Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5113_1.pdf: 974357 bytes, checksum: 6213145f95044915b06cd604154e3c5b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / As leishmanias são parasitas intracelulares que causam um amplo espectro de doenças, desde lesões cutâneas isoladas até formas viscerais fatais. Apesar dos progressos na epidemiologia, imunologia e bioquímica destas parasitoses. As primeiras 10.000 seqüências de cDNA de Leishmania chagasi, produzidas pelo Programa Genoma Nordeste (ProGeNE), foram analisadas quanto à categorização funcional e conteúdo GC de seqüências codificantes e nãocodificantes, além de ter sido identificado um grupo de genes restritos aos tripanosomatídeos. Foram também analisados dois genes conservados, hsp70 (proteína de choque térmico de 70kDa) e hsp83, que apresentavam seqüência completa. Polipeptídeos recombinantes contendo seqüências de HSP70 progressivamente maiores foram usados em ensaios de imunoadsorção para identificar regiões antigênicas em toda a extensão da proteína. As seqüências de aminoácidos deduzidas para HSP70 e HSP83 foram comparadas com um grande grupo de seqüências similares entre os tripanosomatídeos e entre outros grupos taxonômicos. Os epitopos ou regiões antigênicas, definidos neste estudo mapearam claramente sobre as regiões divergentes. Os sítios precisos de transencadeamento e poli-adenilação para HSP83 foram identificados através de estudos comparativos das regiões 5´- e 3´-não traduzida e das seqüências genômicas correspondentes de HSP83 e de outros genes disponíveis para L. chagasi. Este trabalho espera contribui, portanto, para um melhor entendimento da antigenicidade das HSP nas infecções e para uma definição dos sítios de processamento do RNAm em Leishmania

Anaplasmosis, a persistent intraerythrocytic infection of cattle by Anaplasma marginale, causes severe anemia and a higher rate of abortion, resulting in significant loss to both dairy and beef industries. Clinical diagnosis is based on symptoms and confirmatory laboratory tests are required. Currently, all the diagnostic assays have been developed with whole antigens with indirect ELISA based on multiple epitopes. In a pioneer investigation we demonstrated the use of critical motifs of an epitope as biomarkers for immunosensor applications. Mimotopes of the MSP1a protein functional epitope were obtained through Phage Display after three cycles of selection of a 12-mer random peptide library against the neutralizing monoclonal antibody 15D2. Thirty-nine clones were randomly selected, sequenced, translated and aligned with the native sequence. The consensus sequences SxSSQSEASTSSQLGA was obtained, which is located in C-terminal end of the 28-aa repetitive motif of the MSP1a protein, but the alignment and sequences variation among mimotopes allowed us to map the critical motif STSSxL within the consensus sequence. Based on these results, two peptides were chemically synthesized; one based on the critical motif (STSSQL, Am1) and the other based on the consensus sequence aligned with the native epitope (SEASTSSQLGA, Am2). Sera from 24 infected and 52 healthy animals were tested by ELISA for reactivity against Am1 and Am2, which presented sensitivities of 96% and 100%, respectively. The Am1 peptide was incorporated onto a biolectrode (graphite modified with poly-3-hydroxyphenylacetic acid) and direct serum detection was demonstrated by impedance, differential pulse voltammetry, and atomic force microscopy. The electrochemical sensor system proved to be highly effective in discriminating sera from positive and negative animals. These immunosensors were highly sensitive and selective for positive IgG, contaminants did not affect measurements, and were based on a simple, fast and reproducible electrochemical system. / Anaplasmose, uma infecção intraeritrocitária obrigatória de bovinos, causada pela Anaplasma marginale, causa severa anemia e alta taxa de aborto, resultando em perda significativa para a indústria de laticínios e carne. O diagnóstico clínico é baseado nos sintomas e exames laboratorias confirmatórios são necessários. Atualmente, todos os ensaios de diagnósticos têm sido desenvolvidos com ELISA indireto de antígenos totais baseado em epítopos múltiplos. Em uma investigação pioneira demonstramos o uso de motivos críticos de um epítopo como biomarcador para a aplicação em imunossensores. Mimotopos do epítopo funcional da proteína MSP1a foram obtidos por meio de Phage Display, após três ciclos de seleção, de uma biblioteca randômica de peptídeos 12-mer contra o anticorpo monoclonal 15D2. Trinta e nove clones foram selecionados aleatoriamente, sequenciados, traduzidos e alinhados com a sequência nativa. Foi obtida a sequência consenso SxSSQSEASTSSQLGA, que está localizada na extremidade C-terminal do motivo repetitivo de 28-aa da proteína MSP1a, mas o alinhamento e a variação das sequências entre os mimotopos nos permitiu mapear o motivo crítico STSSxL dentro da sequência consenso. Com base nesses resultados, dois peptídeos foram quimicamente sintetizados; um baseado no motivo crítico (STSSQL, Am1) e o outro baseado na sequência consenso alinhada com o epítopo nativo (SEASTSSQLGA, Am2). Soro de 24 animais infectados e 52 animais saudáveis foram testados por ELISA quanto à reatividade contra Am1 e Am2, que apresentou sensibilidades de 96% e 100%, respectivamente. O peptide Am1 foi incorporado a um bioeletrodo (grafite modificado com ácido poli-3-hidroxyfenilacético) e a detecção direta de soro foi demonstrada por impedância, voltametria de pulso diferencial e microscopia de força atômica. O sistema de sensor eletroquímico provou ser altamente eficaz em soro de animais positivos de negativos. Este imunossensor foi altamente sensível e seletivo para IgG positiva, contaminantes não afetaram as medições, e foram baseados e um sistema simples, rápido e reprodutível. / Doutor em Genética e Bioquímica

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-04-19T18:10:39Z No. of bitstreams: 2 Tese - Greyciele Rodrigues de Almeida - 2015.pdf: 2860659 bytes, checksum: c6b139400f7d4d535cf2e4ccecbabaed (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-20T15:16:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Greyciele Rodrigues de Almeida - 2015.pdf: 2860659 bytes, checksum: c6b139400f7d4d535cf2e4ccecbabaed (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-20T15:16:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Greyciele Rodrigues de Almeida - 2015.pdf: 2860659 bytes, checksum: c6b139400f7d4d535cf2e4ccecbabaed (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) Previous issue date: 2015-08-24 / Member of the Herpesviridae family, subfamily Alphaherpesvirinae, gender Varicellovirus, the bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) has been associated with different clinical conditions (respiratory and genital/reproductive diseases) in cattle. There is no standard procedure to control or prevent infections caused by herpesviruses. In this sense, phage display was used to select new glycoprotein mimotopes antigen of BoHV-1 that has potential for use in vaccines and diagnostics. The phage display technique was performed using a linear random peptide library consisting of 12 amino acid residues fused to the protein III of M13 phage (no peptide) against BoHV-1 specific IgGs, purified by affinity chromatography. After three cycles of selection (biopanning) and amplification, 44 clones were isolated and their amino acid sequences were determined by sequencing generating 16 different sequences. ELISA, demonstrating the efficiency of selection from the specific antibodies, confirmed the reactivity of pooled clones. Another ELISA evaluated the individual specificity of the most frequent clones, the M13 phage was used as a negative control. We selected three peptides (B, C and E) with affinity for anti-BoHV-1 antibodies, and the E peptide (pepE), showed to have potential as antigen for antibody detection in a serological test for BoHV-1. Immunization of rabbits with the peptides induced specific production of serum antibodies, but they were not able do neutralize BoHV-1 cell lysis. The in silico analysis of the dodecapeptide E (1DRALYGPTVIDH12) enabled the identification of a new discontinuous epitope on the envelope glycoprotein B (gB Env) of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1). There is a short motif (338YKRD341) within a region of the env gB BoHV-1 with high similarity to motifs shared by dodecapeptide the N-terminal region (5YxARD1) of gB and HSV-1 (326YARD329), wherein the 328Arg residue is described as a target for neutralizing monoclonal antibodies (mAb) for HSV-1 gB. Besides the characterization of an antibody-binding site of the BoHV-1 Env gB, we have demonstrated that the phage-fused peptide has potential use as a reagent for virus diagnosis by phage-ELISA assay, discriminating BoHV-1 positive serum samples from negative ones. / Membro da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus, o herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) tem sido associado a diferentes condições clínicas em bovinos (doenças respiratórias, genitais e falhas reprodutivas). Não existe um procedimento padrão para medidas de controle e profilaxia das infecções causadas por herpesvírus. Nesse sentido, o phage display foi utilizado com o objetivo de selecionar novos antígenos mimetopos de glicoproteínas do herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) e que apresentam potencial para uso em vacinas e diagnóstico. A técnica de phage display foi realizada com a utilização de uma biblioteca de peptídeos randômicos e lineares composta de 12 resíduos de aminoácidos fusionada à pIII de fagos M13 (sem peptídeo), contra anticorpos anti-BoHV-1, purificados em coluna de cromatografia por afinidade. Após três ciclos de seleção (biopanning) e amplificação, 44 clones foram isolados e as sequências de aminoácidos dos peptídeos foram determinadas pelo sequenciamento gerando 16 sequencias diferentes. A reatividade do pool de clones foi confirmada por ELISA, demonstrando a eficiência da seleção a partir dos anticorpos específicos. Para avaliação da especificidade individual, realizou-se o ELISA dos clones mais frequentes, tendo como controle negativo o fago M13. Foram selecionados três peptídeos (B, C e E) com afinidade por anticorpos anti-BoHV-1, e um destes, o peptídeo E (pepE), apresentou potencial antigênico na detecção de anticorpos para o diagnóstico sorológico do BoHV-1. Nos testes de imunização em coelhos, os três peptídeos induziram a produção de anticorpos específicos, porém, estes não foram capazes de neutralizar a lise celular ocasionada pelo BoHV-1 em placa. A análise in silico do dodecapeptídeo E (1DRALYGPTVIDH12) possibilitou a identificação de um novo epitopo descontínuo na glicoproteína B de envelope (Env gB) do BoHV-1. Há um curto motivo (338YKRD341) dentro de uma região do gene Env gB do BoHV-1, com alta similaridade com os motivos compartilhados pelo dodecapeptídio da região N-terminal (5YxARD1) da gB e do Herpesvirus Humano 1 (HSV-1) (326YARD329), em que o resíduo 328Arg é descrito como um alvo para anticorpos monoclonais neutralizantes (mAb) para a gB do HSV-1. Concluindo, além da caracterização de um sítio de ligação ao anticorpo na Env gB do BoHV-1, o pepE expresso pelo fago tem potencial de utilização como reagente para o diagnóstico virológico por ensaio ELISA-fago, que discrimina amostras de soro positivas e negativas para o BoHV-1.