Οι επισωματικοί φορείς αποτελούν την εναλλακτική επιλογή για την μεταφορά γονιδίων σε εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας. Διπλασιάζονται αυτόνομα χωρίς να ενσωματώνονται στα χρωμοσώματα του κυττάρου και έτσι στερούνται της σοβαρής παρενέργειας του φαινομένου της μεταλλαξιγένεσης μέσω ενσωμάτωσης. Το ενδιαφέρον ως προς την ανάπτυξη επισωματικών φορέων για την γονιδιακή μεταφορά αυξήθηκε κατακόρυφα τα τελευταία χρόνια μετά την ανάπτυξη του φορέα pEPI-1, ο οποίος περιείχε το στοιχείο S/MAR του γονιδίου της ανθρώπινης βήτα- ιντερφερόνης. Ο φορέας αυτός είχε την ιδιότητα να διατηρείται επισωματικά χωρίς την ανάγκη μεταγραφής κάποιου ιϊκού γονιδίου. Τα στοιχεία S/MAR αποτελούν ετερογενείς περιοχές DNA οι οποίες συνδέονται στην θεμέλια ουσία του πυρήνα, συμμετέχοντας στην οργάνωση του ευκαρυωτικού γονιδιώματος, στην αντιγραφή του DNA και στην ρύθμιση της μεταγραφής. Αποφασίσαμε στην μελετήσουμε την δράση του S/MAR στοιχείου σε ένα διαφορετικό περιβάλλον DNA. Ξεκινώντας από τον φορέα pCEP4 που βασίζεται στα στοιχεία OriP και EBNA-1 του ιού η EBV κατασκευάσαμε τα εξής πλασμίδια: 1) pEBS/eGFP με το S/MAR να είναι κλωνοποιημένο μετά το γονίδιο της eGFP όπως στο pEPI-1. 2) pESdER / eGFP προερχόμενο από το pEBS/eGFP με διαγραφή του γονιδίου EBNA-1 και.3) pCEP4 / eGFP (πλασμίδιο μάρτυρας). Σε αντίθεση με τις προσδοκίες μας μόνο το πλασμιδίου pCEP4 / eGFP ήταν ικανό να εγκαταστήσει σταθερές κυτταρικές σειρές Jurkat. Ο υπολογισμός της αποσταθεροποίησης υπό τάση των παραπάνω πλασμιδίων απέδειξε μια υψηλή ουδό για την αποσταθεροποίηση της περιοχής του OriP, σε αντίθεση με το μητρικό φορέα pCEP4, γεγονός που οφείλεται στον ενεργειακό ανταγωνισμό μεταξύ του OriP και της υψηλά αποσταθεροποιημένης περιοχής του S/MAR. Η αντικατάσταση του OriP στο πλασμίδιο pESdER / eGFP από την περιοχή έναρξης της αντιγραφής το γονίδιο της β-σφαιρίνης (IR) (pESdER-IR/eGFP) έχει ως αποτέλεσμα την αποκατάσταση της επισωματική της κατάστασης, προσδίδοντας επιπλέον και υψηλή μιτωτική σταθερότητα χωρίς την ανάγκη ύπαρξης πίεσης επιλογής σε καλλιέργειες για χρονικό διάστημα τριών μηνών. Συμπεράνουμε ότι το δυναμικό πολλαπλασιασμού ενός επισωματικού συστήματος που περιέχει ένα στοιχείο S/MAR εξαρτάται από την ύπαρξη μιας δεύτερης υψηλά αποσταθεροποιημένης έννοιες περιοχής ικανής να ξεπεράσει την σταθεροποιητική δράση της αλληλουχίας S/MAR. Το γεγονός αυτό προσδίδει μια νέα διάσταση στη σχεδίαση αυτόνομων επισωματικών φορέων, που περιέχει τον υπολογισμό της αποσταθεροποίησης της διπλής έλικας DNA υπό τάση. Η ευρεία χρήση των ρετρο-ιϊκών φορέων ως συστήματα γονιδιακής μεταφοράς σε κλινικές δοκιμές γονιδιακής θεραπείας έφερε στην επιφάνεια την ανάγκη για μια ακριβή εκτίμηση της ασφάλειας των δοκιμών αυτών όσον αφορά το φαινόμενο της μεταλλαξιγένεσης μέσω ενσωμάτωσης. Στην εργασία αυτή αναφέρεται μια νέα μέθοδος για την ανίχνευση των θέσεων ενσωμάτωσης των ρετρο-ιϊκών φορέων που έχει κλινικό προσανατολισμό και ονομάζεται DSCP-PCR( partially Double stranded, Sterically Hindered Primer – PCR). Η μέθοδος αυτή έχει αυξημένη ευαισθησία και ειδικότητα, δεδομένου ότι δεν εξαρτάται από στάδια κατάτμησης με ένζυμα περιορισμού και αντιδράσεις λιγάσης που αποτελούν μέρος των υπαρχόντων μεθόδων (όπως η LAMPCR). Η μείζονα διαφορά ανάμεσα στην DSCP-PCR και στις προηγούμενες PCR μεθόδους συνιστάται στο στάδιο της σύνδεσης της συμπληρωματικής αλυσίδας του DNA όπου χρησιμοποιείται ένας εκκινητής που το ένα άκρο του είναι εκφυλισμένο ενώ το άλλο αποτελείται από διπλή έλικα DNA. Η σχεδίαση αυτή τον καθιστά ικανό να προσδένεται μόνο στο άκρο οποιασδήποτε μονής αλυσίδας. Η μέθοδος αυτή παράγει ένα υψηλά πληροφοριακό σύνολο δεδομένων για τον χαρακτηρισμό των θέσεων ενσωμάτωσης των φορέων. Επίσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σύνθεση του προφίλ των κλώνων που συμμετέχουν στην αιμοποίηση σε κάποια χρονική περίοδο. Η παρακολούθηση το προφίλ αυτού μέσα στον χρόνο δίνει ενδείξεις για την κινητική της αιμοποίησης και κατά συνέπεια της εμφάνιση νέων κλώνων. / Episomal vectors have been considered valid alternatives to viral vectors for gene therapy applications, as they are replicating extrachromosomally and are devoid of the adverse effect of insertional mutagenesis. Interest in the episomal systems was boosted by the development of the pEPI-1 vector, containing the scaffold matrix attachment region (S/MAR) element of the human beta-interferon gene, which confers to it stable episomal status, without the need for transcription of any viral element. S/MARs are heterogeneous DNA regions that attach to the nuclear matrix, participating in the organization of the eukaryotic genome, initiation of DNA replication and regulation of transcription. We decided to study the performance of the S/MAR element in a completely different vector DNA context. Starting from vector pCEP4 (Invitrogen) based on OriP EBV and EBNA-1 latent retention system, we constructed plasmids: (1) pEBS/eGFP with SMAR element cloned after eGFP gene as in pEPI-1. (2) pESdER/eGFP derived from pEBS/eGFP by deletion of EBNA-1 gene and (3) pCEP4/eGFP as reporter plasmid. Contrary to expectations, only plasmid (3) was able to establish stable Jurkat cell line cultures. Calculation of stress-induced duplex destabilization of the above plasmids demonstrated a high threshold for the destabilization of the OriP region, unlike the parental vector pCEP4, caused by the energy competition of OriP with the highly destabilized S/MAR region. Substitution of OriP in plasmid (2) with the β-globin initiation region (IR) (pESdER-IR/eGFP) results in the restoration of episomal status, providing high mitotic stability without selection pressure for up to 3 months of culture. We deduce that the replication potential of an episomal system carrying an S/MAR element depends on the existence of highly destabilized vector sequences, sufficient to counteract the S/MAR effect of stabilization on vector’s DNA backbone molecule and maintain the plasmid’s accessibility to the cellular replication machinery. Thus emerges the concept of including the calculation of stress-induced duplex destabilization in the design of self-replicative extrachromosomal units. The widespread use of retroviral-based vectors as gene transfer systems in the context of gene therapy clinical trials has emerged the need for accurately assessing their safety profile in order to identify the potential risks of insertional mutagenesis. Here we report a new PCR - based method, DSHP-PCR ( partially Double stranded, Sterically Hindered Primer – PCR), a clinically orientated method for analysing the integration sites with high sensitivity and reliability, devoid of the restriction digestion and cloning bias present in the existing methods. The difference between DSHP-PCR and previous PCR-based methods (such as LAM-PCR) consists in the step of second strand synthesis where the use of a partially double stranded –degenerated primer that binds at the end of the DNA single strands bypasses the need for the restriction digestion step that inserts a bias in integration site detection and for the cassette ligation step that renders the whole procedure inefficient. This method generates a highly informative integration site library used for the sequencing of the human genomic – retroviral junctions, by creating a PCR product pool that contains a high percentage of specific fragments of similar length that can be subcloned with the same efficiency in a sequencing vector. It can also be used for the creation of the clonal composition profile of patient’s each cell lineage in time allowing the monitoring of clonal kinetics of the haematopoietic or immune system by detecting the emergence of new clones that contribute to haematopoiesis.

The circular, single-stranded (ss) DNA genomes of plant viruses in the families Geminiviridae and Nanoviridae are replicated within the nucleus of a host cell by a mechanism called rolling circle replication (RCR). Although this process relies almost exclusively on the replication machinery of the host cell, initiation occurs via the interaction of the viral replication initiation protein (Rep) with regulatory DNA sequences within the viral genome. The use of a virus-based episomal amplification technology as a plant bioreactor platform exploits the process of Rep-mediated RCR for the high-level amplification of virus-based episomes in plants and subsequent expression of heterologous proteins; such an approach offers advantages over existing gene expression technologies. This PhD thesis describes research towards the development of a virus-based episomal amplification system for use in sugarcane. Such a crop is ideally suited for a plant bioreactor system due to the efficient high-level production of plant biomass and the existence of established production, harvesting and processing infrastructure. In order to rapidly assess the potential of a virus-based episomal amplification system in sugarcane, a transient assay system was established. Sugarcane callus was identified as the most suitable cell preparation; providing rapid cell regeneration, uniform experimental samples and upon isolation, total DNA suitable for Southern analysis. This assay system once established, proved effective in rapidly identifying virus-based episomes capable of undergoing RCR within sugarcane host cells. This transient assay system was then used to test the functionality of a virus-based episomal amplification system based on the ssDNA virus, Banana bunchy top virus (BBTV) in sugarcane. BBTV-based episomal amplification vectors were constructed with a reporter gene expression cassette flanked by two copies of the BBTV regulatory DNA sequences. The episomal amplification vectors were bombarded into sugarcane and banana host cells in various combinations and evidence of RCR was assessed through Southern blot analysis. RCR products were identified in banana host cells bombarded with the BBTV-based episomal amplification vectors in combination with vectors encoding BBTV Master-Rep (M Rep). RCR products were not identified within sugarcane cells bombarded with the same construct combinations. Integrated InPAct (In Plant Activation) episomal vectors based on BBTV were then employed to confirm the transient results, in addition, the functionality of an InPAct vector based on an alternate virus, Tobacco yellow dwarf virus (TYDV) was also assessed. InPAct vectors based on BBTV were constructed with an untranslatable expression cassette for integration within the sugarcane genome. Transient experiments were performed to assess the ability of BBTV M-Rep and TYDV Rep to initiate RCR of their respective InPAct vectors. Visual observation of GFP expression indicated that BBTV M-Rep was capable of initiating RCR of the BBTVbased InPAct vectors within banana host cells but no evidence was observed in sugarcane host cells. TYDV Rep was capable of initiating RCR of the TYDV-based InPAct vector within sugarcane host cells with a 100-fold increase in the number of fluorescent foci compared to cells bombarded with the TYDV InPAct vector alone. The BBTV-based InPAct vector was stably integrated within the sugarcane genome and the ability for BBTV M-Rep to initiate episome formation and RCR was assessed by Southern blot analysis. Evidence of BBTV M-Rep mediated RCR was not detected within the transgenic sugarcane bombarded with BBTV M-Rep. Transgenic sugarcane containing the TYDV-based InPAct vectors was assessed for the ability to be activated by TYDV Rep and undergo RCR. Southern blot analysis demonstrated that TYDV Rep was capable of recognising the integrated TYDVbased InPAct vector and RCR was detected within the transgenic sugarcane. The observation that episomal vectors based on TYDV were functional within sugarcane host cells and BBTV-based vectors were not, was unexpected. It had been hypothesised that an episomal vector based on a monocot-infecting virus would replicate in an alternate monocot host, while an episomal vector based on a dicot infecting virus would not. Virus replication is thought to be host-specific however most host range studies have been conducted with full length infectious clones and not deconstructed virus-based episomes. The implication that viral Reps may be functional in plant cells of non-host species was then investigated. The ability for viral Reps to recognise their cognate IR and initiate RCR of virus-based episomes in different host cells was assessed through cross-replication experiments. Four ssDNA plant viruses; BBTV, TYDV, Chloris striate mosaic virus (CSMV) and Tomato leaf curl virus - Australia (ToLCV-Au) were assessed via Southern blot analysis for their ability to initiate both autonomous replication of infectious clones and episomal amplification within three different plant hosts; tobacco, sugarcane and banana. Results from cross replication studies indicated a complex interaction between viral and host replication components. BBTV infectious clones and episomal vectors were restricted to replication within banana host cells providing a clear indication that episomal amplification vectors based on BBTV are restricted to Musa spp. BBTV M-Rep was unable to recognise the viral regulatory DNA sequences of the other three ssDNA viruses. TYDV infectious clones and episomal vectors were capable of replicating within all three host cells tested, indicating that TYDV is capable of undergoing RCR within a broad range of plant hosts. TYDV Rep was also capable of recognising the viral regulatory DNA sequences of both CSMV and BBTV given favourable conditions within specific plant hosts. Replication of the CSMV infectious clone was not detected in any of the three host cells, although fidelity of this clone requires further confirmation. CSMV episomal vectors were functional within banana host cells only, indicating that although closely related to TYDV, episomal amplification vectors based on CSMV have a restricted host range. CSMV Rep could not initiate RCR of episomal amplification vectors containing the viral regulatory DNA regions of the other three viruses in any of the plant host cells. ToLCV-Au infectious clones were capable of replicating within banana and tobacco host cells. Episomal amplification vectors based on ToLCV-Au extended the host range to sugarcane. ToLCV-Au Rep was unable to recognise the viral regulatory DNA sequences of the other three viruses in any of the plant host cells. The ability for a viral Rep to recognise its own cognate regulatory DNA sequences within alternate plant host cells is variable. Episomal amplification vectors based on TYDV and ToLCV-Au appear to be the most suitable for the further development of a virusbased bioreactor system in sugarcane. This study details the initial steps taken towards the development of a virus-based episomal amplification system in sugarcane. In doing so, fundamental knowledge into the mechanisms involved in Rep recognition of viral regulatory DNA sequences has been gathered. These research findings will provide a solid foundation for the further development of a sugarcane-based bioreactor.

Tο πρώτο μέρος της εργασίας αφορούσε την παρακολούθηση της ερυθρολευχαιμική σειρά ποντικού (MEL) διαμολυσμένη με το επισωματικό αυτό-αναπαραγώμενο όχημα pEPI-EGFP, τα κύτταρα της οποίας δεν παρουσίαζαν φθορισμό ενώ παρέμεναν ανθεκτικά στο αντιβιοτικό (G418). Αποδείχθηκε η επισωματική κατακράτηση του οχήματος για δύο μήνες μετά τη δημιουργία της διαμολυσμένης σειράς. Η διαπίστωση επίσης ότι το μεταφερόμενο γονίδιο μπορεί να μην εκφράζεται αλλά το όχημα να παραμένει για τουλάχιστον 60 ημέρες επισωματικό και χωρίς ενσωμάτωση μας ώθησε σε νέες προοπτικές αναζήτησης. Το δεύτερο μέρος της εργασίας έγινε παρασκευή δύο οχημάτων τα οποία διαφέρουν ως προς τον υποκινητή του γονιδίου αναφοράς ΕGFP τόσο μεταξύ τους όσο και από το όχημα pEPI-EGFP, το βασικό όχημα μελέτης έως τώρα. Η παρασκευή αυτή βασίστηκε στην αντικατάσταση του υποκινητή pCMV από: 1 τον υποκινητή pSFFV για την παρασκευή του οχήματος pEPI-pSFFV και 2 τον υποκινητή της β-σφαιρίνης (pβ-globin) για την παρασκευή του αντίστοιχου οχήματος pEPI-pβ-globin. Η παρασκευή των δύο αυτόν οχημάτων, του pEPI-pSFFV και pEPI-pβ-globin αποτελεί ένα σημαντικό βήμα στη ανάπτυξη νέων οχημάτων που αποτελέσουν οχήματα μεταφοράς γονιδίων σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. / The first part of this work concerned the observation of the mouse erithroid cell line (MEL) transected with the Replicating Episomal Vector pEPI-EGFP. The cells even thought that they had lost their florescence a few days after the transfection with the Vector pEPI-EGFP, they still endure to the antibiotic (G418). In the fist place we have shown that the Replicating Episomal Vector pEPI-EGFP remains in episomatic condition at list two months after the transfect ion of the cell line with out any insertion eventhought the transferred gene is not translated. The second part of this work concerned the construction of two new vectors. The new vectors have the same reference gene with the pEPI-EGFP vector the EGFP gene but they have tow totally deferent new promoters for the EGFP gene. This contract was based on the replacement of the promoter pCMV 1. with the promoter pSFFV for the contraction of the pEPI-pSFFV new vector 2. with the promoter pβ-globin for the contraction of the pEPI-pβ-globin new vector These two new vectors the pEPI-pSFFV and the pEPI-pβ-globin were tested for their ability of being used as Replicating Episomal Vectors to Hematopoietic Stem Cells, HSC sach as CD34+ cells.

Recombinant proteins belong to considerable biofarmaceutics products used in biomedical research and in the treatment of human disease. Recombinant protines can be produced by stable transfection in big amount or by faster transient transfection with smaller amounts. To provide regular biological activity, it is necessary for the protein to be properly folded and post-translationally modified. As these modifications can be accurately performed only in mammalian cells, they have become the major host for complex r-protein expression. In this thesis is described transient transfection HEK 293 EBNA1 cells with linear polyethylenimines. These cells has been adapted to suspension cultivation in serum free medium. The cells were transfected with pcDNA3.1, pCI, pEBSV1, pCEP4, pEAK8 a pcDNA5/FRT/TO plasmids, everyone contained repoter gene SEAP. Concentration of SEAP in cell culture supernatants were determined in order to compare efficiencies of individual transfections. DNA:PEI ratio was another factor which was optimised and two different PEIs were compared. Highest achieved expresion was 50 mg per litre with transfection in 24 well plate when DNA:PEI ratio was 1:5. Comparison of six different plasmids give the bigest expresion pCEP4/SEAP, in well plate as well as in scaled up system.

Τα επισωματικά αυτο-αναπαραγώμενα συστήματα αποτελούν υποσχόμενα εναλλακτικά οχήματα γονιδιακής μεταφοράς για εφαρμογές της γονιδιακής θεραπείας. Η πρόσφατη κατανόηση της ικανότητας των αλληλουχιών S/MAR να διαμεσολαβούν την επισωματική διατήρηση γενετικών στοιχείων επέτρεψε την ανάπτυξη ενός πρότυπου κυκλικού επισωματικού φορέα που λειτουργεί χωρίς να κωδικοποιεί πρωτεΐνες ιϊκής προέλευσης. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήθηκε για πρώτη φορά η δυνατότητα αυτού του φορέα, pEPI-eGFP, να μεσολαβεί γονιδιακή μεταφορά σε κυτταρικές σειρές προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων καθώς και σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα και, κυρίως, σε ανθρώπινα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα. Δείχνουμε ότι ο φορέας pEPI-eGFP διατηρείται επισωματικά και υποστηρίζει παρατεταμένη έκφραση του γονιδίου αναφοράς eGFP, ακόμα και χωρίς πίεση επιλογής, στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά K562, καθώς και σε πρωτογενείς ανθρώπινους ινοβλάστες. Αντίθετα, στην κυτταρική σειρά ερυθρολευχαιμίας ποντικού MEL, η έκφραση της eGFP αποσιωπάται μέσω αποακετυλίωσης ιστονών, παρά την επισωματική διατήρηση του φορέα. Προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα με κλωνογόνο ικανότητα, προερχόμενα από αίμα ομφάλιου λώρου, διαμολύνονται αποτελεσματικά με το φορέα μέσω ηλεκτροδιάτρησης. Ημιστερεές αποικίες προερχόμενες από διαμολυσμένα CD34+ κύτταρα διατηρούν το φορέα και εκφράζουν eGFP. Μετά από 4 εβδομάδες ο φορέας διατηρείται επισωματικά σε περίπου 1% των θυγατρικών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι ένα πλασμίδιο βασιζόμενο σε μια αλληλουχία S/MAR μπορεί να λειτουργεί ως σταθερό επιίσωμα σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα και, ιδιαίτερα, σε προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, υποστηρίζοντας παρατεταμένη έκφραση του διαγονιδίου. Η μελέτη αυτή αναδεικνύει τη χρησιμότητα του συστήματος αυτού για τους σκοπούς της γονιδιακής θεραπείας. Παράλληλα, καταδεικνύει τους στόχους στους οποίους πρέπει να επικεντρωθεί η μελλοντική έρευνα προς την κατεύθυνση της βελτίωσής του. / Episomally maintained self-replicating systems present attractive alternative vehicles for gene therapy applications. Recent insights into the ability of chromosomal scaffold/matrix attachment regions (S/MARs) to mediate episomal maintenance of genetic elements cloned in cis allowed the development of a small circular episomal vector that functions independently of virally encoded proteins. In this study, we investigated the potential of this vector, pEPI-eGFP, to mediate gene transfer in hematopoietic progenitor cell lines as well as in primary human cells and, importantly, in human hematopoietic progenitor cells. pEPI-eGFP was episomally maintained and conferred sustained eGFP expression even in nonselective conditions in the human cell line, K562, as well as in primary human fibroblast-like cells. In contrast, in the murine erythroleukemia cell line, MEL, transgene expression was silenced through histone deacetylation, despite the vector’s episomal persistence. Hematopoietic semisolid cell colonies derived from transfected human cord blood retained the vector and expressed eGFP. After 4 weeks, the vector was maintained in approximately 1% of progeny cells. Our results provide the first evidence that a S/MAR-based plasmid can function as a stable episome in primary human cells, supporting long-term transgene expression. The present study constitutes a proof of principle for the utility of this system in gene therapy applications and points at targets for future improvements.

Οι αυτοαναπαραγόμενοι επισωματικοί φορείς γονιδιακής μεταφοράς αποτελούν πολλά υποσχόμενους φορείς γονιδιακής θεραπείας. Στην παρούσα εργασία δημιουργήθηκε ο φορέας Zif-VP64-EP2 στα πλαίσια των μελετών γονιδιακής θεραπείας για τις αιμοσφαιρινοπάθειες. Πρόκειται για ένα κυκλικό πλασμίδιο, που φέρει το γονίδιο ενός τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα της γ-σφαιρίνης του Zif-VP64 υπό την επενέργεια του ισχυρού υποκινητή pSFFV καθώς και τo γονίδιο της eGFP με το S/MAR στοιχείο από την περιοχή 5’ του γονιδίου της ανθρώπινης ιντερφερόνης β υπό την επενέργεια του υποκινητή pCMV. Διαπιστώθηκε ότι το Zif-VP64-EP2 μεσολαβεί γονιδιακή μεταφορά σε διαμολυσμένα κύτταρα της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς Κ562. Η μακράς διάρκειας διαμολυσμένη καλλιέργεια (3 μήνες) καταδεικνύει ότι το όχημα είναι λειτουργικό και διατηρείται ως επισωματικό σε Κ562 κύτταρα διαμολυσμένα κύτταρα με το Zif-VP64- ΕΡ2. / Self-replicating episomal vectors for gene transfer are a new and very promising experimental approach to gene therapy. In this study, it was created the vector Zif-VP64-EP2, within the context of developing self-replicating episomal vectors for the gene therapy of hemoglobinopathies. Zif-VP64-EP2 is a circular plasmid which includes the gene of an artificial transcription factor for gamma globin: Zif-VP64 under the control of pSFFV promoter and the gene of eGFP with the S/MAR element from the region 5’ of the human interferon β gene under the control of pCMV promoter. It was established that Zif-VP64-EP2 was retained within the transfected Κ562 hematopoietic progenitor cell. Its episomal situation for a long time (3 months) and its normal expression in K562 human cells constitutes a proof of the utility of Zif-VP64- ΕΡ2 system in gene therapy applications.