Resumo: Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) são reconhecidas como agentes causadores de infecções em humanos em todo o mundo. O principal reservatório é o bovino. Neste trabalho, cepas de STEC previamente isoladas de fezes bovinas foram caracterizadas usando PCR multiplex para determinar os genes de virulência (stx1, stx2, ehxA, eaeA e saa), soroaglutinação passiva reversa em látex (RPLA-VTEC screen) para avaliar a expressão da toxina Shiga, PCR-RFLP e sequenciamento para obter os subtipos e a variabilidade dos genes stx2, respectivamente. Foram determinados também os sorotipos, o perfil de sensibilidade e a viabilidade das cepas de STEC em queijo minas frescal. A freqüência de STEC nas amostras de fezes bovinas foi de 37%. Foram encontrados trinta e quatro sorotipos de STEC sendo os mais freqüentes o ONT:H7 (10%), O22:H8, O22:H16 e ONT:H21 (7% cada). Onze sorotipos encontrados não tinham sido associados com STEC até o momento. A maioria das STEC (96%) foi susceptível a todos os antimicrobianos testados. A produção de toxina Shiga determinada pelo ensaio RPLA foi de 89%. Os marcadores de virulência foram encontrados em 11 diferentes combinações, a mais freqüente foi stx2 (27%), stx1 stx2 e stx1 stx2 ehxA saa (16% cada). Foram detectados 8 subtipos de stx2: stx2OX3a/O111; stx2; stx2c; stx2(vha); stx2(vhb); stx2OX3b; stx2vnb/vhc e stx2O48. Os genes que apresentaram maior freqüência foram: stx2 e stx2c. As seqüências parciais obtidas sugerem a presença de elevada variabilidade nos genes do tipo stx2 nas STEC analisadas. A viabilidade de STEC não-O157 em queijo minas revelou que diferentes cepas de STEC podem ser detectadas nos queijos após 10 dias de armazenamento sob refrigeração. Os dados encontrados neste trabalho sugerem isolados com alto potencial de patogenicidade oferecendo risco de desencadear graves infecções à população. / Abstract: Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is recognize worldwide as an organism capable to cause human diseases. Cattle are the main source of STEC. In this research, STEC strains previously isolated were analyzed using multiplex-PCR for virulence genes, the RPLA assay to detect the Shiga toxin production and serotyping. PCR-RFLP and nucleotide sequence were analyzed to detect stx2 genes subtypes and their variability. Moreover tests for antimicrobial susceptibility and the vialbility of STEC in Minas Frescal cheese were done. The frequency of cattle shedding STEC was 37%. Thirty-four serotypes of STEC were found, the most frequent being ONT:H7 (10%), O22:H8, O22:H16 and ONT:H21 (7% each). Eleven serotypes had not been associate with STEC until the moment. Most of the strains (96%) were susceptible to all antimicrobial agents tested. Production of Shiga toxin by the RPLA assay was detected in most (89%) of the STEC strains. The frequency of virulence markers were found in 11 diferent combinations: stx2 (27%), stx1 stx2 e stx1 stx2 ehxA saa (16% each). Eigth stx2 subtypes were detect (stx2OX3a/O111; stx2; stx2c; stx2(vha); stx2(vhb); stx2OX3b; stx2vnb/vhc; stx2O48) and the most frequent were: stx2; stx2c. The partial sequences of stx2 genes suggested a high variability of stx2 types in the STEC analyzed. The STEC viability in cheese could be detected after 10 days of storage under refrigeration. The results found in this work suggest strains with high potential of pathogenicity offering risk to lead serious infections to the population. / Orientador: Ruben Pablo Schocken-Iturrino / Coorientador: José Moacir Marin / Coorientadora: Cyntia Maria Telles Fadel-Pichetch / Banca: Luiz Augusto do Amaral / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Alessandra Aparecida Medeiros / Banca: Elaine Cristina Pereira de Martins / Doutor

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente, em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, cujo sequenciamento completo do genoma a capacita como um interessante modelo para o estudo da regulação da FBN. No genoma de P. riograndensis foram identificados três agrupamentos contendo genes relacionados à FBN. Um deles, com uma organização estrutural menos conservada, foi considerado inativo a partir de análises de PCR em tempo real e de atividade de promotor. Os outros dois tiveram seus transcritos identificados e induzidos sob condições de fixação de nitrogênio, sendo um deles responsável pela codificação de um sistema alternativo da nitrogenase, independente de molibdênio. Esse sistema alternativo foi identificado como sendo aquele composto apenas por ferro e validado tanto pela análise das sequências dos genes estruturais, como pela atividade enzimática em meio sem molibdênio. Sequências localizadas a aproximadamente 250 pares de bases (pb) a montante do início da tradução dos primeiros genes dos dois agrupamentos funcionais também tiveram suas atividades como regiões reguladoras validadas pelo reconhecimento em Escherichia coli, com um provável padrão de iniciação da transcrição constitutivo. Uma menor atividade de transcrição foi observada no fragmento de 500 pb localizado a montante do agrupamento dos genes da nitrogenase alternativa, indicando a presença de regiões contendo motivos de regulação negativa do processo. Investigações mais detalhadas dessas sequências podem revelar padrões inéditos para a regulação da FBN em bactérias Gram-positivas, em geral, e em P. riograndensis, em particular. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gramnegative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis is a Gram-positive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. In P. riograndensis genome three cluster comprising BNF related genes were identified. One of them, displaying a less conserved structural organization, was stated as inactive from real time PCR and promoter activity analysis. The other ones had their transcripts identified and responded to nitrogen fixation conditions. One of the active clusters comprises genes coding for an alternative nitrogenase system independent of molybdenum, the iron-only system. This alternative system was validated by enzymatic activity under Mo-depleted conditions. Sequences 250 base pairs (bp) upstream from the first open reading frame (ORF) of each active cluster had their promoter activities validated by recognizing in Escherichia coli, showing a probable constitutive expression pattern. A weaker promoter activity was identified in a fragment 500 bp upstream of the first ORF from the alternative cluster, suggesting the presence of a negative regulation motif. Future investigations may provide us with new patterns of BNF regulation in Gram-positive bacteria, in general, and in P. riograndensis in particular.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-04-12T19:24:52Z No. of bitstreams: 1 2009_MarcioMandelliLorenzoni.pdf: 3831224 bytes, checksum: 3001c54fd129f0a73cc6293a06a30627 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-06T19:42:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_MarcioMandelliLorenzoni.pdf: 3831224 bytes, checksum: 3001c54fd129f0a73cc6293a06a30627 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-06T19:42:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_MarcioMandelliLorenzoni.pdf: 3831224 bytes, checksum: 3001c54fd129f0a73cc6293a06a30627 (MD5) Previous issue date: 2009-07 / As Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) correspondem a um grupo heterogêneo e pouco caracterizado quando comparado aos demais patotipos de E. coli. O fato de algumas linhagens descritas serem patogênicas e outras não geram dúvidas sobre a classificação precisa deste grupo. Contribui para isso, o fato de ainda não existir qualquer marcador molecular específico para genes de virulência de DAEC. Alguns patógenos da mucosa intestinal fazem uso do Sistema de Secreção Tipo Três (TTSS) para a injeção de proteínas efetoras em células alvo. Neste trabalho, utilizando linhagens de DAEC isoladas de crianças diarréicas do DF, realizamos experimentos de PCR com iniciadores definidos a partir de genes do TTSS da linhagem E23468/69 de EPEC. Assim, foram sintetizados iniciadores dirigidos às seqüências rorf1, cesAB, escR, escT e sepQ. Análises de similaridade revelaram escores de até 100% entre alguns dos produtos obtidos e linhagens de EPEC, EHEC, STEC. Foi possível identificar o fragmento de DNA referente ao provável gene escR completo, bem como de seqüências de DNA extremamente conservadas da rorf1, cesAB, escT e sepQ. Os produtos das amplificações correspondentes aos prováveis genes do TTSS foram clonados, para a criação de um banco de seqüências, visando futuras análises. Devido ao êxito na detecção de alguns prováveis genes do TTSS em nossas amostras e, uma vez que a expressão de genes do TTSS ainda não foi relatada em DAEC, experimentos visando analisar a expressão desses prováveis genes foram realizados por meio de RT-PCR, empregando RNA isolado de linhagens de DAEC em culturas submetidas a condições de indução dos genes do TTSS. Tal abordagem nos permitiu demonstrar que houve transcrição dos prováveis genes escN, escR e escT, apesar dos resultados divergirem um pouco em relação às amostras e genes testados. Nossas análises indicaram claramente a presença e a expressão dos prováveis genes do TTSS em duas das amostras de DAEC analisadas. Estudos complementares deverão ser realizados a fim de avaliarmos a funcionalidade deste sistema de secreção e os resultados obtidos certamente contribuirão na elucidação dos mecanismos de virulência deste ainda controverso patotipo. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The diffusely adhering Escherichia coli (DAEC) is a heterogeneous group and less characterized when compared to other pathotypes of E. coli. The fact that some strains are pathogenic and others not, creates doubts about the exact classification of this group. Contributes to it, the lack of molecular markers corresponding to the virulence genes of DAEC. Some intestinal pathogens use the Type Three Secretion System (TTSS) to inject effector proteins into target cells. In this study, using strains of DAEC originated from diarrheic children of DF, we performed PCR experiments employing primers based on genes of the TTSS of EPEC strain E23468/69, directed to the sequences rorf1, cesAB, escR, escT and sepQ. DNA analyses revealed similarity scores of 100% between some of the products and EPEC, EHEC and STEC strains. It was possible to detect the presence of a DNA fragment corresponding to the complete escR gene, as well as highly conserved DNA sequences homologous to rorf1, cesAB, escT, and sepQ. The amplification products corresponding to the probable TTSS genes were cloned in order to create a database of sequences, to be submitted to further analyses. The success obtained in detecting probable TTSS genes in our samples and, since the expression of genes of the TTSS has not yet been reported in DAEC, experiments were performed in order to examine the expression of these candidate genes by means of RNA extraction and reverse transcription procedures of cultures grown under TTSS genes induction conditions. This approach allowed us to conclude that the escN, escR and escT genes were transcribed, although the results differ somewhat among the samples and genes tested. Our analyses clearly showed the presence and expression of TTSS genes in two samples of DAEC. Additional studies should be conducted to assess the functionality of this secretion system, and the results certainly help in elucidating the mechanisms of virulence of this still controversial pathotype.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-06-22T17:34:58Z No. of bitstreams: 1 2011_ViniciusOliveiraDrummond.pdf: 1609526 bytes, checksum: f4744ae412556481127ea51ce3e5bc78 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-08T23:05:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_ViniciusOliveiraDrummond.pdf: 1609526 bytes, checksum: f4744ae412556481127ea51ce3e5bc78 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-08T23:05:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_ViniciusOliveiraDrummond.pdf: 1609526 bytes, checksum: f4744ae412556481127ea51ce3e5bc78 (MD5) / O crescimento da exportação brasileira de produtos de origem suína brasileira exige uma maior preocupação com a sanidade destes animais, uma vez que doenças como colites e diarreias promovem atraso no desenvolvimento e algumas vezes na morte dos animais. A Escherichia coli está entre os agentes mais comumente isolados como causadores dessas afecções e animais hígidos podem abrigar cepas de E. coli que contenham genes para a produção de fatores de virulência, como enterotoxinas. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar bioquimicamente, traçar um perfil de resistência antimicrobiana e detectar genes de toxinas em cepas de E. coli de suínos hígidos no Distrito Federal. Foram isoladas 127 cepas de E. coli de 109 suínos e identificadas bioquimicamente, inclusive para presença de hemólise em ágar sangue, testadas para genes de enterotoxinas (STa, LT-I, LT-II, Stx1 e Stx2) e resistência a antimicrobianos. Na análise bioquímica não foram observadas grandes diferenças das tabelas de identificação de enterobactérias. Das 127 cepas isoladas, em 66,1% (84) foi verificada a presença de hemólise, e dessas, somente cinco (5,9%) apresentaram genes de virulência. Oito cepas (6,3%) possuíam genes para enterotoxinas, sendo que quatro (3,2%) foram positivas somente para LT-I, três (2,4%) foram positivas somente para STa e uma (0,8%) foi positiva para STa e LT-I. Nenhuma apresentou gene para LT-II, Stx1 ou Stx2. Quanto ao perfil de resistência antimicrobiano, os antibióticos com maiores porcentagens de resistência foram a Lincomicina (100%), Sulfonamidas (74,8%), Tetraciclina (70,1%), Doxiciclina (66,1%) e Ampicilina (51,2%). Os maiores índices de sensibilidade antimicrobiana foram observados na Norfloxacina (82,7%), Gentamicina (75,6%), Sulfametoxazol + Trimetoprim (63%), Enrofloxacina (58,3%), Cloranfenicol (56,7%) e Estreptomicina (53,5%). O resultado apresentado nesse estudo demonstra que mesmo um suíno hígido pode carrear cepas de E. coli com altas taxas de resistência antimicrobiana e que possuem genes codificadores de enterotoxinas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The growth of exports of Brazilian swine products has consequently a greater concern for the health of these animals, since diseases like diarrhea and colitis promote a developmental delay and sometimes in the animal's death. Escherichia coli is among the most common isolated agents causing these injuries, and healthy swines may harbor E. coli strains that have genes for virulence factors, like enterotoxins. The goal of this study was isolation and biochemical identification, antimicrobial resistance profile and detection of genes for enterotoxins in strains of E. coli from healthy swines in Distrito Federal. A total of 127 strains of E. coli were isolated from 109 swines and biochemically tested, observed for hemolysis on blood agar, tested for enterotoxin genes (STa, LT-I, LT-II, Stx1 e Stx2) and for antimicrobial resistance. In biochemical tests there were no significative differences between the results and the enterobacterial identification tables. In 84 (66.1%) strains were observed hemolysis, and from these, five (5.9%) were positive for virulence genes. Eight strains (6.3%) had genes for enterotoxins, with four (3.2%) positive only for LT-I, three (2.4%) positive only for STa and one (0.8%) positive for both toxins. There were no positives for LT-II, Stx1 or Stx2. When antimicrobial resistance was analyzed, the most resistant antibiotics were Lincomycin (100%), Sulfonamide (74.8%), Tetracycline (70.1%), Doxycyclin (66.1%) and Ampicillin (51.2%). The most sensitive antimicrobials were Norfloxacin (82.7%), Gentamicin (75.6%), Sulfamethoxazole + Trimethoprim (63%), Enrofloxacin (58.3%), Chloramphenicol (56.7%) and Streptomycin (53.5%). These results demonstrate that even a healthy swine could carry E. coli strains with high numbers of antimicrobial resistance and with genes that encode enterotoxins.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Death from acute diarrhea has been reduced since 80Âs. However diarrhoeal diseases account for nearly 1.34 million deaths a year among children under-five years of age, making them the second most common cause of child deaths worldwide. As mortality acute diarrhea was reduced, persistent diarrhea (PD) has become a major enteric diseases infant collaborating to morbidity of affected populations. Small intestinal mucosa injury that becomes prolonged has been named as a central mechanism in the pathophysiology of PD. The protein malnutrition and infection by Escherichia coli enteroaggregative (EAEC) are strongly associated with development PD. The present study investigated the effect of supplementation of Alanyl-Glutamine on monolayer of intestinal cells in the absence of infection, evaluated some parameters of the injury caused by EAEC (strain 239-1) on the intestinal mucosa in vitro and modulation of such injury by Alanyl-Glutamine 10mM. The result show that effects of supplementation of Alanyl-Glutamine 10mM is no different from effects free glutamine 4mM. Compared to E. coli HS, EAEC infection reduced the number of migrating cells, increased the percentage of necrosis, decreased the proliferation and transcription-reverse from small GTPases (RhoA, Rac1 and Cdc42), within 6 hours of contact. The contact EAEC reduced transcription of IL-8 (6h and 0h), NF-κB (6h) and TLR5 (6h and 12h) and increased TNF-α expression. The treatment of infection with Ala-Gln 10mM altered the following parameters: reduced the percentage of necrosis, increase of cell migration, although it has not caused changes in the transcription of Rho GTPases genes, increased transcription IL-8, NF-κB (6h) e TLR5 (6h and 12h). Treatment with dipeptidio significantly reduced the secretion of TNF-α (12h) while increased protein expression of IL-6 (6 e 12h). In conclusion, found that glutamine deprivation decreases cellular response against the infectious stimulus. The EAEC appears to minimize the innate host immune defenses by reducing the transcription of NF-kB and TLR5 and limit the increased transcription of IL-8. The Ala-Gln seems to make the cell more reactive against injurious stimuli, increasing their responsiveness through increased transcriptional IL-8, NF-kB and TLR5. Moreover increased protein expression of IL-6 appears to be one of the mechanisms by which promotes Ala-Gln protective effect on the intestinal epithelial barrier. / A morte por diarreia aguda tem apresentado grande declÃnio desde a dÃcada de 80 em todas as regiÃes do mundo. Entretanto as doenÃas diarreicas ainda sÃo responsÃveis por 1,34 milhÃes de mortes infantis a cada ano e representam a segunda maior causa de mortalidade no grupo etÃrio com idade inferior a 5 anos. Com o declÃnio de mortalidade por casos de diarreia aguda a diarreia persistente (DP) se tornou uma das principais doenÃas entÃricas infantis contribuindo para morbidade das populaÃÃes afetadas. Uma lesÃo no intestino delgado que se torna prolongada tem sido colocada como elemento central da patofisiologia da DP. A desnutriÃÃo proteica e a infecÃÃo por Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) estÃo fortemente associados ao desenvolvimento da DP. O presente estudo investigou o efeito da suplementaÃÃo de Alanil-Glutamina sobre monocamada de cÃlulas da mucosa intestinal na ausÃncia de infecÃÃes. Avaliou alguns parÃmetros da lesÃo promovida por EAEC (cepa 239-1) sobre a mucosa intestinal in vitro e a modulaÃÃo de tal dano pela Alanil-Glutamina 10Mm. Os resultados obtidos mostram que os efeitos da suplementaÃÃo de Ala-Gln 10mM nÃo diferem dos efeitos exibidos pela glutamina livre 4mM. Em relaÃÃo a cepa comensal E. coli HS, a infecÃÃo com EAEC reduziu de forma significativa a quantidade de cÃlulas em migraÃÃo, aumentou o percentil de necrose, diminuiu a proliferaÃÃo celular e reduziu significativamente a transcriÃÃo dos genes das pequenas GTPases (RhoA, Cdc42 e Rac1) apÃs 6h de contato com enterÃcitos. O contato com EAEC reduziu a transcriÃÃo de IL-8 (0h e 6h), NF-κB (6h) e TLR5 (6h e 12h) e aumentou a expressÃo proteica de TNF- α (12h). O tratamento da infecÃÃo com Ala-Gln 10mM alterou significativamente os seguintes parÃmetros: aumento da quantidade de cÃlulas em migraÃÃo embora nÃo tenha causado alteraÃÃo na transcriÃÃo dos genes da pequenas GTPases, reduÃÃo do percentual de necrose, aumento da proliferaÃÃo celular, aumento da transcriÃÃo IL-8, NF-κB (6h) e TLR5 (6h e 12h). O tratamento com o dipeptidio reduziu significativamente a secreÃÃo de TNF-α (12h) enquanto aumentou a expressÃo proteica de IL-6 (6 e 12h). Em conclusÃo, verificamos que a privaÃÃo de glutamina diminui a resposta celular frente ao estÃmulo infeccioso. A EAEC, por sua vez, parece minimizar as defesas imunes inatas hospedeiro ao reduzir a transcriÃÃo de NF-kB e TLR5 e limitar o aumento da transcriÃÃo de IL-8. A Ala-Gln parece tornar a cÃlula mais reativa frente aos estÃmulos lesivos, aumentando sua capacidade de resposta atravÃs do aumento transcricional de IL-8, NF-kB e TLR5. Por outro lado o aumento da expressÃo proteica de IL-6 parece ser um dos mecanismos pelas quais Ala-Gln promove efeito protetor sobre a barreira epitelial intestinal.

O Echinococcus granulosus é um platelminto parasita da classe Cestoda, que tem, como hospedeiros definitivos, os canídeos, e, como hospedeiros intermediários mais comuns, ungulados domésticos e o homem. Este parasito é o agente etiológico da hidatidose cística, zoonose hiperendêmica no Cone Sul da América do Sul, incluindo o sul do Brasil. Para o estabelecimento e manutenção do cisto hidático por longos períodos de tempo (infecção crônica), o parasito secreta e expõe ao seu hospedeiro numerosas proteínas, que podem apresentar tanto atividade imunomoduladora, como estar relacionadas a atividades fisiológicas do parasito. As proteínas 14-3-3 constituem uma família altamente conservada de moléculas reguladoras eucarióticas, que são capazes de interagir com diferentes proteínas ligantes em diversos contextos celulares, regulando funções biológicas complexas. Em E. granulosus, foram identificadas cinco proteínas 14-3-3, sendo três isoformas ζ e duas isoformas ε. Essas proteínas podem estar envolvidas em interações parasito-hospedeiro que propiciam o estabelecimento e o desenvolvimento da forma larval patogênica (metacestódeo). Para a futura caracterização funcional da proteína 14-3-3e1 de E. granulousus (Eg14-3-3ε1), já detectada em componentes do metacestódeo, a sua sequência codificadora foi expressada em Escherichia coli. A clonagem foi realizada em dois vetores plasmidiais distintos (pGEX-TEV e pET-26b), para permitir a expressão em E. coli da proteína Eg14-3-3ε1 recombinante no citoplasma, em fusão com a GST, e no espaço periplásmatico, com cauda de histidina, respectivamente. A solubilização da Eg14-3-3ε1 em fusão com a GST foi obtida com 0,5% de sarcosil, mas no entanto não foi possível a sua purificação. A proteína Eg14-3-3ε1 com cauda de histidina foi obtida por extração da fração periplasmática seguida da purificação por cromatografia de afinidade, tendo sido obtido um rendimento final de 0,5 mg/l de cultura. A proteína Eg14-3-3ε1 recombinante purificada será futuramente utilizada em ensaios funcionais, buscando inicialmente a identificação de seus ligantes proteicos dentre o repertório de proteínas do parasito e do hospedeiro, no contexto da infecção crônica. / Echinococcus granulosus is a parasitc platyhelminth of the Cestoda class, wich has, canids as definitive hosts, domestic ungulates and humans as intermediate hosts. This parasite is the causative agent of cystic hydatid disease, a hyperendemic zoonosis in the Southern Cone of South America, including Southern Brazil. In order to the establishment and maintenance of hydatid cyst for a long period of time, the parasite secrets and exposes to its host numerous proteins, which may have immunomodulatory activity as well to be related to physiological activities of the parasite. The 14-3-3 proteins are a family of highly conserved eukaryotic regulatory molecules that are able to interact with different partner proteins in different cellular contexts, regulating complex biological functions. In E. granulosus five 14-3-3 proteins have been identified, three ζ isoform and two ε isoform. These proteins may be involved in host-parasite interactions that favor the establishment and growth of the pathogenic larval form (metacestode). For future functional characterization of the 14-3-3ε1 protein from E. granulousus (Eg14-3-3ε1) previously detected in metacestode components, its coding sequence was expressed in Escherichia coli. The cloning was done into two different plasmid vectors (pGEX-TEV and pET-26b), to produce recombinant Eg14-3-3ε1 protein in E. coli, in the cytoplasm, in fusion with GST, and periplasmatic with histidine tail, respectively. Solubilization of Eg14-3-3ε1 fused with GST was achieved with 0.5% sarcosil, yet it was not possible to purify it. The Eg14-3-3ε1 protein with histidine tail was obtained by extracting the periplasmic fraction from E. coli cultures, followed of purification by affinity chromatography, yielding 0.5 mg/l. The recombinant Eg14-3-3ε1 protein will be used in functional assays, initially aiming at the identification of protein ligands from the repertoire of proteins from the parasite and from host in the context of chronic infection.

O nitrogênio é um elemento essencial à vida na Terra. Em geral, a disponibilização desse elemento para os seres vivos se dá por meio da fixação biológica do nitrogênio (FBN). Os micro-organismos capazes de realizar a FBN são denominados de diazotróficos e contêm o complexo enzimático da nitrogenase. Por ser um processo extremamente dispendioso, a FBN é regulada, principalmente, em nível transcricional, em resposta à quantidade de nitrogênio fixado e aos níveis de oxigênio. Os mecanismos de regulação do processo em bactérias Gram-negativas estão bem caracterizados, porém, em bactérias Gram-positivas, os estudos ainda são escassos. Paenibacillus riograndensis é uma bactéria Gram-positiva diazotrófica aeróbia facultativa e formadora de esporos, cujo sequenciamento completo do genoma a capacita como um interessante modelo para o estudo da regulação da FBN. No genoma de P. riograndensis foram identificados três agrupamentos contendo genes relacionados à FBN. Um deles, com uma organização estrutural menos conservada, foi considerado inativo a partir de análises de PCR em tempo real e de atividade de promotor. Os outros dois tiveram seus transcritos identificados e induzidos sob condições de fixação de nitrogênio, sendo um deles responsável pela codificação de um sistema alternativo da nitrogenase, independente de molibdênio. Esse sistema alternativo foi identificado como sendo aquele composto apenas por ferro e validado tanto pela análise das sequências dos genes estruturais, como pela atividade enzimática em meio sem molibdênio. Sequências localizadas a aproximadamente 250 pares de bases (pb) a montante do início da tradução dos primeiros genes dos dois agrupamentos funcionais também tiveram suas atividades como regiões reguladoras validadas pelo reconhecimento em Escherichia coli, com um provável padrão de iniciação da transcrição constitutivo. Uma menor atividade de transcrição foi observada no fragmento de 500 pb localizado a montante do agrupamento dos genes da nitrogenase alternativa, indicando a presença de regiões contendo motivos de regulação negativa do processo. Investigações mais detalhadas dessas sequências podem revelar padrões inéditos para a regulação da FBN em bactérias Gram-positivas, em geral, e em P. riograndensis, em particular. / Nitrogen is an essential element for life. In general, it becomes available to biosphere mainly through biological nitrogen fixation (BNF). Microorganisms named diazotrophs perform BNF and they have the nitrogenase enzyme. As BNF is a very energetic expensive process, it is tightly regulated mainly at transcriptional level in response to available nitrogen and oxygen levels. Regulatory networks comprising BNF systems in Gramnegative bacteria are well characterized, while studies related to Gram-positive bacteria are scarce. Paenibacillus riograndensis is a Gram-positive endospore-forming facultative anaerobic diazotroph, whose complete genome sequence presents it as an interesting model for the study of BNF regulation. In P. riograndensis genome three cluster comprising BNF related genes were identified. One of them, displaying a less conserved structural organization, was stated as inactive from real time PCR and promoter activity analysis. The other ones had their transcripts identified and responded to nitrogen fixation conditions. One of the active clusters comprises genes coding for an alternative nitrogenase system independent of molybdenum, the iron-only system. This alternative system was validated by enzymatic activity under Mo-depleted conditions. Sequences 250 base pairs (bp) upstream from the first open reading frame (ORF) of each active cluster had their promoter activities validated by recognizing in Escherichia coli, showing a probable constitutive expression pattern. A weaker promoter activity was identified in a fragment 500 bp upstream of the first ORF from the alternative cluster, suggesting the presence of a negative regulation motif. Future investigations may provide us with new patterns of BNF regulation in Gram-positive bacteria, in general, and in P. riograndensis in particular.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_11634_Dissertação Mariana Teixeira Gonçalves.pdf: 2671707 bytes, checksum: 452907fd6c9a4b2755e0cb8fc98fb7ea (MD5) Previous issue date: 2017-09-27 / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno emergente causador de diarréia aguda e persistente em todo o mundo. A formação de biofilme, um aspecto notável da sua patogenicidade, está relacionada à persistência da infecção e requer tratamento antimicrobiano, sendo sugerido o uso de ampicilina, quinolona, sulfametoxazol/trimetoprim e tetraciclina. Como as técnicas habituais de determinação de suscetibilidade não refletem a atividade em biofilme tivemos como objetivo determinar a concentração mínima inibitória de biofilme (MBIC) de nove antimicrobianos de oito classes, e determinar a concentração mínima de erradicação do biofilme (MBEC), por meio do sistema Calgary (peg-lid), para amostras clínicas de EAEC, para as cepas protótipos EAEC 042 e EAEC 17-2 e para cepa de referência ATCC 25922. Concentração mínima inibitória (CMI) foi determinada para 35 amostras por diluição em ágar e foram selecionadas 20 sensíveis aos antimicrobianos ampicilina, cefotaxima, ceftriaxona, cloranfenicol, ciprofloxacina, tetraciclina e tobramicina e 19 a sulfametoxazol/trimetoprim para determinação da MBIC. Biofilme foi formado em Meio Mínimo de Eagle Modificado por Dulbecco com glicose 0,4% e foram determinados o tempo de maturação do biofilme e a intensidade de formação, tanto no poço da microplaca quanto no peg-lid. A maturação do biofilme foi atingida com 24 h; oito e 12 amostras foram classificadas como fortes e fracas formadoras de biofilme, respectivamente. Biofilme de 24 h foi submetido a diluições dobradas dos antimicrobianos em caldo Mueller-Hinton ajustado com cátion e densidade óptica a 650 nm (DO650) foi medida após a recuperação do biofilme por ultrasom, antes e após a incubação a 37ºC por 6 horas. A MBIC revelou que os biofilmes foram: (i) 100% (20/20) resistentes à tetraciclina, cloranfenicol e sulfametoxazol/trimetoprim e 90% (18/20) à ampicilina; (ii) 90% (18/20) com resistência intermediária à ceftriaxona e cefotaxima, (iii) 95% (19/20), sensíveis à ciprofloxacina, 80% (16/20) à cefoxitina e 75% (15/20) à tobramicina. Biofilme aumentou a concentração inibitória dos antimicrobianos em 2 vezes a até 4.266,7 vezes a CMI e amostras fortes formadoras aumentaram a MBIC de ampicilina, ceftriaxona e tobramicina mais do que as fracas formadoras (p<0,05). A MBEC foi sempre superior à MBIC e à última concentração testada, com exceção de cefoxitina e cefotaxima para uma amostra. Tempo de maturação de biofilme de 48h, e 72h não interferiu na MBIC. Em conclusão, a ciprofloxacina apresentou ótima atividade para biofilme de EAEC, seguida por cefoxitina e tobramicina e que não devem ser preconizados os antimicrobianos que se mostraram ineficazes como ampicilina, sulfametoxazol/trimetoprim e tetraciclinas para tratamento de infecção por EAEC.

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T10:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reis_EdmyrRosados_M.pdf: 4854452 bytes, checksum: ecc70ef9bff10aa6b6d40e9627fd776b (MD5) Previous issue date: 1996 / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Lucila Costallart Ricci, Marlene Braide Serafim / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T19:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Piton_MariaAmeliadeJesus_M.pdf: 13153764 bytes, checksum: 6ed463b9ceca25bff6a2da9c5dba060a (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Neste trabalho, foram estudadas 111 amostras de Escherichia coli isoladas de 60 fezes diarréicas de adultos e crianças encaminhados ao Hospital das Clínicas da UNICAMP, no período de Janeiro de 1992 a Março de 1994. Paralelamente, 27 cepas de E. coli isoladas de 19 amostras de fezes normais, também foram pesquisadas como grupo controle. Os 138 isolados de E. coli eram procedentes de coproculturas negativas para os enteropatógenos pertencentes aos gêneros Shigella, Salmonella e Yersinia, além dos sorogrupos mais associados aos virotipos EIEC, EPEC e EHEC. Na pesquisa da produção das enterotoxinas STa e L T-I do grupo ETEC, apenas a enterotoxina termo-Iábil foi identificada, inicialmente pela técnica sorológica da Imuno Hemólise Radial (SRIH). Porém, pela alta frequência de resultados positivos observada, esta técnica foi avaliada quanto a possíveis reações falso-positivas, a outros métodos sorológicos, métodos biológicos e a métodos moleculares normalmente também utilizados na identificação da L T -I. Dentre estas técnicas, o teste biológico utilizando-se culturas de células Vero e o GM1-ELlSA, foram os mais sensíveis na detecção da L T-I, identificando apenas 5 amostras produtoras desta enterotoxina, dentre as 111 isoladas de fezes diarréicas (3,6% ETEC L T-I). Demonstraram, desta forma, serem os mais adequados na identificação da enterotoxina L T -I em cepas isoladas de levantamentos epidemiológicos. Com relação aos testes sorológicos que utilizam hemácias de carneiro como suporte da reação hemolítica, tais como SRIH e micro-PIH (97,8% de concordância), estes podem ser utilizados como técnicas de triagem na pesquisa de L T -I. Porém, estas técnicas devem ser re padronizadas sempre que houver mudança da procedência dos eritrócitos, verificando-se a adequação da diluição do soro anti-toxina utilizado em reações sorológicas desenvolvidas com sobrenadantes de cultura de menos 10 amostras de E. coli positivas para esta enterotoxina e 10 cepas negativas. Quanto às provas de hibridização, 4 amostras hibridizaram com a sonda para L T-I, apresentando esta técnica 99,2% de concordância com a técnica de cultura celular e GM1-ELlSA. Com relação a determinação dos sorogrupos, dentre as cepas isoladas de fezes diarréicas, verificou-se maior freqüência de O11, O60 e O90, enquanto que nos isolados de fezes normais os sorogrupos mais freqüentes foram O6, O8 O14 e O87. Dentre as amostras isoladas de fezes diarréicas, dois sorogrupos descritos em EIEC (O171 e O29), além de um sorogrupo descrito para EPEC (O119) foram identificados. Maior número de produção de colicinas e maior variabilidade das mesmas foi verificado nos isolados de fezes normais (44.5% de cepas produtoras). Por outro lado, dentre as 111 amostras procedentes de fezes diarréicas, apenas 15 amostras (13,5%) produziram colicinas , dentre estas uma amostra produtora do Col V. Quanto à resistência aos antimicrobianos, as amostras isoladas de fezes diarréicas apresentaram resistência frente aos 6 antimicrobianos avaliados, superiores aos verificados junto ao grupo controle. No que diz respeito à produção de outras toxinas, uma amostra isolada de fezes diarréicas foi identificada como produtora de CNF1. Porém, produção de L T -li, VT e de CLDT não foi identificada. Por outro lado, testes em alça ligada de coelho demonstraram atividade enterotóxica em sobrenadantes de cultura de cepas não produtoras das demais toxinas. Padrões variados de hemaglutinação D-manose resistente (MRMH) foi observado, sendo que 74% dos isolados de fezes normais hemaglutinaram hemácias de galinha. Nenhum padrão MRMH foi condizente aos descritos para os diferentes Fatores de Colonização de ETEC. A estes somam-se resultados negativos frente aos soros a-CFA/I, a-CFA/II (CS2, CS3), a-CFAIV (CS4, CS5) e a-PCFO2. Com relação ao padrão de aderência às células HEp-2, em período de infecção de 3 horas e de crescimento de mais 3 horas, verificou-se 23 amostras apresentando padrão enteroagregativo, sendo 19 isoladas de fezes diarréicas e 4 de fezes normais foram estudados. Estes dados correspondem a 16.6% de amostras apresentando características do virotipo EaggEC. Dentre as cepas com este padrão, estas correspondem a 14 amostras de fezes, 13 destas de crianças abaixo de 8 anos. No grupo controle, as cepas correspondem a 4 amostras de fezes normais de adultos. Dentre as amostras com fenótipo de aderência em HEp-2, destacamos uma cepa com padrão LA/DA e uma ETEC L T-I com aderência difusa a 37°C, mas não a 16°C. Através da caracterização fenotípica das amostras em estudo, desenvolvida neste trabalho, uma triagem de cepas de interesse no estudo da enteropatogenicidade da E. coli pode ser realizada, o que certamente servirá de suporte para relevantes trabalhos posteriores / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Ciências Biológicas