Il y a 4 isoforme de p38 : α, β, δ, and γ. MK5, à l'origine identifié comme étant un régulateur de PRAK (Regulated/Activated Protein Kinase), est maintenant connu pour être activée par la protéine kinase p38 (qui est un mitogène activé par la protéine kinase, MAPK). Cette dernière est impliquée dans les mécanismes de fibrose et d'apoptose pendant l'hypertrophie cardiaque. De plus, MK5 est également activée par les MAPKs atypiques; ERK3 et ERK4. Bien qu’elles soient fortement exprimées dans le coeur, le rôle physiologique de MK5 et ERK3 demeure inconnu. Par conséquent, nous avons étudié l'effet de la constriction aortique transversale (TAC) – induisant un surcharge chronique de pression chez les souris hétèrozygotes knockout pour MK5 (MK5+/-) ou ERK3 (ERK3+/-) et pour leurs types sauvages (MK5+/+ et ERK3+/+). Deux sem post-TAC; le ratio de poids du coeur/poids corporel a été augmenté chez les 2 souris MK5+/- et MK5+/+. L'échocardiographie de la trans-thoracique démontre que la surcharge de pression a altéré la fonction diastolique du ventricule gauche chez MK5+/+, mais pas chez la souris MK5+/-. De plus, nous avons observé moins de dépôt de collagène, évalué par une coloration au trichrome de Masson, 2 et 3 sem post-TAC chez les souris MK5+/-. Parallèlement, le niveau de l’ARNm de collagène type1 alpha-1 a été significativement diminué dans les coeurs des souris MK5+/-, 2 et 3 sem post-TAC. De même, ERK3, mais pas ERK5 ni p38α, co-IP avec MK5 dans les 2 modèles des coeurs TAC; aigus ou chroniques. En revanche, l’ajout exogénique de GST-MK5 a abaissé ERK4 et p38α, mais pas ERK3 dans les lysâtes de coeur de souris. Par contre, GST-ERK3 et GST-p38α ne démontrent aucune co-IP avec MK5. Ces données suggèrent que dans le coeur seul ERK3, et non ERK4 ou p38α, est capable d’interagir avec, et réguler MK5. A niveau physiologique MK5 interagit entièrement avec ERK3 et par conséquent MK5 n’est pas disponible pour lier les protéines exogéniques. Les souris hétérozygotes pour ERK3 (ERK3+/-) ont également démontré une réduction ou une absence de collagène et une faible expression d’ARNm du collagène type1 alpha1, 3 sem post-TAC. Ces résultats démontrent un important rôle pro-fibrotique de la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression.Nous avons également démontré 5 variant d'épissage de (MK5.1-5), y compris la forme originale (MK5.1). MK5.2 et MK5.5 subissent une délétion de 6 paires de base dans l’exon 12 : MK5.3 manque l'exon 12 : MK5.4 et MK5.5 manquent les exons 2-6. L'expression des ARNm des différents variant d'épissage a été vérifiée par PCR en temps réel (qPCR). Bien que l’expression est ubiquitaire, l'abondance relative de chaque variant était tissu-spécifique (coeur, rein, pancréas, muscle squelettique, poumon, foie, et cerveau). En plus, l'abondance relative des variant d’épissage varie pendant la surcharge de pression et le développement postnatal du coeur. En outre, l'immunofluorescence a indiqué que MK5.1-5.3 se localise au noyau alors que MK5.4-5.5 est situé au niveau cytoplasmic dans les cellules HEK 293 non stimulées. Suite à une stimulation avec l'anisomycin, un activateur de p38 MAPK, MK5.1-5.3 se translocalise du noyau au cytoplasme alors qu’une petite fraction de MK5.4-5.5 translocalise vers le noyau. Ces variant d'épissage peuvent diversifier la signalisation de MK5-ERK3 dans coeur, mais leur rôle exact oblige des recherches supplémentaires. Excepté l’isoforme δ, toutes les isoformes de p38 sont exprimées dans le coeur et la forme α est considérée comme étant l'isoforme dominante. L’analyse par qPCR et immunobuvardage de type western ont démontré que p38α et p38γ sont les deux isoformes prédominantes alors que p38β et p38δ sont exprimées aux mêmes niveaux dans le coeur de rat adulte. L'immunofluorescence a démontré que p38α et p38γ se trouvent dans le cytoplasme et le noyau. Cependant, suite à la surcharge par TAC, p38γ s'est accumulé dans noyau tandis que la distribution de p38α est demeurée inchangée. Ainsi, l'abondance de p38γ et sa translocalisation nucléaire suite à la surcharge de pression indique un rôle potentiel dans l'expression génique pendant le remodelage cardiaque. En conclusion, nous avons mis en évidence pour la première fois un rôle pro-fibrotique pour la signalisation MK5-ERK3 pendant une surcharge chronique de pression. D'ailleurs, les niveaux comparables d'expression de p38γ avec p38α, et la localisation différentielle de p38γ pendant la surcharge aiguë ou chronique de pression suggèrent différents rôles possibles pour ces isoformes pendant le remodelage hypertrophique cardiaque. / There are 4 isoforms of p38 MAP kinase: α, β, γ, and δ. p38 signaling has been implicated in fibrosis and apoptosis during cardiac hypertrophy. MK5, originally identified as a p38 Regulated/Activated Protein Kinase (PRAK), is known to be downstream of p38 mitogen activated protein kinase (MAPK). Although highly expressed in the heart, the physiological roles of MK5 remain unknown. To determine if MK5 plays a role in mediating detrimental effects downstream of p38, we studied the effect of transverse aortic constriction (TAC)-induced chronic pressure overload in mice heterozygous for a knockout of MK5 (MK5+/-). Moreover, as MK5 is also activated by the atypical MAPKs, ERK3 and ERK4, the effects of TAC were also studied in ERK3+/- mice. Wild-type (MK5+/+; ERK3+/+) littermates were used as controls. Two wks post-TAC, heart weight/body weight ratios were significantly and similarly increased in both MK5+/- and MK5+/+ hearts. Trans-thoracic echocardiography revealed that pressure overload impaired left ventricular diastolic function in MK5+/+, but not in MK5+/- hearts. In addition, less collagen deposition, assessed by Masson trichrome staining, was observed in MK5+/- hearts 2 and 3 wks post-TAC. Furthermore, TAC-induced increases in collagen alpha1 type1 mRNA levels were significantly lower in MK5+/- hearts at both 2 and 3 wks post-TAC. Immunoprecipitation of MK5 resulted in co-immunoprecipitation of ERK3 but not ERK4 or p38α in either acute or chronic sham-operated and TAC hearts. In contrast, exogenous GST-MK5 pulled down endogenous ERK4 and p38α, but not ERK3, from mouse heart lysates. Neither exogenous GST-ERK3 nor GST-p38α pulled down MK5. These results suggest that MK5 associates with, and is regulated by ERK3, but not ERK4 or p38α in heart. At physiological expressional levels, all MK5 was bound to ERK3 and hence not available to bind exogenous protein. Along similar lines, mice heterozygous for an ERK3 knockout (ERK3+/-) also showed reduced or absent collagen deposition and lower collagen alpha1 type1 mRNA levels 3 wks post-TAC. This data suggests an important pro-fibrotic role of MK5-ERK3 signaling during chronic pressure overload.We also demonstrated the existence of 5 splice variants of (MK5.1-5), including the originally published form (MK5.1). MK5.2 and MK5.5 had a 6 base pair deletion in exon 12: MK5.3 lacked exon 12: and MK5.4 and MK5.5 lacked exons 2-6. Subsequently, expression of the splice variants at the mRNA level was quantified by real time qPCR. Although ubiquitously expressed, the relative abundance of each variant was tissue-specific (heart, kidney, pancreas, skeletal muscle, lung, liver, and brain). Additionally, the relative abundance of MK5 splice variants changed in the heart during pressure overload and post-natal development. Furthermore, immunofluorescence revealed MK5.1-5.3 localized to the nucleus and MK5.4-5.5 to the cytoplasm in unstimulated HEK 293 cells. Upon stimulation with anisomycin, which activates p38 MAPK, MK5.1-5.3 translocated from the nucleus to the cytoplasm and small amounts of MK5.4-5.5 relocated to the nucleus. These splice variants may further diversify MK5-ERK3 signaling in the heart, but their exact role awaits further investigation. With the exception of p38δ, all p38 isoforms are expressed in the heart and α is considered to be the prominent isoform in this tissue. qPCR and western blot analysis revealed p38α and p38γ to be the predominant isoforms and p38β and p38δ are expressed at comparable levels in the adult heart. Confocal immunofluorescence studies revealed p38α and p38γ in both the cytoplasm and nucleus. However, in response to TAC, p38γ accumulated in the nucleus whereas the distribution of p38α remained unaffected. The high abundance of p38γ and its nuclear accumulation during chronic pressure overload suggest that this isoform may play a role in gene expression during pathological cardiac remodeling. In conclusion, we have shown for the first time a pro-fibrotic role for MK5-ERK3 signaling during chronic pressure overload. Moreover, comparable expression levels of p38γ with p38α, and differential localization of p38γ during acute or chronic pressure overload, suggest these isoforms play different roles during cardiac remodeling.

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Problématique : Le cancer du sein est un des types du cancer les plus diagnostiqués au Canada et il est une cause majeure de mortalité liée au cancer chez la femme. Le cancer du sein triple négatif (CSTN) a un mauvais pronostic dû à son agressivité clinique et à l’absence de réponse aux traitements habituels du cancer du sein tels que l’hormonothérapie et l’inhibition de HER2. En ce moment, les avancées pour le CSTN restent très négligeables. Il y a un besoin urgent d’identifier une nouvelle thérapie qui ciblerait les voies signalétiques pro-métastatiques du cancer du sein triple négatif et ainsi, bloquer idéalement la prolifération et la dissémination métastatique des cellules cancéreuses. Cadre conceptuel : Dernièrement le laboratoire de Sylvain Meloche à l’IRIC a montré qu’une déplétion génétique de ERK3 (Extracellular Regulated Kinase 3) inhibe la croissance des tumeurs mammaires dans un modèle de souris de CSTN et bloque la progression métastatique. Ainsi, suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’inhibition de ERK3 à l’aide de molécules engendrerait une diminution de la prolifération cellulaire au niveau du cancer du sein triple négatif. L’objectif principal du projet est de développer des molécules ayant des propriétés inhibitrices de ERK3 in vitro. Les deux objectifs secondaires sont d’évaluer leur potentiel d’inhibition vis-à-vis ERK3 dans des modèles in cellulo et de confirmer, parallèlement à la relation structure-activité (SAR), leur mode de liaison par des méthodes computationnelles. Méthodologie : Des composés tête de série ont été identifiés à la suite d’un criblage à haut débit d’une librairie d’inhibiteurs de kinases. Quelques composés intéressants démontrent une activité dont les IC50 (concentration inhibant 50% de l’activité de la kinase) sont inférieurs à 300 nM. Une molécule en particulier a été retenue compte tenu de son niveau d’activité et de sélectivité par rapport aux autres kinases. Une modification systématique des groupements fonctionnels lors de la synthèse d’analogues nous permet d’établir de façon claire le mode de liaison et ainsi, établir la SAR de notre composé tête de série et le site de liaison de ERK3. Les tests d’inhibition compétitifs in vitro seront effectués à l’IRIC à partir de la protéine ERK3 purifiée. Grâce à la SAR établie, on poursuit l’optimisation avec l’intégration de groupements moléculaires solubilisants qui vont permettre d’augmenter les propriétés pharmacocinétiques et ainsi, augmenter l’activité cellulaire de notre composé tête de série. En dernier lieu, à l’aide de la modélisation computationnelle, le mode de liaison de la molécule à ERK3 sera élucidé de façon à confirmer la SAR et aussi, permettre le développement de nouvelles structures (ex : bioisotères) pouvant avoir aussi une activité inhibitrice sur ERK3. Résultats : Une SAR étendue basée sur l’inhibiteur sélectionné a été obtenue. Un inhibiteur de ERK3 possédant une puissance cellulaire (IC50) de 2 μM a été synthétisé. Retombée scientifique : Les travaux effectués dans le cadre de ma maîtrise pourraient conduire au développement de nouveaux traitements pour le cancer du sein triple négatif en ciblant les voies de signalisation prométastatiques à l’aide de molécules inhibitrices. / Problem: Breast cancer is one of the most diagnosed type of cancer in Canada and it is a major cause of mortality linked to cancer for women. Triple-negative breast cancer (TNBC) is the form with the worse prognostic compared to the other forms of breast cancer due to clinical aggressiveness and the absence of response to conventional hormonal therapy and HER2 inhibition therapy. At this time, therapeutic advances for TNBC remain very negligible, which testifies to a need for a new therapy that would target the prometastatic signaling pathways of triple negative breast cancer and thus, ideally block the proliferation and the metastatic dissemination of cancer cells. Conceptual Basis: Recently, Sylvain Meloche's laboratory at IRIC showed that genetic depletion of ERK3 (Extracellular Regulated Kinase 3) inhibits the growth of mammary tumors in a TBNC mouse model and blocks metastatic progression. Thus, in view of these results, our hypothesis is that the inhibition of ERK3 using a specific inhibitor would cause a decrease in cell proliferation in triple negative breast cancer. The main objective of my project is to develop small molecules with inhibitory properties of ERK3 in vitro. The two secondary objectives are to evaluate their inhibitory potential toward ERK3 in cellulo models and to confirm, alongside the structure-activity relationship (SAR), the binding mode of inhibitors to ERK3 by computational methods. Methodology: Lead compounds have been identified following a high-throughput screening of a kinase inhibitor library. A few interesting compounds emerged with activities below 300 nM (IC50). One molecule in particular was chosen given its good selectivity as well as an acceptable inhibitory activity. Systematic modification of functional groups for analogs synthesis allows us to clearly establish the binding mode and thus, establish the SAR of our lead compound. The competitive inhibition tests in vitro have been carried out at IRIC using purified ERK3. With the established SAR, optimization is continued with the integration of solubilizing molecular groups which will increase the pharmacokinetic properties and thus increase the cellular activity of our lead compound.7 Finally, with the help of computational modeling, the binding mode of the molecule to ERK3 will be elucidated to confirm the SAR and also, allow the development of new structures (i.e. bioisosters) that can have an inhibitory activity on ERK3. Results: An extensive SAR of the inhibitor is obtained. A compound with 2 μM activity (IC50) on ERK3 in cell has been synthesized. Scientific outlook: The work done as part of my master's degree could lead to the development of a new treatment for triple-negative breast cancer by targeting prometastatic signaling pathways using small inhibitory molecules.

ERK3 est une protéine de la famille des MAP kinase (MAPK) classifiée comme atypique car elle présente des différences notables comparées aux propriétés redondantes des MAPK dites classiques. ERK3 est notamment une protéine très instable dégradée constitutivement par le système ubiquitine protéasome. Par conséquence, son activité biologique est principalement contrôlée par la régulation de sa dégradation. Pourtant, les facteurs impliqués dans la régulation de la stabilité de ERK3 restent mal compris. Ce travail de thèse vise ainsi à affiner notre compréhension des mécanismes de régulation de la stabilité de ERK3. De manière intéressante, nous avons montré dans une première étude qu’un pH acide stabilise fortement ERK3 alors qu’à l’inverse, un pH basique induit sa rapide dégradation par le protéasome. De plus, la déplétion génétique de NBCn1, un transporteur de bicarbonate impliqué dans la régulation du pH intracellulaire, augmente également la stabilité de ERK3. Ainsi, des variations de pH intracellulaire régulent finement la dégradation de ERK3. Nous avons également montré dans une deuxième étude l’importance de ERK3 dans la progression tumorale dans le cancer du sein. La surexpression de ERK3 au niveau transcriptionnel ou protéique est associée à un mauvais pronostic dans le cancer du sein, que ce soit au niveau de la survie globale ou de la survie sans métastase. Ainsi, la déplétion de ERK3 entraîne une diminution drastique du nombre de métastases au foie et aux poumons. ERK3 est également impliquée dans la migration cellulaire in vitro. Nous avons montré pour la première fois que la stabilité d’une kinase peut être modulée par le pH. Or, le pH est impliqué dans de nombreux processus biologiques comme, entre autres, la prolifération cellulaire, la migration, l’invasion et la mort cellulaire. Les résultats obtenus pendant ce doctorat ouvrent donc de nouveaux champs d’exploration pour étudier l’activité biologique de ERK3 dans des contextes dépendants du pH. / ERK3 is an atypical member of the MAP kinase (MAPK) family because its regulation differs from the canonical module of classical MAPK. ERK3 is also an unstable protein constitutively degraded by the ubiquitin proteasome system (UPS). Therefore, ERK3 stability regulation is an essential element in the control of its biological activity. However, the components implied in the regulation of its stability by the UPS are mainly unknown. This thesis aims to understand the regulation mechanisms controlling ERK3 degradation to better explore its biological function. In a first study, we showed that an acidic extracellular pH strongly stabilizes ERK3. At the opposite, a basic pH triggers its rapid degradation by the proteasome. Moreover, genetic depletion of NBCn1, a bicarbonate transporter involved in the regulation of the intracellular pH (pHi), also impacts ERK3 stability. We demonstrated that pHi variation finely regulates ERK3 degradation. We also explored the role of ERK3 in breast cancer progression in a second study. In breast cancer, high ERK3 expression correlates with a poor overall survival as well as a higher risk to develop metastases. ERK3 depletion triggers a severe decrease in the number of liver and lungs metastasis in a in vivo metastasis model. We also demonstrated that ERK3 is involved in cell migration in vitro. We showed for the first time that a kinase stability is modulated by pH variation. pH homeostasis is finely regulated in cells to assure important cellular functions such as proliferation, invasion, and survival. Therefore, ERK3 protein levels regulation by the pH raises new potential functions to explore for this kinase in a context pH dependent.