京都大学 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13556号 / 論医博第2285号 / 新制||医||1067(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 長船 健二, 教授 椛島 健治, 教授 斎藤 通紀 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Yes / Recombinant human erythropoietin (rHuEPO) is an effective treatment for anaemia but concerns that it causes disease progression in cancer patients by activation of EPO receptors (EPOR) in tumour tissue have been contro- versial and have restricted its clinical use. Initial clinical studies were flawed because they used polyclonal antibodies, later shown to lack specificity for EPOR. Moreover, multiple isoforms of EPOR caused by differential splicing have been reported in cancer cell lines at the mRNA level but investigations of these variants and their potential impact on tumour progression, have been hampered by lack of suitable antibodies. The EpoCan consortium seeks to promote improved pathological testing of EPOR, leading to safer clinical use of rHuEPO, by producing well characterized EPOR antibodies. Using novel genetic and traditional peptide immunization protocols, we have produced mouse and rat monoclonal antibodies, and show that sev- eral of these specifically recognize EPOR by Western blot, immunoprecipi- tation, immunofluorescence, flow cytometry and immunohistochemistry in cell lines and clinical material. Widespread availability of these antibodies should enable the research community to gain a better understanding of the role of EPOR in cancer, and eventually to distinguish patients who can be treated safely by rHuEPO from those at increased risk from treatment. / Study was supported by the FP7-Health European commission EpoCan grant (282551).

published_or_final_version / abstract / Anatomy / Doctoral / Doctor of Philosophy

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Die Stimulation primärer erythroider Vorläuferzellen (PEPs) mit Erythropoetin (Epo) führt zur Aktivierung der mitogenen Kinasen („extracellular signal-regulated kinases“ (Erks) und „mitogen-activated protein kinase/Erk-activating kinases“ (MEKs)). Der Mechanismus der Aktivierung war bisher unklar. Mehrere wissenschaftliche Gruppen haben zudem unerwartet herausgefunden, dass eine Verkürzung und Mutation des zytoplasmatischen Endes des Epo-Rezeptors (EpoR), welche zum Verlust der Bindungsmöglichkeiten für verschiedene Signalproteine führt, anscheinend nur einen geringen Effekt auf das EpoR-Signalsystem hat. Diese Ergebnisse werden durch Viabilität und normaler Erythrozytenzahl von mutierten Mäusen unterstützt. Ein neuer Signalweg, der in biochemischen Studien mit aus menschlichem Nabelschnurblut gewonnenen PEPs gefunden wurde, könnte diese überraschenden Ergebnisse erklären. Wir zeigen zum ersten mal, dass Ras und das Klasse 1b Enzym der Familie der Phosphatidylinositol-3-Kinasen (PI3K), PI3Kg, nach Stimulation mit einer physiologischen Konzentration von Epo aktiviert werden. Überraschenderweise kann in PEPs die Epo-induzierte Ras-, MEK- und Erk-Aktivierung durch drei strukturell unterschiedliche PI3K-Inhibitoren blockiert werden. Überdies ist die Erk-Aktivierung in PEPs unempfindlich gegenüber Inhibierung der Raf-Kinasen, wird aber durch Proteinkinase C (PKC)-Inhibitoren unterdrückt. Im Gegensatz dazu ist die durch Stammzellfaktor („stem cell factor“ (SCF)) induzierte Erk-Aktivierung empfindlich gegenüber Raf-Inhibierung, jedoch unempfindlich gegenüber PI3K- und PKC-Inhibitoren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung von MEKs und Erks in PEPs durch geringe Konzentrationen an Epo nicht durch die klassische Signalkaskade „Src homology 2 domain-containing transforming protein C“ (Shc), „growth factor receptor bound protein 2“ (Grb2), „son of sevenless“ (Sos), Ras, Raf, MEK und Erk erfolgt, sondern durch einen PI3K-abhängigen und Raf-unabhängigen Signalweg, welcher PKC-Aktivität benötigt, reguliert wird. / Stimulation of primary erythroid progenitors (PEPs) with erythropoietin (Epo) leads to the activation of the mitogenic kinases (extracellular signal-regulated kinases (Erks) and mitogen-activated protein kinase/Erk-activating kinases (MEKs)). So far, it has been unclear how this is mechanistically accomplished. Moreover, several research groups unexpectedly found that truncation and mutation of the cytoplasmic tail of the Epo receptor (EpoR), which prevents binding of numerous signal-transducing proteins, had apparently little effect on EpoR signalling. These results are supported by viability and normal erythrocyte counts of mutant mice. A novel pathway, now unraveled by biochemical studies in human cord blood-derived PEPs, might explain these puzzling findings. We show, for the first time, that Ras and the class Ib enzyme of the phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) family, PI3Kg, are activated in response to physiological Epo concentrations. Surprisingly, Ras, MEK and Erk activation by Epo in PEPs can be blocked by three structurally different PI3K inhibitors. Furthermore, Erk activation in PEPs is insensitive to the inhibition of Raf kinase but suppressed upon protein kinase C (PKC) inhibition. In contrast, Erk activation induced by stem cell factor (SCF), which activates c-Kit in the same cells, is sensitive to Raf inhibitors and insensitive to PI3K and PKC inhibitors. These results indicate that the activation of MEKs and Erks by minimal concentrations of Epo in PEPs does not occur through the classical cascade Src homology 2 domain-containing transforming protein C (Shc), growth factor receptor bound protein 2 (Grb2), son of sevenless (Sos), Ras, Raf, MEK and Erk. Instead, MEKs and Erks are activated via PI3K, through a Raf-independent signalling pathway which requires PKC activity.

L’objectif de notre travail était de déterminer le rôle joué par l’érythropoïétine et la thrombopoïétine, respectivement, dans l’anémie et la thrombocytopénie observées chez des enfants souffrant d’une hémopathie maligne. Par le dosage simultané de la forme soluble du récepteur de la transferrine et de l’érythropoïétine dans le sérum nous avons montré que l’anémie observée chez ces patients est bien la conséquence d’une réduction du nombre de progéniteurs érythropoïétiques (atteinte médullaire centrale) mais que celle-ci n’est pas la conséquence d’une production insuffisante d’érythropoïétine. Nous avons fait la même observation chez des enfants souffrant d’une tumeur solide non hématologique et chez des patients en cours de traitement par chimiothérapie. Chez ces derniers patients, en appliquant un modèle de culture de moelle à long terme, nous avons pu démontrer l’existence d’une altération du microenvironnement médullaire, probablement induite par la chimiothérapie, se traduisant par une réduction de son aptitude à supporter le développement de la lignée érythroïde. Ceci expliquant au moins partiellement l’inadéquation de la réponse érythropoïétique observée chez ces patients en réponse à l’anémie. Dans la dernière partie du travail, nous avons montré que la thrombocytopénie très fréquemment observée chez les patients leucémiques s’accompagne dans la majorité des cas d’une élévation exponentielle de la concentration de thrombopoïétine, excepté dans les cas de leucémies de la lignée myéloïde. Chez ces derniers la concentration de thrombopoïétine est proche des valeurs observées chez des sujets normaux alors qu’elle devrait être 10 à 100 fois plus élevée compte tenu du nombre de plaquettes extrêmement bas. Nous avons pu montrer que ces taux très bas sont la conséquence de la liaison de la thrombopoïétine à un récepteur spécifique et fonctionnel présent à la surface des cellules leucémiques myéloïdes qui, en l’utilisant comme facteur de croissance, (stimulant leur prolifération et retardant leur mort cellulaire) « consomment » la thrombopoïétine présente dans le sérum.

Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 2007. / Also available in print.

Ulm, Univ., Diss., 2008.

Thesis (Ph. D.)--Rutgers University, 2008. / "Graduate Program in Neuroscience." Includes bibliographical references (p. 139-158).

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