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The environment of the gastrointestinal (GI) tract is an extremely complex system made up of not only host cells, but also many beneficial microbes. Disruption of this environment can often lead to disorders and health issues. To help balance this system, probiotics have often been administered to both humans and animals, such as livestock. This study aimed to determine what beneficial effects a novel strain of Enterobacter cloacae, strain JD6301, could offer to a host in the presence of an enteric infection with E. coli O157:H7. Upon administration of JD6301, supplemented animals had overall less E. coli present in the colon and caecum. Moreover, these animals shed more E. coli than control groups. Supplemented animals also had increased concentrations of serum triglycerides one day prior to challenge. Together, these data suggest that Enterobacter cloacae JD6301 could perform as a novel probiotic providing energy and protection to the host.

A mating between Escherichia coli 4318 (thi-leu-Las-Hfr) and E. coli A-1 (Met-Las+ F-) resulted in the formation of phototrophic recombinantshaving L-asparaginase activities at three distinct levels. The physiology of L-asparaginase synthesis in these recombinants is described.

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This thesis is missing page 129. Other copies of this thesis do not have the page either. -Digitization Centre / E. coli expresses an alternative sigma factor, RpoS, in response to starvation and environmental stresses. RpoS is a global regulator and it controls numerous genes, which aids in counteracting these stresses. The RpoS regulon is large but is not completely characterized. We have previously identified over one hundred RpoS-dependent fusions in a genetic screen based on the differential expression of an operon-lacZ fusion bank in rpoS mutant and wild type backgrounds. Forty-eight independent gene fusions were identified including several in well-characterized RpoS-regulated genes such as osmY, katE and otsA. Many of the fusions mapped to genes of unknown function or to genes that were not previously known to be under RpoS control. Based on the homology to other known bacterial genes, some of the RpoS regulated genes with unknown functions may be important for nutrient scavenging. To gain a better insight into the functions of these poorly characterized genes, we tested the ability of the fusion mutants to utilize various carbon sources and to utilize individual amino acids as carbon and nitrogen sources. The results indicate that most of the strains in rpos-backgrounds exhibited better growth in succinate and fumarate and in several amino acids than did the corresponding strains in wild-type backgrounds. / Thesis / Master of Science (MS)

PspE, encoded by the last gene of the phage shock protein operon, is one of the nine proteins of Escherichia coli that contain a rhodanese homology domain. PspE is synthesized as a precursor with a 19-amino acid signal sequence and secreted to the periplasm. Mature PspE is the smallest rhodanese of E. coli (85 amino acids) and catalyzes the transfer of sulfur from thiosulfate to cyanide forming thiocyanate and sulfite. Cation exchange chromatography of a freeze-thaw extract of a PspE-overexpressing strain yielded two major peaks of active, homogeneous PspE. The two peaks contained two forms of PspE (PspE1 and PspE2) of distinct size and/or charge that were distinguished by native polyacrylamide gel electrophoresis and gel chromatography. PspE2 was converted to the more compact PspE1 by treatment with thiosulfate, which suggested that PspE1 is the persulfide form. One equivalent of cyanizable sulfur was associated with PspE1, with much less present in PspE2. Consistent with the conclusion that the single active site cysteine of PspE1 contains a persulfide sulfur was the observation that this form was much more tolerant to chemical inactivation by thiol-specific modifying reagent DTNB (5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)). Rhodanese activity was subject to inhibition by anions (sulfite, sulfate, chloride, phosphate and arsenate), suggesting PspE has a cationic site for substrate binding. Kinetic analysis revealed that PspE employs a double-displacement mechanism, as is the case for other rhodaneses. The Kms for SSO32- and CN- were 3.0 and 43 mM, respectively. PspE exhibited a kcat of 72 s-1. To aid in understanding the physiological role of PspE, a strain with a pspE gene disruption was constructed. Comparison of rhodanese activity in extracts of wild-type and mutant strains revealed that PspE is a major contributor of rhodanese activity in E. coli. The pspE mutant displayed no obvious growth defect or auxotrophies, and was capable of molybdopterin biosynthesis, indicating that pspE is not essential for production of sulfur-containing amino acid or cofactors. Growth of wild-type and mutant strains deficient in pspE and other sulfurtransferase paralogs in medium with cyanide or cadmium was compared. The results indicated that neither PspE nor other E. coli rhodanese paralogs play roles in cyanide or cadmium detoxification. The physiological role of PspE remains to be determined. / Master of Science

L'enzyme glutamyl-queuosine-ARNt synthétase, présente chez plusieurs bactéries et codée par le gène yadB chez Escherichia coli, catalyse la formation de glutamylqueuosine- ARNtAsp. Le rôle de cet aminoacyl-ARNt est inconnu, mais la cotranscription de yadB et de dksA suggère une implication dans la réponse générale au stress. yadB a été remplacé dans une souche de Escherichia coli [delta]lac par lacZ, sans modification des éventuels éléments transcriptionnels de yadB. L'activité [béta]-galactosidase a été utilisée comme rapporteur pour déterminer le niveau d'expression de yadB dans diverses conditions de croissance et de stress. Les différences phénotypiques entre les souches sauvage et [delta]yadB ont été investiguées. Nous avons découvert que yadB est un gène non-essentiel chez Escherichia coli. Sa faible expression suggère un rôle dans le métabolisme basal de la cellule. Cette expression est sensiblement plus élevée pendant la phase stationnaire de croissance. Aucune différence phénotypique n'a été découverte entre les souches sauvage et [delta]yadB.

L'enzyme étudiée est la glutamyl-ARNt synthetase (GluRS) de la bactérie Escherichia coli. Son activité consiste principalement à charger l'acide glutamique sur l'ARNtGlu. Cette GluRS se compose de 5 domaines structuraux, dont les deux derniers (#4 et 5) situés dans la partie C-terminale ont été acquis durant l'évolution et sont responsables de la reconnaissance de la boucle de l'anticodon de l'ARNtGlu. Le domaine 4 est lié au domaine 5 par une charnière mobile (4-5) permettant à ce dernier de s'incliner et de s'adapter à l'anticodon de l'ARNtGlu (Nureki et al., 1995). Cette GluRS bactérienne, qui joue un rôle essentiel dans la biosynthèse des protéines, est considérée comme une nouvelle cible de l'antibiothérapie grâce à l'existence d'analogues du glutamyl-AMP qui inhibent plus des GluRS bactériennes que la GluRS cytopiasmique des mammifères (Balg et al., 2007). La première partie de ce projet consiste à étudier le rôle de la charnière 4-5 sur l'activité de la GluRS en produisant par mutagenèse dirigée du gène gltX de E. coli des variants E366A, E455R et D333A, altérés dans les résidus qui pourraient influencer les orientations relatives des domaines 4 et 5. Les propriétés cinétiques de ces variants dans la réaction de formation du glutamyl-ARNt montrent qu'il n'y a pas d'effet majeur de ces substitutions sur les Km sauf pour D333A. La constante de spécificité de l'enzyme sauvage reste plus grande que celle des variants ce qui suggère que la flexibilité de la charnière n'est pas grandement affectée par la substitution d'un seul de ces résidus. Accidentellement, un variant double charnière (#dc) a été obtenu dont le Km pour l'ARNtGlu est 7,7 fois plus grand que celui de la GluRS sauvage, et dont la constante de spécificité est 15 fois plus faible. Ce résultat suggère que la longueur de la charnière a peut-être autant d'influence que la nature de ces résidus pour le bon fonctionnement de la GluRS. La deuxième étape du projet est de tester l'hypothèse selon laquelle la flexibilité de la charnière 4-5 de la GluRS est importante pour l'activité catalytique de cette enzyme. Des formes tronquées de ces variants ne contenant que les 2 derniers domaines 4 et 5 ont été surproduites et purifiées pour la mesure de la flexibilité de la charnière 4-5 par résonance magnétique nucléaire (RMN). Une analyse préliminaire de la GluRS tronquée sauvage par RMN a montré qu'elle est bien repliée. Notre étude structure-fonction de la charnière 4-5 facilitera le design rationnel de nouveaux inhibiteurs plus efficaces de la GluRS. Ceux-ci pourraient être des composés de départ (« lead compounds ») pour la conception d'un nouvel antibiotique.