Seca e ferrugem asiática da soja (FAS) são dois dentre os principais estresses abióticos e bióticos que afetam negativamente a produtividade da soja (Glycine max L. Merrill) no mundo inteiro. A base genética da tolerância à seca e da resistência à FAS não são bem conhecidas e esclarecer como ocorre a resposta a estes estresses em soja é ainda um desafio. Atualmente, sabe-se que as plantas adaptam-se a estes estresses por meio da regulação da expressão gênica em nível transcricional e pós-transcricional. Na via da regulação pós-transcricional, microRNAs (miRNAs) têm sido apontados como importantes reguladores em várias plantas sob estresse biótico e abiótico. Entretanto, em soja, não havia sido relatado qualquer miRNA responsivo a estas condições. Neste contexto, nosso objetivo foi identificar novos miRNAs em soja e, também, caracterizar o padrão de expressão de alguns destes miRNAs durante ambos os estresses, além de buscar detectar genes alvos para estes miRNAs. Deste modo, esta tese foi dividida em capítulos, os quais apresentam os diferentes trabalhos desenvolvidos durante o doutorado. No capítulo III estão relatados os resultados da primeira investigação sobre a adequação de miRNAs como genes normalizadores em plantas. A estabilidade da expressão dos miRNAs foi investigada em diferentes tecidos e genótipos de soja, bem como entre estresses biótico e abiótico. Ao final deste trabalho, foram mostradas evidências de que a estabilidade da expressão de miRNAs pode ser maior que a de genes codificadores de proteínas em análises de RT-qPCR. No capítulo IV está descrita a descoberta de novos miRNAs a partir de bibliotecas de deficiência hídrica e FAS em soja, pelo emprego de sequenciamento de alto desempenho (Solexa). Neste estudo, foram detectados 256 miRNAs. Análises de RT-qPCR foram realizadas para alguns dos novos miRNAs, observando-se alguns miRNAs diferencialmente expressos, indicando evidência molecular para um possível envolvimento de miRNAs em processos responsivos à deficiência hídrica e FAS. Para um dos miRNAs detectado, um novo alvo foi validado, correspondendo a um gene codificador de ascorbato oxidase e possivelmente relacionado com a infecção pelo fungo da ferrugem asiática em genótipo suscetível, dados estes apresentados no capítulo V. Esta tese contribui para o aumento de informações sobre miRNAs de plantas, bem como para o entendimento da regulação gênica em soja sob estresses de deficiência hídrica e FAS. / Drought and Asian Soybean Rust (ASR) are the major abiotic and biotic stresses that negatively affect soybean (Glycine max L. Merrill) productivity around the world. The genetic basis of drought tolerance and ASR resistance are not well understood, and clarification on how the response to these stresses occur in soybean is still a challenge. Currently, it is known that adaptation is achieved through the regulation of gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels. In the way of post-transcriptional regulation, microRNAs (miRNAs) have been found to act as key regulator factors in many other plants under biotic and abiotic stresses. However, in soybean there was no report of miRNAs responsive to these conditions. In this context, our goal was to identify new miRNAs in soybean, characterize some of the miRNA expression patterns during both stresses, and try to detect target genes for the miRNAs. In this way, this thesis was divided in chapters which present the different works that were developed during the PhD period. In chapter three, the suitability of miRNAs as housekeeping genes in plants was investigated. MiRNA expression stability was analysed in different soybean tissues and genotypes as well as after abiotic or biotic stress treatments. It was shown that miRNA expression stability can be higher than the expression stability of protein-coding genes by RT-qPCR analysis. In chapter four, new miRNAs were discovered from Solexa deep sequencing of soybeans submitted to water deficit and rust infection. From these analyses 256 miRNAs were detected. RT-qPCRs were performed for some of the new miRNAs and the identification of differentially expressed miRNAs was observed, provinding molecular evidence for the possible involvement of miRNAs in the process of water deficit- and rust-stress responses. For one of the new miRNAs detected by Solexa sequencing, a new target was validated, which is a gene encoding ascorbate oxidase and that seems to be related with soybean rust infection in the genotype susceptible to the fungus (results were presented in chapter five). The present thesis contributes to improve the information about miRNAs in plantas, as well as to the understanding of soybean gene regulation under water deficit and ASR stresses.

A cafeína é uma substância amplamente consumida na forma de café, chás e refrigerantes. Estudos demonstram sua influência no comportamento alimentar aparentemente promovendo uma pequena redução na ingestão de calorias e no comportamento do tipo ansioso, onde altas doses podem induzir um estado de ansiedade. Além disso, ela parece ser neuroprotetora, e é possível que parte desse efeito seja devido a sua atividade antioxidante a qual está bem descrita in vitro. O consumo de cafeína muitas vezes está associado a situações de estresse. A exposição ao estresse crônico leva a alterações bioquímicas e comportamentais, tendo sido sugerido que aumenta a produção de radicais livres. O objetivo deste trabalho é verificar o efeito do consumo de cafeína e do estresse crônico sobre os parâmetros comportamentais, comportamento do tipo ansioso e alimentar e sobre parâmetros bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo em hipocampo, estriado e córtex cerebral de ratos. Além disso, diferenças sexo-específicas foram verificadas com relação ao comportamento do tipo ansioso e ao dano ao ADN. Ratos Wistar machos e fêmeas foram submetidos ao estresse por contenção por 40 dias. A dieta consistiu de ração padrão e cafeína 0,3 ou 1g/L na água de beber, a vontade, como única fonte de líquido disponível. Controles receberam água da torneira. A ansiedade e o comportamento alimentar foram avaliados, bem como o dano ao ADN (em hipocampo), a lipoperoxidação, o Potencial antioxidante reativo total (TRAP) e a atividade das enzimas antioxidantes Superóxido dismutase (SOD), Glutationa peroxidase (GPx) e Catalase (CAT), no hipocampo, estriado e córtex cerebral. O consumo de cafeína e o estresse crônico aumentaram o comportamento do tipo ansioso, efeito que foi observado apenas nos machos. No comportamento alimentar, a cafeína (0,3g/L e 1g/L) aumentou a latência e diminuiu o consumo de alimento doce (Froot Loops® ) no estado alimentado. Além disso, a cafeína 1g/L levou a um consumo menos intenso de alimento salgado (Cheetos®) pelos ratos no estado de jejum. Tanto a cafeína quanto o estresse aumentaram o dano ao ADN no hipocampo de ratos machos sem haver alteração nas fêmeas. Com relação ao estresse oxidativo, houve interações entre estresse e cafeína, especialmente no córtex, na atividade da SOD e da CAT, uma vez que a cafeína aumentou a atividade destas enzimas nos animais controles e não teve efeito nos estressados. Além disso, o estresse diminuiu a atividade da GPx no córtex e aumentou a atividade da SOD no estriado. Conclui-se que o estresse crônico e o consumo de cafeína levaram a um aumento no comportamento do tipo ansioso em ratos machos. Além disso, a cafeína aumentou a latência e diminuiu o consumo de Froot Loops® em ratos previamente alimentados. Por outro lado, o estresse repetido por contenção induziu um estado de maior susceptibilidade ao estresse oxidativo em algumas estruturas cerebrais devido a atividade alterada das enzimas antioxidantes, enquanto que, a administração crônica de cafeína levou em alguns casos (depende da estrutura) a um aumento na atividade de enzimas antioxidantes, sugerindo um papel neuroprotetor, que depende do estado do sujeito (estressado ou não). / Caffeine is widely consumed in coffee, tea and soft-drinks. Studies show its influence on feeding behavior apparently through slight reduction on calorie ingestion and on anxiety-like behavior, where high doses can induce anxiety states. Besides, it seems to be neuroprotective, and it is possible that part of this effect is due to its antioxidant activity, which is well described in vitro. Caffeine consumption is many times associated to stressfull situations. The exposure to chronic stress leads to biochemical and behavioral changes and it has been suggested that increases free radicals production. The aim of this work is to verify the effect of caffeine consumption and chronic stress on behavioral parameters, anxiety-like-behavior and feeding behavior and on biochemical parameters related to oxidative stress in hippocampus, striatum and brain cortex of rats. Besides, sex specifics differences were verified on anxiety-like behavior and on DNA damage. Wistar rats male and female were submitted to restraint stress for 40 days. The diet was standard chow and caffeine 0.3g/L or 1g/L in the drinking water, ad libitum, as the only source of drinking. Controls received tap water. Anxiety-like-behavior and feeding behavior were evaluated as well as DNA damage (in the hippocampus), lipoperoxidation, Total reactive antioxidant potential (TRAP), and antioxidant enzymes ativities, Superoxide Dismutase (SOD), Glutathione Peroxidase (GPx) and Catalase (CAT) in the hippocampus, striatum and brain cortex. The caffeine consumption and chronic stress increased anxiety-like behavior, effect which was observed only in males. On feeding behavioral, caffeine 0.3g/L and 1g/L increased the latency and decreased the consumption of sweet food (Froot Loops®) on feeding state. Besides, caffeine 1g/L led to a less intense consumption of salty food (Cheetos®), on fasting state. Both caffeine and stress increased the DNA damage in the hippocampus of male rats, without any alteration on females. About oxidative stress, there were interactions between caffeine and stress, specially on cortex, on SOD and CAT activities, once caffeine increased the activity of these enzymes in control animals and had no effect in stressed animals. Furthermore, stress decreased GPx activity in the cortex and increased SOD activity in the estriatum. In conclusion, chronic stress and caffeine consumption led to an increase on anxiety-like behavior in male rats. Besides, caffeine increased the latency and decreased the consumption of Froot Loops® in prefeeding rats. On the other hand, repeated restraint stress induced a state of higher susceptibility to oxidative stress in some structures, considering the altered activities of antioxidant enzymes, while the chronic administration of caffeine, led, in some cases (depending on the structure), to increased activity of antioxidant enzymes, suggesting a possible neuroprotective role, which depends on the subject state (stressed or not).

Seca e ferrugem asiática da soja (FAS) são dois dentre os principais estresses abióticos e bióticos que afetam negativamente a produtividade da soja (Glycine max L. Merrill) no mundo inteiro. A base genética da tolerância à seca e da resistência à FAS não são bem conhecidas e esclarecer como ocorre a resposta a estes estresses em soja é ainda um desafio. Atualmente, sabe-se que as plantas adaptam-se a estes estresses por meio da regulação da expressão gênica em nível transcricional e pós-transcricional. Na via da regulação pós-transcricional, microRNAs (miRNAs) têm sido apontados como importantes reguladores em várias plantas sob estresse biótico e abiótico. Entretanto, em soja, não havia sido relatado qualquer miRNA responsivo a estas condições. Neste contexto, nosso objetivo foi identificar novos miRNAs em soja e, também, caracterizar o padrão de expressão de alguns destes miRNAs durante ambos os estresses, além de buscar detectar genes alvos para estes miRNAs. Deste modo, esta tese foi dividida em capítulos, os quais apresentam os diferentes trabalhos desenvolvidos durante o doutorado. No capítulo III estão relatados os resultados da primeira investigação sobre a adequação de miRNAs como genes normalizadores em plantas. A estabilidade da expressão dos miRNAs foi investigada em diferentes tecidos e genótipos de soja, bem como entre estresses biótico e abiótico. Ao final deste trabalho, foram mostradas evidências de que a estabilidade da expressão de miRNAs pode ser maior que a de genes codificadores de proteínas em análises de RT-qPCR. No capítulo IV está descrita a descoberta de novos miRNAs a partir de bibliotecas de deficiência hídrica e FAS em soja, pelo emprego de sequenciamento de alto desempenho (Solexa). Neste estudo, foram detectados 256 miRNAs. Análises de RT-qPCR foram realizadas para alguns dos novos miRNAs, observando-se alguns miRNAs diferencialmente expressos, indicando evidência molecular para um possível envolvimento de miRNAs em processos responsivos à deficiência hídrica e FAS. Para um dos miRNAs detectado, um novo alvo foi validado, correspondendo a um gene codificador de ascorbato oxidase e possivelmente relacionado com a infecção pelo fungo da ferrugem asiática em genótipo suscetível, dados estes apresentados no capítulo V. Esta tese contribui para o aumento de informações sobre miRNAs de plantas, bem como para o entendimento da regulação gênica em soja sob estresses de deficiência hídrica e FAS. / Drought and Asian Soybean Rust (ASR) are the major abiotic and biotic stresses that negatively affect soybean (Glycine max L. Merrill) productivity around the world. The genetic basis of drought tolerance and ASR resistance are not well understood, and clarification on how the response to these stresses occur in soybean is still a challenge. Currently, it is known that adaptation is achieved through the regulation of gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels. In the way of post-transcriptional regulation, microRNAs (miRNAs) have been found to act as key regulator factors in many other plants under biotic and abiotic stresses. However, in soybean there was no report of miRNAs responsive to these conditions. In this context, our goal was to identify new miRNAs in soybean, characterize some of the miRNA expression patterns during both stresses, and try to detect target genes for the miRNAs. In this way, this thesis was divided in chapters which present the different works that were developed during the PhD period. In chapter three, the suitability of miRNAs as housekeeping genes in plants was investigated. MiRNA expression stability was analysed in different soybean tissues and genotypes as well as after abiotic or biotic stress treatments. It was shown that miRNA expression stability can be higher than the expression stability of protein-coding genes by RT-qPCR analysis. In chapter four, new miRNAs were discovered from Solexa deep sequencing of soybeans submitted to water deficit and rust infection. From these analyses 256 miRNAs were detected. RT-qPCRs were performed for some of the new miRNAs and the identification of differentially expressed miRNAs was observed, provinding molecular evidence for the possible involvement of miRNAs in the process of water deficit- and rust-stress responses. For one of the new miRNAs detected by Solexa sequencing, a new target was validated, which is a gene encoding ascorbate oxidase and that seems to be related with soybean rust infection in the genotype susceptible to the fungus (results were presented in chapter five). The present thesis contributes to improve the information about miRNAs in plantas, as well as to the understanding of soybean gene regulation under water deficit and ASR stresses.

A transformação genética é uma ferramenta importante para o estudo funcional de genes e obtenção de plantas com novas características agronômicas. A introdução de genes pela engenharia genética requer, para sua expressão otimizada, além de genes de interesse, a utilização de seqüências reguladoras da transcrição (promotores) eficazes. A obtenção de sequências promotoras raiz-específicas seria de grande valia para trabalhos de transformação genética de soja com vista à obtenção de resistência a nematóides e fungos, uma vez que permitiria o direcionamento da expressão de proteínas capazes de combater estes patógenos e outras pragas apenas nos órgãos-alvo do ataque, ou seja, raízes. O presente trabalho relata a caracterização inicial de quatro promotores de soja potencialmente raiz-específicos - GmAQP, GmAS2, GmEXT e GmRB7. A obtenção de raízes transformadas por Agrobacterium rhizogenes é uma ferramenta bastante útil para testar promotores e novos genes de interesse. Para a implementação do método de transformação mediada por A. rhizogenes em nosso laboratório, foram necessárias algumas etapas fundamentais, como a escolha de cultivares mais propícias para a transformação. Neste trabalho, foi identificada a cultivar MG/BR 46 Conquista como a que apresenta maior eficiência de transformação e menor tempo para a produção de raízes transgênicas, dois parâmetros fundamentais para tornar a técnica mais eficiente. A metodologia simples, pouco laboriosa e de rápida obtenção de resultados é essencial para atender as demandas da genômica funcional. O método já está bem estabelecido no laboratório e, além da aplicação na análise de promotores, vem sendo utilizado para testar novos genes candidatos para a transformação da soja e para a localização subcelular de proteínas codificadas pelos genes em estudo. Diversos fatores limitam a maior produtividade da soja, sendo as doenças os mais importantes e difíceis de controlar. Entre os fatores abióticos, a falta de água é responsável pela diminuição da produtividade agrícola, além de restringir as latitudes e os solos onde espécies comercialmente importantes podem ser cultivadas. Com o objetivo de aumentar a resistência a estresses abióticos e bióticos foi introduzido em soja o gene SnOLP, que codifica uma osmotina de Solanum nigrum. Foram obtidas três linhagens transgênicas, todas com uma única cópia do transgene. As análises de gerações segregantes confirmaram a integração estável do transgene. A linhagem B1, proveniente da transformação da cultivar Bragg, apresenta melhores resultados, tanto na resposta a estresses bióticos (fungos) quanto abióticos (seca). Os resultados obtidos no presente estudo mostram que existe potencial para a aplicação do gene SnOLP em estratégias de melhoramento da soja. / Genetic transformation is an important tool for functional studies of genes and generation of plants with new traits. The introduction of genes by genetic engineering requires for its optimal expression, effective transcription regulatory sequences (promoters). Root-specific promoter sequences would be valuable for studies on soybean genetic transformation to obtain nematode and fungal resistance, since they allow the expression of the interest protein in organs usually attacked by diseases - the roots. This thesis reports the initial characterization of four putative root-specific soybean promoters - GmAQP, GmAS2, GmEXT and GmRB7. Transgenic roots transformed by Agrobacterium rhizogenes are useful tool for screening of new promoters and genes of interest. To implement the transformation method mediated by A. rhizogenes in our lab, it was necessary some previous key steps, such as the choice of cultivars more susceptible to the bacteriam infection. MG/BR 46 Conquista cultivar was found to be the most susceptible and can be recommended for A. rhizogenes-mediated transformation experiments. The methodology is simple and fast, essential characteristics to meet the demands of functional genomics. The method is well established in the laboratory and, in addition to analysis of promoters, it has been used to test new genes for soybean transformation and subcellular localization of proteins encoded by the genes under study. Among the many factors that limit soybean yield, diseases are among the most important and difficult to control. Furthermore, the water deficit constrains agricultural productivity, restricting the latitudes and soils where commercially important species can be cultivated. Aiming to obtain increased resistance to abiotic and biotic stresses the osmotin encoding gene (SnOLP) from Solanum nigrum was introduced into soybean cultivars. Three transgenic lines with one transgene copy were obtained. The segregation analysis confirmed the stable integration of SnOLP. In vitro bioassays indicate that B1 transgenic line, derived from Bragg cultivar, was more resistant against economically important pathogenic fungi as well as more tolerant to drought. The results of this study show potential application of SnOLP in strategies for soybean breeding.

Vários estudos mostram que exposição ao estresse crônico induz alterações na nocicepção. Essas alterações são dependentes de vários fatores. Por exemplo, há diversos trabalhos que sugerem que hormônios gonadais, incluindo o estradiol, possam modular respostas nociceptivas em diferentes fases do ciclo estral em ratas. Os efeitos sobre as respostas nociceptivas induzidas por estresse e por estradiol possivelmente envolvem mudanças neuroquímicas em regiões do sistema nervoso central, como a medula espinhal. O glutamato é de fundamental importância na sinalização nociceptiva. Além disso, a transmissão glutamatérgica poder ser regulada por hormônios do estresse e estradiol, e seu desequilíbrio pode induzir um estado de estresse oxidativo. Partindo do exposto acima, nosso objetivo foi (1) avaliar o envolvimento do estresse repetido e da reposição com estradiol em ratas ovariectomizadas sobre a nocicepção, utilizando a medida da latência de retirada de cauda antes e após a exposição a sabores palatáveis (doce) e não palatáveis (ácido); (2) avaliar o envolvimento do estresse crônico e da reposição com estradiol em ratas ovariectomizadas sobre a liberação e captação de glutamato em sinaptossomas de medula espinhal; e (3) avaliar o envolvimento do estresse crônico e da reposição com estradiol em ratas ovariectomizadas sobre parâmetros de estresse oxidativo. Primeiro, ratas Wistar foram ovariectomizadas (OVX) e divididas em 2 grupos: com reposição de estradiol e veículo (óleo de girassol), e então subdivididas em 2 grupos: submetidas ao estresse crônico (contenção durante 40 dias, 5 dias/semana, 1h/dia), e controles (sem estresse), resultando nos seguintes grupos experimentais: CO (controle-óleo); CH (controle-hormônio); EO (estresse-óleo) e EH (estresse-hormônio). Após o período de estresse crônico foi avaliada a medida da latência de retirada de cauda (basal) e após a exposição aos sabores doce (Froot Loops) e ácido (ácido acético 5%). Verificamos que houve interação entre o tratamento com estradiol e a exposição ao sabor doce, aumentando o limiar nociceptivo, porém não houve diferença na medida da latência basal. Houve efeito do ácido aumentando o limiar nociceptivo em todos os grupos e houve interação significativa entre o estresse crônico e a exposição ao ácido, potencializando o aumento do limiar nociceptivo nos grupos estressados. Vinte e quatro h após a última sessão de estresse as ratas foram decapitadas e a medula espinhal dissecada, sendo verificado a captação de liberação de glutamato em sinaptossomas. Houve um aumento da captação de glutamato nas ratas com reposição de estradiol e uma diminuição nos animais submetidos ao estresse crônico. Observou-se também um aumento da expressão dos transportadores de glutamato analisados por western blot (GLAST, GLT1 e EAAC1) no grupo EO, sem efeito do estresse sobre a expressão desses transportadores. Não houve diferença significativa na liberação de glutamato. No que concerne a avaliação do estresse oxidativo, houve uma diminuição do potencial antioxidante total (TRAP) e um aumento da atividade da superóxido dismutase (SOD) naqueles animais submetidos ao estresse crônico (EO e EH). Além disso, os grupos com reposição de estradiol (CH e EH) apresentaram uma diminuição da atividade da enzima glutationa peroxidase (GPx). Não houve diferença na lipoperoxidação analisada pelo teste de TBARS. Os resultados acima sugerem que o estradiol module a resposta nociceptiva ao sabor doce. O ácido acético foi capaz de induzir antinocicepção, e esse efeito foi potencializado pelo estresse. Os resultados sobre a captação de glutamato sugerem um possível efeito neuroprotetor da reposição com estradiol, aumentando a captação de glutamato pela diminuição de seus transportadores. Em contraste, o estresse crônico diminui a captação de glutamato. Além disso, o estresse crônico diminuiu defesas antioxidantes e aumenta a atividade da enzima SOD, talvez por um aumento da formação de íons superóxidos. Com isso, tanto a exposição ao estresse crônico como o tratamento de reposição de estradiol parecem induzir mecanismos plásticos na medula espinhal.

Vários estudos mostram que exposição ao estresse crônico induz alterações na nocicepção. Essas alterações são dependentes de vários fatores. Por exemplo, há diversos trabalhos que sugerem que hormônios gonadais, incluindo o estradiol, possam modular respostas nociceptivas em diferentes fases do ciclo estral em ratas. Os efeitos sobre as respostas nociceptivas induzidas por estresse e por estradiol possivelmente envolvem mudanças neuroquímicas em regiões do sistema nervoso central, como a medula espinhal. O glutamato é de fundamental importância na sinalização nociceptiva. Além disso, a transmissão glutamatérgica poder ser regulada por hormônios do estresse e estradiol, e seu desequilíbrio pode induzir um estado de estresse oxidativo. Partindo do exposto acima, nosso objetivo foi (1) avaliar o envolvimento do estresse repetido e da reposição com estradiol em ratas ovariectomizadas sobre a nocicepção, utilizando a medida da latência de retirada de cauda antes e após a exposição a sabores palatáveis (doce) e não palatáveis (ácido); (2) avaliar o envolvimento do estresse crônico e da reposição com estradiol em ratas ovariectomizadas sobre a liberação e captação de glutamato em sinaptossomas de medula espinhal; e (3) avaliar o envolvimento do estresse crônico e da reposição com estradiol em ratas ovariectomizadas sobre parâmetros de estresse oxidativo. Primeiro, ratas Wistar foram ovariectomizadas (OVX) e divididas em 2 grupos: com reposição de estradiol e veículo (óleo de girassol), e então subdivididas em 2 grupos: submetidas ao estresse crônico (contenção durante 40 dias, 5 dias/semana, 1h/dia), e controles (sem estresse), resultando nos seguintes grupos experimentais: CO (controle-óleo); CH (controle-hormônio); EO (estresse-óleo) e EH (estresse-hormônio). Após o período de estresse crônico foi avaliada a medida da latência de retirada de cauda (basal) e após a exposição aos sabores doce (Froot Loops) e ácido (ácido acético 5%). Verificamos que houve interação entre o tratamento com estradiol e a exposição ao sabor doce, aumentando o limiar nociceptivo, porém não houve diferença na medida da latência basal. Houve efeito do ácido aumentando o limiar nociceptivo em todos os grupos e houve interação significativa entre o estresse crônico e a exposição ao ácido, potencializando o aumento do limiar nociceptivo nos grupos estressados. Vinte e quatro h após a última sessão de estresse as ratas foram decapitadas e a medula espinhal dissecada, sendo verificado a captação de liberação de glutamato em sinaptossomas. Houve um aumento da captação de glutamato nas ratas com reposição de estradiol e uma diminuição nos animais submetidos ao estresse crônico. Observou-se também um aumento da expressão dos transportadores de glutamato analisados por western blot (GLAST, GLT1 e EAAC1) no grupo EO, sem efeito do estresse sobre a expressão desses transportadores. Não houve diferença significativa na liberação de glutamato. No que concerne a avaliação do estresse oxidativo, houve uma diminuição do potencial antioxidante total (TRAP) e um aumento da atividade da superóxido dismutase (SOD) naqueles animais submetidos ao estresse crônico (EO e EH). Além disso, os grupos com reposição de estradiol (CH e EH) apresentaram uma diminuição da atividade da enzima glutationa peroxidase (GPx). Não houve diferença na lipoperoxidação analisada pelo teste de TBARS. Os resultados acima sugerem que o estradiol module a resposta nociceptiva ao sabor doce. O ácido acético foi capaz de induzir antinocicepção, e esse efeito foi potencializado pelo estresse. Os resultados sobre a captação de glutamato sugerem um possível efeito neuroprotetor da reposição com estradiol, aumentando a captação de glutamato pela diminuição de seus transportadores. Em contraste, o estresse crônico diminui a captação de glutamato. Além disso, o estresse crônico diminuiu defesas antioxidantes e aumenta a atividade da enzima SOD, talvez por um aumento da formação de íons superóxidos. Com isso, tanto a exposição ao estresse crônico como o tratamento de reposição de estradiol parecem induzir mecanismos plásticos na medula espinhal.

A cafeína é uma substância amplamente consumida na forma de café, chás e refrigerantes. Estudos demonstram sua influência no comportamento alimentar aparentemente promovendo uma pequena redução na ingestão de calorias e no comportamento do tipo ansioso, onde altas doses podem induzir um estado de ansiedade. Além disso, ela parece ser neuroprotetora, e é possível que parte desse efeito seja devido a sua atividade antioxidante a qual está bem descrita in vitro. O consumo de cafeína muitas vezes está associado a situações de estresse. A exposição ao estresse crônico leva a alterações bioquímicas e comportamentais, tendo sido sugerido que aumenta a produção de radicais livres. O objetivo deste trabalho é verificar o efeito do consumo de cafeína e do estresse crônico sobre os parâmetros comportamentais, comportamento do tipo ansioso e alimentar e sobre parâmetros bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo em hipocampo, estriado e córtex cerebral de ratos. Além disso, diferenças sexo-específicas foram verificadas com relação ao comportamento do tipo ansioso e ao dano ao ADN. Ratos Wistar machos e fêmeas foram submetidos ao estresse por contenção por 40 dias. A dieta consistiu de ração padrão e cafeína 0,3 ou 1g/L na água de beber, a vontade, como única fonte de líquido disponível. Controles receberam água da torneira. A ansiedade e o comportamento alimentar foram avaliados, bem como o dano ao ADN (em hipocampo), a lipoperoxidação, o Potencial antioxidante reativo total (TRAP) e a atividade das enzimas antioxidantes Superóxido dismutase (SOD), Glutationa peroxidase (GPx) e Catalase (CAT), no hipocampo, estriado e córtex cerebral. O consumo de cafeína e o estresse crônico aumentaram o comportamento do tipo ansioso, efeito que foi observado apenas nos machos. No comportamento alimentar, a cafeína (0,3g/L e 1g/L) aumentou a latência e diminuiu o consumo de alimento doce (Froot Loops® ) no estado alimentado. Além disso, a cafeína 1g/L levou a um consumo menos intenso de alimento salgado (Cheetos®) pelos ratos no estado de jejum. Tanto a cafeína quanto o estresse aumentaram o dano ao ADN no hipocampo de ratos machos sem haver alteração nas fêmeas. Com relação ao estresse oxidativo, houve interações entre estresse e cafeína, especialmente no córtex, na atividade da SOD e da CAT, uma vez que a cafeína aumentou a atividade destas enzimas nos animais controles e não teve efeito nos estressados. Além disso, o estresse diminuiu a atividade da GPx no córtex e aumentou a atividade da SOD no estriado. Conclui-se que o estresse crônico e o consumo de cafeína levaram a um aumento no comportamento do tipo ansioso em ratos machos. Além disso, a cafeína aumentou a latência e diminuiu o consumo de Froot Loops® em ratos previamente alimentados. Por outro lado, o estresse repetido por contenção induziu um estado de maior susceptibilidade ao estresse oxidativo em algumas estruturas cerebrais devido a atividade alterada das enzimas antioxidantes, enquanto que, a administração crônica de cafeína levou em alguns casos (depende da estrutura) a um aumento na atividade de enzimas antioxidantes, sugerindo um papel neuroprotetor, que depende do estado do sujeito (estressado ou não). / Caffeine is widely consumed in coffee, tea and soft-drinks. Studies show its influence on feeding behavior apparently through slight reduction on calorie ingestion and on anxiety-like behavior, where high doses can induce anxiety states. Besides, it seems to be neuroprotective, and it is possible that part of this effect is due to its antioxidant activity, which is well described in vitro. Caffeine consumption is many times associated to stressfull situations. The exposure to chronic stress leads to biochemical and behavioral changes and it has been suggested that increases free radicals production. The aim of this work is to verify the effect of caffeine consumption and chronic stress on behavioral parameters, anxiety-like-behavior and feeding behavior and on biochemical parameters related to oxidative stress in hippocampus, striatum and brain cortex of rats. Besides, sex specifics differences were verified on anxiety-like behavior and on DNA damage. Wistar rats male and female were submitted to restraint stress for 40 days. The diet was standard chow and caffeine 0.3g/L or 1g/L in the drinking water, ad libitum, as the only source of drinking. Controls received tap water. Anxiety-like-behavior and feeding behavior were evaluated as well as DNA damage (in the hippocampus), lipoperoxidation, Total reactive antioxidant potential (TRAP), and antioxidant enzymes ativities, Superoxide Dismutase (SOD), Glutathione Peroxidase (GPx) and Catalase (CAT) in the hippocampus, striatum and brain cortex. The caffeine consumption and chronic stress increased anxiety-like behavior, effect which was observed only in males. On feeding behavioral, caffeine 0.3g/L and 1g/L increased the latency and decreased the consumption of sweet food (Froot Loops®) on feeding state. Besides, caffeine 1g/L led to a less intense consumption of salty food (Cheetos®), on fasting state. Both caffeine and stress increased the DNA damage in the hippocampus of male rats, without any alteration on females. About oxidative stress, there were interactions between caffeine and stress, specially on cortex, on SOD and CAT activities, once caffeine increased the activity of these enzymes in control animals and had no effect in stressed animals. Furthermore, stress decreased GPx activity in the cortex and increased SOD activity in the estriatum. In conclusion, chronic stress and caffeine consumption led to an increase on anxiety-like behavior in male rats. Besides, caffeine increased the latency and decreased the consumption of Froot Loops® in prefeeding rats. On the other hand, repeated restraint stress induced a state of higher susceptibility to oxidative stress in some structures, considering the altered activities of antioxidant enzymes, while the chronic administration of caffeine, led, in some cases (depending on the structure), to increased activity of antioxidant enzymes, suggesting a possible neuroprotective role, which depends on the subject state (stressed or not).

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T14:12:17Z No. of bitstreams: 2 Soares_Cavalcanti_2012.pdf: 11221013 bytes, checksum: 7eb327b482f44460785cac40a729916d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T14:12:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Soares_Cavalcanti_2012.pdf: 11221013 bytes, checksum: 7eb327b482f44460785cac40a729916d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / FACEPE / As mudanças climáticas globais sinalizam para um rearranjo importante na distribuição geográfica e abundância das espécies, diminuição da biodiversidade e extensão das terras afetadas pela seca e salinidade, dentre outros. Juntos os estresses abióticos são responsáveis por desencadear uma série de respostas nas plantas, que podem ser percebidas através das modificações morfológicas, fisiológicas, metabólicas e/ou moleculares, a fim de tolerar estes estresses. As respostas moleculares envolvidas nestes processos podem ser divididas em dois grupos principais: (I) aquelas que envolvem a ativação ou repressão de genes que atuam diretamente nas respostas, como as aquaporinas e os transportadores iônicos, dentre outros; e (II) aquelas que participam das etapas intermediárias destas respostas, como as proteínas quinases e os fatores de transcrição. Neste contexto, a pesquisa aqui apresentada teve como objetivo principal identificar e caracterizar os genes envolvidos na tolerância ao déficit hídrico e ao excesso de sais solúveis no solo em plantas superiores, partindo das informações disponíveis para a planta modelo Arabidopsis thaliana L.. A partir de bancos de dados privados e públicos e com o auxílio de ferramentas e programas in silico foi possível observar que a maioria dos genes superexpressos em arabidopsis sob condições de estresse salino e hídrico foram identificados nos genomas das plantas superiores estudadas. As diferenças observadas com relação à abundância dos genes, diversidade de isoformas ou nas estruturas gênicas e proteicas parecem ser atribuídas às mutações, incluindo indels, que ocorreram durante o processo de evolução e especiação das plantas. Tais modificações nos genomas das plantas são provavelmente resultantes dos processos de adaptação e seleção natural sofridos por estes organismos. Ainda, considerando a importância dos fatores de transcrição na modulação das respostas aos estresses abióticos foi elaborado um pipeline que integra vários programas e ferramentas de caracterização destes fatores; a criação deste workflow surgiu da necessidade de uma ferramenta única que fosse capaz de avaliar diferentes atributos dos fatores de transcrição, de forma que sua caracterização fosse a mais completa possível. Finalmente, os resultados apresentados serão de grande importância para entender melhor os mecanismos de respostas das plantas superiores aos estresses abióticos. Os dados obtidos neste projeto poderão ser úteis no delineamento de experimentos in vitro e in vivo visando o melhoramento genético de plantas de interesse econômico.

As espécies reativas de oxigênio (ROS) são importantes moléculas sinalizadoras, ou mensageiros secundários, em uma complexa rede de sinalização, que em plantas, é fundamental para o desenvolvimento, e para a resposta a diferentes estímulos ambientais. Por outro lado, estas moléculas representam uma ameaça oxidativa à celula, e em altas concentrações podem danificar diferentes componentes celulares. Dessa forma, as vias de produção e eliminação de ROS devem ser finamente moduladas. Apesar destas vias terem sido amplamente estudadas, incontáveis aspectos ainda permanecem desconhecidos. Este trabalho objetivou estudar os mecanismos de geração e eliminação de ROS nas mitocôndrias e cloroplastos, e seus efeitos no desenvolvimento e na resposta de plantas ao estresse. Assim, foi demonstrado que a enzima succinato desidrogenase (SDH), correspondente ao complexo II da respiração, é um importante sítio de geração de ROS em células vegetais. Além disso, a manipulação da geração de ROS em organelas, como a mitocôndria e o cloroplasto, promoveu alterações claras no padrão de desenvolvimento e nas respostas de plantas a diferentes estresses. Enquanto a indução da geração mitocondrial de ROS via SDH inibiu o desenvolvimento e levou a ativação da expressão de genes de defesa. Por outro lado, alterações nas respostas antioxidantes no cloroplasto, via manipulação genética das ascorbato peroxidases cloroplastídicas (OsAPX7 e OsAPX8), embora tenham afetado em menor grau o desenvolvimento da planta, modularam os parâmetros fisiológicos e a resposta ao estresse. Desta forma, plantas de arroz silenciadas, ou nocaute, para a isoformas cloroplastídicas de APX apresentaram um padrão diferenciado de abertura estomática e tolerância ao estresse hídrico. Além disso, experimentos de monohíbrido permitiram a identificação dos fatores de trasncrição OsDST, OsABF7, Os11g28270 e OsVOZ1, como potenciais reguladores da expressão de OsAPX8. A complexidade das respostas induzidas por ROS indicam que estas possuem uma alta especificidade e dependem da localização subcelular e da atividade de cada um dos componentes dessa intricada rede de sinalização, assim como o nível de expressão de cada um deles. O conjunto dos resultados obtidos amplia a visão do papel das ROS no desenvolvimento vegetal e nos mecanismos de respostas de plantas a estímulos ambientais geradores de estresse oxidativo. / The reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, or secondary messengers, involved in a complex signaling network, which, in plants, is essential for development, and different environmental stimuli responses. Moreover, these molecules represent an oxidative risk to the cell, and at high concentrations may damage various cellular components. Thus, the ROS production and elimination routes should be finely regulated. Although these pathways have been extensively studied, many aspects remain unknown. Here we investigated the mechanisms of generation and elimination of ROS in mitochondria and chloroplasts, and its effects in plant development and stress responses. The results demonstrated that the enzyme succinate dehydrogenase, which corresponds to the mitochondrial complex II, is an important site of ROS production in plant cells. In addition, the control of ROS production in cellular organelles, such as mitochondria and chloroplast, promotes changes in development patterns and in plant stress response. While the induction of mitochondrial ROS production by SDH inhibit the development and activated defense genes expression, changes in chloroplast antioxidant response, by genetic manipulation of chloroplastic ascorbate peroxidases (OsAPX7 e OsAPX8), modulates physiologic parameters and stress response, despite inducing lower changes related to plant development. In this way, rice plants silenced or knockout for chloroplastic isoforms of APX showed a differential stomata opening pattern and drought stress tolerance. In addition, one-hybrid experiments, allowed the identification of the transcription factors OsDST, OsABF7, Os11g28270 e OsVOZ1, as potential regulators of the OsAPX8 expression. The complexity of the responses induced by ROS indicates that these mechanisms have a high specificity and is dependent of the subcelullar location, their activity, and the expression of each one of the components of this signaling network. The results obtained expands our vision of the role of ROS in plant development and in plant responses to environmental stimuli related to oxidative stress.

Orientadora : Profa. Dra. Joice Mara Facco Stefanello / Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Educaçao Física. Defesa: Curitiba, 25/03/2010 / Bibliografia: fls. 92-101 / Área de concentraçao: Exercício e esporte / Resumo: O estresse tem sido apontado como um dos fatores mais determinantes do desempenho no esporte de alto rendimento. Quanto mais elevado o nível competitivo, maiores são as cobranças e maior deverá ser a capacidade do atleta em saber lidar com a pressão. Nesse sentido, o principal objetivo do presente estudo foi analisar a relação entre estado atual de estresse e recuperação, fatores, sintomas, níveis fisiológicos de estresse competitivo e desempenho de golfistas profissionais durante a partida. Participaram do estudo 20 golfistas profissionais do sexo masculino, filiados na Federação Paranaense e Catarinense de Golfe. Para identificar as situações de estresse competitivo foi utilizado um segmento do Inventário Feedback de Execução. O estado atual de estresse e recuperação dos golfistas foi avaliado pelo uestionário de Estresse e Recuperação para Atletas (RESTQ-76 Sport). Para a identificação dos sintomas de estresse pré-competitivo utilizou-se a Lista de Sintomas de Estresse Pré-competitivo (LSSPCI). Os níveis fisiológicos de estresse competitivo foram avaliados por meio do cortisol salivar, utilizan o-se o tubo Salivette® (Sarstedt AG & Co.). O desempenho dos atletas foi avaliada por meio do cartão guia do jogador, cedido pela comissão organizadora do campeonato. Os resultados encontrados no presente estudo demonstraram que: (a) os principais os fatores geradores de estresse competitivo percebidos pelos atletas foram fatores situacionais (erros e "jogo lento"); (b) os atletas apresentaram níveis de estresse negativos e níveis de recuperação positivos quando avaliados pelo RESTQ-76 Sport; (c) o nível geral de estresse ré-competitivo avaliado pela LSSPCI foi moderado; (d) houve diferença nos níveis de estresse dos atletas quando compararam-se as concentrações de cortisol salivar nos dias de competição com as coletas realizadas em condições de repouso, encontrando-se níveis mais elevados de estresse antes e após a partida; (e) houve correlação entre os índices psicológicos.; não houve correlação entre as medidas isiológicas e psicológicas do estresse e o desempenho esportivo do golfista. Com o presente estudo, pode-se concluir que os níveis de estresse competitivo parecem ser diferenciados quando avaliados por medidas subjetivas (questionários) e medidas objetivas (cortisol salivar). Além disso, os níveis de estresse competitivo dos golfistas pareceram não ser suficientemente altos para causar elevações significativas na secreção de cortisol dos atletas. / Abstract: Stress has been pointed as one determinant factor of elite sports performance. There are higher demands when the competitive level is also high and athletes must know how to deal with pressure. The aim of the present study was to analyze therelation among stress level, recovery, factors, symptoms, competitive stress physiological levels and games participation of professional golfers. The sample was composed of 20 male professional golfers from two states in Brazil. A part of Feedback de Execução Inventory was applied to identify competitive stress situations. Golfers stress level and recovery was evaluated by RESTQ-76 Sport. The List of Pre-competitive Stress Symptoms (LSSPCI) was used to identify precompetitive stress symptoms. Physiological levels of competitive stress were identified through salivary cortisol, using Salivette® tube (Sarstedt AG & Co.). Athletes’ games participation was assessed through a player’s guide card, provided by the Competition Committee. Results found in the study show that: (a) the main competitive stress factors perceived by the athletes were situational factors (misses and "slow game"); (b) athletes showed negative stress levels and positive recovery levels when evaluated through RESTQ-76 Sport; (c) general level of competitive stress was considered moderate by LSSPCI; (d) differences were found in athletes’ stress level when comparing salivary cortisol concentrations during the competition days and in rest conditions (higher competitive stress levels before and after the game); (e) correlation was found between psychological indexes; (f) no correlation between physiological and psychological stress measures and games participation of the golfers. Competitive stress levels may differ when assessed by subjective protocols (questionnaires) and direct assessment (salivary cortisol). Besides, golfers competitive stress levels showed to be not high enough to increase significantly the cortisol secretion of the athletes.