, reaching 98 countries in tropical and subtropical regions, representing an important public health problem. Subspecies Leishmania and Viannia, represented by at least 22 species, are responsible for the three most common clinical manifestations of the disease in humans. Routinely, in endemic areas, serological diagnosis are employed. However, other parasitological and/or molecular techniques have high sensitivity to identify the genus Leishmania. The publication of Leishmania genomes have provided a better understanding of their composition and molecular markers to identify protozoan species and intra-specific variations, however some species are still underdiagnosed. However, the differentiation of Leishmania species in clinical samples still has limitations. Thus, in order to find the solution for this issue, we sought to design specific sequences for different species of Leishmania deposited in trypanosomatid genomic database, carrying out an in silico assay for verification of the selected sequences. The information generated in this study will constitute an interesting diagnostic platform, after proper validation with clinical samples

Resumo:eishmaniose, doença causada pelo protozoário Leishmania spp., encontra-se em franca expansão no mundo e acomete milhões de pessoas anualmente, atingindo 98 países de regiões tropicais e subtropicais, representando um importante problema de Saúde Pública. As subespécies Leishmania e Viannia apresentam, no mínimo, 22 espécies, que são responsáveis pelas três manifestações clínicas mais comuns da doença para humanos. Rotineiramente, em áreas endêmicas, o diagnóstico laboratorial sorológico é empregado, porém, outras técnicas parasitológicas e/ou moleculares tem alta sensibilidade para identificação do gênero Leishmania. A publicação de genomas de Leishmania proporcionou um maior conhecimento de regiões e marcadores para identificação de espécies do protozoário e variações intra-específicas, todavia algumas espécies ainda tem sido subdiagnosticadas. Entretanto, a diferenciação das espécies de Leishmania em amostras clínicas ainda apresenta limitações. Assim, com o intuito de auxiliar na solução desta questão, buscamos sequências específicas para diferentes espécies de Leishmania depositadas em banco de dados genômicos de tripanossomatídeos e realizamos um ensaio in silico para verificação das nossas sequências. As informações geradas neste trabalho serão úteis numa plataforma diagnóstica para que sejam validadas com amostras clínicas. / Abstract:Leishmaniasis, a disease caused by the protozoan Leishmania spp. is expanding in the world and affects millions of people annually, reaching 98 countries in tropical and subtropical regions, representing an important public health problem. Subspecies Leishmania and Viannia, represented by at least 22 species, are responsible for the three most common clinical manifestations of the disease in humans. Routinely, in endemic areas, serological diagnosis are employed. However, other parasitological and/or molecular techniques have high sensitivity to identify the genus Leishmania. The publication of Leishmania genomes have provided a better understanding of their composition and molecular markers to identify protozoan species and intra-specific variations, however some species are still underdiagnosed. However, the differentiation of Leishmania species in clinical samples still has limitations. Thus, in order to find the solution for this issue, we sought to design specific sequences for different species of Leishmania deposited in trypanosomatid genomic database, carrying out an in silico assay for verification of the selected sequences. The information generated in this study will constitute an interesting diagnostic platform, after proper validation with clinical samples / Orientador:Caris Maroni Nunes / Banca:Flávia Lombardi Lopes / Banca:Vania Lúcia Ribeiro da Matta / Banca:Rodrigo Martins Soares / Banca: Valéria Marçal Felix de Lima / Doutor

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-03-11T13:21:34Z No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-03-11T13:21:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-03-11T13:21:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-11T13:21:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2013-08-09 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Antisense oligonucleotides have great potential for use as therapeutic agents. The DNAzymes 10-23 are antisense molecules with improved chemical stability and catalytic efficiency. This work developed a system for DNAzymes expression regulated by two promoters built within a phagemid, which was called pDESCP. The expression of MoMuLV-RT enzyme occurs in a constitutively way through the pA1 promoter. The second cassette, regulated by the lac promoter, expresses an RNA transcript that will give origin at DNAzyme. MoMuLV-RT will act on the RNA substrate, and then DNAzymes are produced by reverse transcription. The DNAzyme ftsZ, used to validate this system, was efficiently expressed and able to change the morphology of Escherichia coli, which went from bacillary to filamentous form. When properly packaged by M13 phage, pDESCP was used to transfect different strains of E. coli F+. In vitro kinetic assays involving DNAzymes with target on transcripts of alanine racemase genes of E. coli, alr e dadX, showed no conclusive results. This made it impossible for these were tested on the phagemid. The forwarding of pDESCP for E. coli F+ and the possibility of inserting new DNAzymes in its structure make this phagemid an important prototype for phage therapy. Provided that lethal DNAzymes are developed against E. coli, these can be inserted into pDESCP and turn it into a powerful tool able to prevent the transmission of pathogenic genes from bacteria that transfer by conjugation / Os oligonucleotídeos antissenso apresentam grande potencial para serem utilizados como agentes terapêuticos. As DNAzimas 10-23 são as moléculas antissenso com maior estabilidade química e eficiência catalítica. Neste trabalho foi desenvolvido um sistema para a expressão de DNAzimas regulado por dois promotores, construído dentro de um fagomídeo que foi denominado pDESCP. A expressão da enzima MoMuLV-RT ocorre de forma constitutiva, por meio do promotor pA1. O segundo cassete, regulado pelo promotor lac, expressa um transcrito de RNA que originará a DNAzima. MoMuLV-RT atuará sobre o substrato de RNA, produzindo DNAzimas por meio da transcrição reversa. A DNAzima ftsZ, utilizada para validar esse sistema, foi eficientemente expressa e capaz de alterar a morfologia de Escherichia coli, que passou da forma bacilar para a filamentosa. Quando devidamente encapsidado pelo fago M13, pDESCP foi utilizado para transfectar diferentes linhagens E. coli F+. Ensaios cinéticos in vitro envolvendo DNAzimas com alvo sobre os transcritos dos genes de alanina racemase de E. coli, alr e dadX, não demonstraram resultados conclusivos. Isto impossibilitou que estas fossem testadas no fagomídeo. A veiculação de pDESCP para E. coli F+ e a possibilidade de inserção de novas DNAzimas em sua estrutura transformam este fagomídeo em um importante protótipo para a fagotarapia. Na condição de que DNAzimas letais sejam desenvolvidas contra E. coli, estas podem ser inseridas em pDESCP e transformá-lo em uma poderosa ferramenta capaz de impedir a transmissão de genes de patogenicidade, a partir de bactérias conjugativas.

Em Escherichia coli, a assimilação de sulfato e sua redução a sulfeto é mediada por um transportador do tipo ABC codificado pelos genes sbpcysWUA e várias enzimas codificadas por cysNCDGHIJ. Embora a importância deste sistema tenha sido largamente demonstrada em outros organismos, não existem relatos na literatura sobre a via na bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri). Neste trabalho, utilizando uma abordagem funcional baseada em análises de bioinformática, proteômica e gene repórter, mostramos que a via de sulfato está presente e ativa em X. citri. Ainda, a partir da expressão e produção em larga escala da proteína ligadora de sulfato Sbp, realizamos ensaios de biofísica que evidenciaram a interação da proteína com sulfato e o aumento da estabilidade térmica e estrutural, obtendo-se cristais. O trabalho apresenta as primeiras evidências da funcionalidade desta via em X. citri durante o crescimento in vitro e infecção in vivo e abre pespectivas de estudos para compreensão do papel deste íon na fisiologia do microrganismo. / In Escherichia coli, the capture and reduction of sulfate to sulfide is mediated by an ABC-type transporter encoded by genes sbpcysWUA and several enzymes encoded by cysNCDGHIJ. Although the importance of this system has been widely demonstrated in other organisms, there are no reports in the literature related to the way that sulfate is assimilated and reduced in plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri). In this work, using a functional approach based on bioinformatics analysis, proteomics and gene reporter, we show that the way is present and active in X. citri. Indeed, the sulfate binding protein was expressed and produced in large scale for biophysical assays demonstrating the interaction of the protein with sulfate and increased thermal stability and crystals was produced. The study presents the first evidence of the functionality of this pathway in X. citri during growth in vitro and in vivo infection and opens perspectives studies to understand the role of this ion in the physiology of the microorganism.

Em Escherichia coli, a assimilação de sulfato e sua redução a sulfeto é mediada por um transportador do tipo ABC codificado pelos genes sbpcysWUA e várias enzimas codificadas por cysNCDGHIJ. Embora a importância deste sistema tenha sido largamente demonstrada em outros organismos, não existem relatos na literatura sobre a via na bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri). Neste trabalho, utilizando uma abordagem funcional baseada em análises de bioinformática, proteômica e gene repórter, mostramos que a via de sulfato está presente e ativa em X. citri. Ainda, a partir da expressão e produção em larga escala da proteína ligadora de sulfato Sbp, realizamos ensaios de biofísica que evidenciaram a interação da proteína com sulfato e o aumento da estabilidade térmica e estrutural, obtendo-se cristais. O trabalho apresenta as primeiras evidências da funcionalidade desta via em X. citri durante o crescimento in vitro e infecção in vivo e abre pespectivas de estudos para compreensão do papel deste íon na fisiologia do microrganismo. / In Escherichia coli, the capture and reduction of sulfate to sulfide is mediated by an ABC-type transporter encoded by genes sbpcysWUA and several enzymes encoded by cysNCDGHIJ. Although the importance of this system has been widely demonstrated in other organisms, there are no reports in the literature related to the way that sulfate is assimilated and reduced in plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri). In this work, using a functional approach based on bioinformatics analysis, proteomics and gene reporter, we show that the way is present and active in X. citri. Indeed, the sulfate binding protein was expressed and produced in large scale for biophysical assays demonstrating the interaction of the protein with sulfate and increased thermal stability and crystals was produced. The study presents the first evidence of the functionality of this pathway in X. citri during growth in vitro and in vivo infection and opens perspectives studies to understand the role of this ion in the physiology of the microorganism.

Nanoemulsões catiônicas têm sido consideradas como potenciais sistemas carreadores para oligonucleotídeos (ON) antisenso. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver nanoemulsões catiônicas como um sistema de liberação para ON anti-topoisomerase II de Plasmodium falciparum. Primeiramente, nanoemulsões constituídas de triglicerídeos de cadeia média, lecitina de gema de ovo, glicerol e água contendo os lipídeos catiônicos oleilamina ou DOTAP (2 mM) foram obtidas através do procedimento de emulsificação espontânea. Este procedimento resultou em formulações monodispersas com diâmetro de gotícula de 200-260 nm e potencial zeta de +50 e +55 mV. Após, um método espectrofotométrico no UV para quantificação dos ON em série fosfodiéster (PO) ou fosforotioato (PS) foi validado. O método mostrou-se linear, específico, preciso e exato para a determinação de PO e PS, sem diferenças significativas entre os ON. Nas condições validadas, as isotermas de adsorção dos ON às nanoemulsões foram obtidas através da determinação dos ON na fase aquosa externa das nanoemulsões, após ultrafiltração/centrifugação dos complexos. A taxa de recuperação através das membranas de ultrafiltração de celulose regenerada (30 kDa) foi superior a 92%. Os resultados indicam a adsorção progressiva dos ON com as nanoemulsões, até cerca de 60 mg/g de fase interna para o complexo DOTAP-PS. Finalmente, evidências adicionais da adsorção de PO e PS às nanoemulsões foram detectadas pelo aumento do diâmetro de gotícula, inversão do potencial zeta e morfologia das gotículas avaliada por microscopia eletrônica de transmissão. O conjunto dos resultados obtidos demonstra que ON de série PO e PS anti-topoisomerase II de P. falciparum podem ser adsorvidos eficientemente às nanoemulsões catiônicas. / Cationic nanoemulsions have been recently considered as a potential delivery system for antisense oligonucleotides (ON). The aim of the present work was to evaluate cationic nanoemulsions as a delivery system for ON against the Plasmodium falciparum topoisomerase II gene. Firstly, nanoemulsions composed of medium chain triglycerides, egg yolk lecithin, glycerol and water, containing the cationic lipids oleylamine or DOTAP (2 mM) were obtained through spontaneous emulsification process. This procedure resulted in monodisperse formulations with droplet size of 200-260 nm and zeta potential of +50 and +55mV. After that, an UV spectrophotometric method for the quantification of either phosphodiester (PO) or phosphorothioate (PS) ON was validated. The method was linear, specific, precise, and accurate for the determination of PO and PS, without significant differences between both ON. In the validated conditions, ON adsorption isotherms with nanoemulsions were obtained through the ON determination in the external phase of nanoemulsions, after ultrafiltration/centrifugation of complexes. The recovery through regenerated cellulose membranes (30kDa) was higher than 92%. The results showed a progressive ON adsorption to the nanoemulsions up to approximately 60mg/g of internal phase for DOTAP-PS complexes. Finally, additional evidences of PO and PS adsorption to nanoemulsions could also be detected by the increase of the mean droplet size, the inversion of the zeta potential and the morphology of the oil droplets obtained by transmission electron microscopy. The overall results showed that PO and PS ON against P. falciparum anti-topoisomerase II gene can be efficiently adsorbed to the cationic nanoemulsions.