El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de cuatro combinaciones de dos agentes crioprotectores permeantes más dos no permeantes sobre la calidad del semen ovino post-descongelamiento. Para esto, primero (Experimento 1) se seleccionó, entre tres dilutores (A, B y C), el más adecuado para ser usado en la segunda parte (Experimento 2), en la cual se evaluaron las siguientes combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes: 1)Glicerol - Trehalosa, 2)Glicerol - Sacarosa, 3)Etilenglicol - Trehalosa y 4)Etilenglicol - Sacarosa sobre la calidad del semen ovino post-descongelamiento. Para tal efecto, se realizaron 6 repeticiones para el Experimento 1 y 8 repeticiones para el Experimento 2. Cada repetición constó de 4 eyaculados cada una. En el experimento 1 se encontró que el Dilutor A mantenía mejor la motilidad progresiva y viabilidad e integridad acrosomal post-descongelamiento (69% y 63%) en comparación con el Dilutor B (37% y 35%) y el Dilutor C (23% y 23%). Por lo cual, el Dilutor A fue empleado en el experimento 2. En el experimento 2 se encontró que la motilidad progresiva, la viabilidad e integridad acrosomal, la termoresistencia y la integridad de membrana plasmática post-descongelamiento fue mejor en los grupos con glicerol-sacarosa (64%; 56%; 40% y 63%) y glicerol-trehalosa (64%; 58%; 38% y 60%) en comparación con los grupos con etilenglicol-sacarosa (48%; 42%; 25% y 37%) y etilenglicol-trehalosa (44%; 38%; 27% y 40%). Lo cual demuestra que el glicerol es un mejor crioprotector permeante en comparacion con el etilenglicol. Sin embargo, no existe diferencia en el uso de sacarosa o trehalosa. Se concluye que un dilutor con las características del dilutor A, utilizando glicerol más trehalosa o sacarosa constituye una buena alternativa para la criopreservación de semen ovino. / --- The objective of the study was to evaluate the effect of four combinations of two permeant and two non permeant cryoprotectant agents on the quality of post thaw ram semen. In Experiment 1, three extender were evaluated (A, B, and C) in order to have th ebetter one for the next step. In Experiment 2, different combinations of cryoprotectant agents were evaluated as follow: 1) Glycerol–Trehalose, 2) Glycerol–Sucrose, 3) Ethyleneglycol-Trehalose, and 4) Ethyleneglycol–Sucrose. In this way, 6 assays for Experiment 1 and 8 assays for the Experiment 2 were carry out. In each assay, 4 ejaculated were mixed to work as an original sample. Percentages of motility, viability and acrosomal integrity in extender A were higher (69% and 63%) than extender B (37% and 35%) and extender C (23% and 23%). Therefore, extender A was used for experiment 2. In the experiment 2, motility, viability and acrosomal integrity, thermoresistance, and plasmatic membrane integrity were higher in groups Glycerol-sucrose (64%; 56%; 40%, and 63%) and Glycerol-trehalose (64%; 58%; 38%, and 60%) in comparison with groups Ethileneglycol-sucrose (48%; 42%; 25% and 37%) and Ethileneglycol-trehalose (44%; 38%; 27% and 40%). However, there is not significative differences between sucrose or trehalose. In conclusion, an extender with characteristics of extender A, it means, using glycerol plus trehalose or sucrose constitute a good alternative for cryopreservation of ram semen. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El estudio de las biotecnologías reproductivas ha conducido a generar nueva y mejor información sobre la reproducción en mamíferos. Sin embargo, en caninos estos estudios se han desarrollado de manera más lenta que en otras especies. Es así como las técnicas de criopreservación de espermatozoides de perro representan aún un tópico que necesita ser más estudiado con el fin de lograr mejores índices de preñez. El objetivo del presente trabajo fue inmunolocalizar la enzima acrosina en espermatozoides caninos refrigerados/entibiados y capacitados in vitro, con el fin de determinar el efecto del tiempo y temperatura de incubación sobre la cinética de liberación de la acrosina durante la Reacción del Acrosoma (RA). Se recolectó un total de 7 eyaculados de 3 perros mediante manipulación digital. En cada muestra se evaluó la concentración y motilidad progresiva (MP). Los espermatozoides de cada eyaculado se refrigeraron con un diluyente en base a TRIS, fructosa, ácido cítrico y yema de huevo (20%). Luego de 24 horas en refrigeración (4º C), cada muestra libre del diluyente y resuspendida en medio de capacitación canino (CCM) fue dividida en 7 alícuotas, las que fueron incubadas separadamente por 0, 1, 2 y 3 horas a 20º y 37º C. Cada muestra en las diferentes condiciones de incubación de tiempo y temperatura fue procesada para inmunofluorescencia indirecta, empleando un anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10 y luego un anticuerpo secundario “antimouse” fluorescente. Mediante un microscopio de epifluorescencia (Nikon Optiphot2), se evaluó la ausencia (no marcados) o presencia (marcados) de marca fluorescente a nivel acrosomal, indicativo de la liberación de acrosina o la permanencia de ésta dentro del acrosoma, respectivamente. Los porcentajes de no marcados (sin marca fluorescente) obtenidos fueron aumentando significativamente a través del tiempo de incubación desde 45,14% a la hora 0 a 81,21% a las 3 h de incubación a 20º C (P < 0,05). Los espermatozoides incubados a 37° C presentaron un aumento significativo del patrón no marcado; desde 45,14% a la hora 0 a 78, 86% a las 3 horas de incubación, presentando la mayor pérdida a la segunda hora de incubación. La MP fue evaluada subjetivamente, mediante microscopIa de contraste de fases, para determinar la viabilidad espermática. Se obtuvo que a medida que transcurrió el tiempo de capacitación la MP fue disminuyendo de 78,57% a la hora 0 a 55% en la tercera hora a 20º C (P < 0,05). La MP a 37º C no experimentó una variación significativa en el tiempo. Con los resultados obtenidos se puede concluir que en espermatozoides caninos refrigerados/entibiados y capacitados in vitro, la liberación de acrosina es dependiente del tiempo, y que esta liberación se produce de manera más acelerada al aumentar la temperatura a 37º C. La motilidad, sin embargo, se vio afectada sólo por el tiempo de capacitación, sin mostrar efecto significativo la temperatura de incubación / Proyectos ENL 05/8 DID; FONDECYT 1060602

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En espermatozoides caninos criopreservados, existen pocos antecedentes respecto de la dinámica del proceso de Capacitación Espermática (CE) y de los factores que la influencian. La Reacción Acrosómica (RA), paso final de la CE, permite la liberación de la enzima acrosina, proteasa presente en el acrosoma de los espermatozoides mamíferos, que ha sido involucrada en la unión y penetración de la Zona Pelúcida (ZP). El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del tiempo y la temperatura sobre la cinética de la liberación de la enzima acrosina a través de su localización, mediante inmunofluorescencia indirecta. Los eyaculados fueron obtenidos mediante manipulación digital, siendo evaluados a través de microscopía de contraste de fases, para el análisis subjetivo de Motilidad Progresiva (MP) y el recuento de la concentración espermática, para luego ser congelados con diluyente en base a fructosa, TRIS, ácido cítrico, 20% de yema de huevo y 5% de glicerol y descongelados en agua a 60º C por 8 segundos. Los espermatozoides descongelados fueron capacitados utilizando el Medio de Capacitación Canino (CCM) a diferentes tiempos y temperaturas de incubación. Posteriormente, las muestras fueron procesadas para inmunofluorescencia, mediante la fijación de los espermatozoides y la aplicación de los anticuerpos; como primer anticuerpo se utilizó el anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10. La evaluación de los espermatozoides se realizó observando la presencia de la enzima acrosina, de acuerdo a la marca fluorescente a nivel acrosomal mediante Microscopía de Epifluorescencia (Nikon Optihot 2). Los espermatozoides caninos congelados mostraron la presencia de acrosina sólo a nivel acrosomal. Se pudo identificar 2 patrones según la presencia de la marca: a) sin marca fluorescente o patrón nulo y b) con marca fluorescente o patrón marcado. Al patrón nulo, corresponderían los espermatozoides que han experimentado la RA y por lo tanto, han liberado la enzima acrosina desde el acrosoma, mientras que al patrón marcado pertenecerían aquellos espermatozoides que no han cursado la RA y contienen la enzima en el interior del acrosoma. Al incubar los espermatozoides en medio capacitante (CCM), por periodos de 0, 30, 60 y 90 minutos y a temperaturas de 20 y 37º C se observó que el porcentaje de espermatozoides reaccionados o sin marca fluorescente aumentó a través del tiempo desde 29,71% a 65,43% a 20º C y desde 50,29% a 73,43% a 37º C de incubación. La motilidad espermática fue medida subjetivamente, mediante microscopía de contraste de fases en cada protocolo de capacitación (tiempo y temperatura) y se utilizó como medida de la viabilidad espermática. Los resultados de este estudio indicaron que la motilidad disminuyó a medida que aumentó el tiempo y la temperatura de incubación, desde un 67,14% a un 41,43% a 20º C (p < 0,05) y desde un 45% a un 25,71% a 37º C (p < 0,05). En base a los resultados obtenidos, se puede concluir que la ocurrencia de la liberación de la enzima acrosina en espermatozoides caninos congelados es afectada tanto por el tiempo de CE, como por la temperatura de incubación, traduciéndose en mayores porcentajes de liberación o pérdida de la enzima. Asimismo, la motilidad espermática disminuye a través del tiempo y al aumentar la temperatura de incubación. / Proyectos ENL 05/8 DID y FONDECYT 1060602

Human infertility is considered a serious disease of the the reproductive system that affects more than 10% of couples worldwide,and more than 30% of reported cases are related to men. The crucial step in evaluating male in fertility is a semen analysis, highly dependent on sperm morphology. However,this analysis is done at the laboratory manually and depends mainly on the doctor’s experience. Besides,it is laborious, and there is also a high degree of interlaboratory variability in the results. This article proposes applying a specialized convolutional neural network architecture (U-Net),which focuses on the segmentation of sperm cells in micrographs to overcome these problems.The results showed high scores for the model segmentation metrics such as precisión (93%), IoU score (86%),and DICE score of 93%. Moreover,we can conclude that U-net architecture turned out to be a good option to carry out the segmentation of sperm cells.