Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-09-14T19:04:53Z No. of bitstreams: 1 DissLACon.pdf: 3897175 bytes, checksum: 00c39fb2aaba768abfa726b4ee62d2cc (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-15T14:24:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLACon.pdf: 3897175 bytes, checksum: 00c39fb2aaba768abfa726b4ee62d2cc (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-15T14:24:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLACon.pdf: 3897175 bytes, checksum: 00c39fb2aaba768abfa726b4ee62d2cc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-15T14:24:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLACon.pdf: 3897175 bytes, checksum: 00c39fb2aaba768abfa726b4ee62d2cc (MD5) Previous issue date: 2015-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / This study addressed the use of solid residues from the process of cellulosic ethanol production using the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse for the production of cellulose nanocrystals (CNCs). Bagasse submitted to two types of pretreatments (steam explosion - SESB and hydrothermal - HSB) was hydrolyzed with two different enzymatic loads using a commercial enzymatic extract. The solid residues generated after the hydrolysis were purified with NaOH 5% (w/w) at 55 °C and H2O2 35% (v/v) followed by an acid hydrolysis at 45 °C with H2SO4 60% (w/w) and extraction of 30 min in order to obtain the CNCs. The samples of SESB and HSB presented cellulose contents of 61 and 54%, respectively. The conversion in the enzymatic hydrolysis step ranged from 25 to 55% for SESB and 33 to 59% for HSB, along with the increase of enzymatic loading. And besides the release of glucose into the liquid phase, it was also generated solid residues with significant quantity of cellulose to be used for CNCs production. Due to decreasing of the cellulose crystallinity indexes (CI%) of the residual solid, a purification procedure was necessary, which raised the CI by about 30% for SESB residues and approximately 25% for HSB residues. The resulting CNCs presented proper physical and chemical characteristics, such as degradation temperature exceeding 230°C and crystallinity around 79% for both matrices. The CNCs obtained feature of needle with length between 193 and 246 nm and diameter of between 17 and 30 nm. These results indicate that CNCs produced from the residual streams of enzymatic route of cellulosic ethanol production from the sugarcane bagasse have the characteristics suitable for this type of product. Therefore, the use of these solids residues for new materials production, such as NCCs for use in different applications proved to be potentially promising for adding value to the bioenergy sector. / O presente estudo avaliou o emprego dos resíduos sólidos do processo de produção de etanol celulósico a partir da hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar para a produção de nanocristais de celulose (NCCs). Bagaço submetido a dois tipos de pré-tratamentos (explosão a vapor - BEX e hidrotérmico - BH) foi hidrolisado com duas diferentes cargas enzimáticas utilizando um extrato enzimático comercial. Os resíduos sólidos gerados após a hidrólise foram purificados com NaOH 5% (m/m) a 55oC e H2O2 35% (v/v) seguido de uma hidrólise ácida a 45oC com H2SO4 60% (m/m) e extração de 30 min, visando a obtenção dos NCCs. As amostras de BEX e BH apresentaram teores de 61 e 54% de celulose, respectivamente. A conversão na etapa de hidrólise enzimática variou de 25 a 55% para o BEX e de 33 a 59% para o BH, com o aumento da carga enzimática. Assim, além da liberação da glicose para a fase líquida, na etapa de hidrólise enzimática foi gerado um resíduo sólido com quantidade significativa de celulose para os processos subsequentes de obtenção de NCCs. Devido à diminuição dos índices de cristalinidade da celulose (IC%) dos sólidos residuais, foi necessário um procedimento de purificação que elevou o IC% em aproximadamente 30% para os resíduos do BEX e aproximadamente 25% para os resíduos do BH. A partir disso, os NCCs apresentaram características físico-químicas adequadas, como temperatura de degradação superior a 230°C e cristalinidade próxima de 79% para ambas as matrizes. Os NCCs obtidos apresentaram formato de agulha com comprimento entre 193 e 246 nm e diâmetro entre 17 e 30 nm. Esses resultados indicam que os NCCs produzidos a partir das correntes residuais da rota enzimática de produção de etanol celulósico a partir do bagaço de cana-de-açúcar possuem as características adequadas para esse tipo de produto. Portanto, a utilização desses resíduos sólidos para a produção de novos materiais, tais como os NCCs para aplicações em diversos setores industriais, mostrou-se potencialmente promissora para a agregação de valor ao setor de bioenergia.

A fim de contornar a problemática imposta pela recalcitrância da parede celular à hidrólise, o processo de produção de etanol a partir de biomassa vegetal requer um passo denominado de pré-tratamento, que consiste em tornar a biomassa mais acessível à ação de glicosil hidrolases que atacam a parede celular. O melhor conhecimento de processos de degradação de parede operados pela própria planta tem o potencial de direcionar as pesquisas em bioernegia, indicando quais os mecanismos mais eficientes para desmontar o complexo de polímeros da parede celular. Cunhado pré-tratamento biológico, este consiste na hidrólise de polissacarídeos estruturais empregando mecanismos e elementos chave de processos de degradação de parede celular que ocorrem na própria planta. Um exemplo de evento com esta característica é a formação de aerênquima lisígeno, que consiste na abertura de espaços de gás em tecidos parenquimáticos. A formação do aerênquima em cana-de-açúcar se dá de forma modular, sendo o processo constituído por seis etapas: 1) percepção do sinal inicial; 2) separação celular: 3) expansão celular; 4) morte celular programada; 5) hidrólise de hemiceluloses e 6) hidrólise de celulose. O presente trabalho teve como principal foco estudar a regulação das duas etapas iniciais, visando obter conhecimentos que possibilitem para tornar a biomassa de cana de açúcar menos resistente à penetração de enzimas. O aerênquima ocorre na raiz de cana-de-açúcar por um processo constitutivo. Sua independência de um indutor externo foi corroborada mediante tratamento com nutrientes e inibidor da percepção por etileno (1-MCP) pela análise dos cinco centímetros mais apicais da raiz. O atraso na formação do aerênquima após tratamento com nutrientes levou à expressão diferencial de genes relacionados à degradação de parede celular, morte celular programada e sinalização por etileno. Por outro lado, o 1-MCP não afetou visivelmente a formação do aerênquima, porém alterou o balanço hormonal na raiz. O padrão transcricional das raízes tratadas com 1-MCP revelou aumento da expressão de genes relacionados à expansão celular e estresse oxidativo. Tais padrões são discutidos à luz da regulação hormonal da formação do aerênquima através do estabelecimento de um balanço hormonal definido entre auxina e etileno. Ambos os experimentos levaram à seleção de quatro genes candidatos: dois fatores de transcrição (ScRAV1 e ScERF1) e duas glicosil hidrolases (ScEPG1 e ScARA1), sequenciados e analisados quanto à diversidade hom(e)óloga, sequências promotoras e estrutura gênica em comparação a S. bicolor. A topologia das reconstruções filogenéticas e a distribuição diferencial de sítios para RAV e ERF nos promotores de ScEPG1 e ScARA1 não parece refletir padrões de expressão distintos, visto que os diferentes hom(e)ólogos demonstraram ser igualmente expressos. Em sistema heterólogo, o fator de transcrição RAV apresentou atividade repressora sobre o promotor de ScEPG1. Tal papel de RAV sugere regulação negativa sobre a degradação da lamela média e sobre o processo de perda de adesão e separação celular. A identificação de reguladores-chave da formação do aerênquima consiste em importante elo entre a sinalização hormonal e a degradação de parede celular, possibilitando a melhor compreensão dos mecanismos de controle da degradação endógena de parede celular. Os dados produzidos possibilitam a aplicação biotecnológica dos genes sequenciados, além de consistirem em significativo avanço no conhecimento sobre a fisiologia do processo estudado e na dinâmica da regulação da expressão gênica acoplada a aspectos filogenéticos das sequências alvo. / In order to circumvent the problems imposed by the cell wall recalcitrance to hydrolysis, the process underlying biofuel production requires a step called pretreatment, aimed at making biomass more accessible to the action of glycosil hydrolases that attack the cell wall. The increased knowledge of wall degradation processes operated by the plant itself has the potential to influence research in the bioernergy field, pointing out the most efficient mechanisms to disassemble the cell wall complex polymeric structure. The term coined biological pretreatment means taking advantage of key elements and mechanisms of cell wall degradation processes occurring in the plant itself in order to disassemble the entangled polysaccharide structure. One example of endogenous cell wall degradation process is the lysigenous aerenchyma formation, which consists in the opening of gas spaces in parenchyma tissue. The aerenchyma formation in sugarcane is thought to be a modular process that occurs in six steps: 1) target cells perception; 2) cell separation; 3) cell expansion; 4) programmed cell death; 5) hemicellulose hydrolysis and 6) cellulose hydrolysis. This work has as the main objective to study the regulation of the two initial steps, aiming at acquiring knowledge that would afford to turn biomass less resistant to enzyme penetration. The aerenchyma develops within the roots of sugarcane as a constitutive process. Its independence from an external inducer was corroborated in this work by subjecting sugarcane plants to treatment with nutrients and one inhibitor of ethylene perception (1-MCP) when the five more apical centimeters of the root were analyzed. After treatment with nutrients, the delayed aerenchyma formation led to differential expression of cell wall degradation-, programmed cell death- and ethylene signalling-related genes. Under visual inspection, 1-MCP did not show effect on aerenchyma development. Instead, it changed the hormone balance mainly in the two most apical root segments. The transcriptional pattern of 1-MCP treated roots revealed increased expression of cell expansion- and oxidative stress-related genes. Such patterns are discussed in the light of the hormone regulation of the aerenchyma development through the establishment of a balance between auxin and ethylene within root segments. Both experiments led to the selection of four two candidate genes, two transcription factors (ScRAV1 and ScERF1) and two glycosil hydrolases (ScEPG1 and ScARA1), that were sequenced and analyzed regarding homEURologous diversity, promoter sequences and gene structure compared to S. bicolor. The topology of the phylogenetic reconstructions and the differential distribution of sites for RAV and ERF within ScEPG1 and ScARA1 promoters did not reflect distinct expression patterns. Different hom(e)ologous of each target gene were equally expressed. In an heterologous system, RAV transcription factor interacted with ScEPG1 promoter, reducing the activity encoded by the reporter gene. This suggests the repressive role of RAV on pectin degradation within the middle lamella, leading to reduced cell adhesion and cell separation, possibly regulated by this glycosyl hydrolase. The identification of key regulators of the aerenchyma formation is an important link between hormone signaling and the wall degradation within the sugarcane roots. It enables a better understanding of control mechanisms underlying wall modifications when performed by the plant itself. Altogether, the data produced in this work allows biotechnological application of sequenced genes. Moreover, the produced data unveil key aspects regarding physiologycal aspects of aerenchyma development and highlights features related to the dynamics of gene expression in sugarcane coupled to the phylogenetic aspects of the four target sequences.

The sugarcane bagasse has a high content of lignocellulosic material, which enables the study for the production of second-generation ethanol, requiring the application of a pretreatment that promotes the rupture of the fiber, to make accessible sugars for fermentation. There are several pretreatments aimed at the break and in the search for the most productive one, it is applied severe conditions of temperature and pressure. This promotes the formation of undesirable products in the bioethanol production process, requiring detoxification step for removal of inhibitors. In this study, we used the detoxifying step for two pretreatments, hydrothermal and acid. The methodology raised the pH of the hydrolysates resulting from the acid pretreatment to 7.0 with calcium oxide and then decay to pH 4.0 with phosphoric acid. The hydrolysates of the hydrothermal pretreatment had its pH reduced to 4.0 by addition of phosphoric acid, both pretreated were subjected to adsorption on activated carbon (1% w /v , 100 rpm , 30 minutes at 50 ° C), conditions chosen after design 22 after triplicate with the center point. The evaluation of the efficacy of these procedures was made as to the removal of toxic compounds depending on the fermentation yield with the yeast Saccharomyces cerevisiae, hydrolysates with and without detoxification, assessing the amount of released sugars for conversion into second-generation ethanol. According to the results , the change of pH combined with activated carbon adsorption led to higher fermentation yields in both pretreated 38.51% acid and hydrothermal 44.85% hydrolyzed , when compared to the yield of samples not detoxified , these results may be associated with interference of lignin in the pulp, which can form condensation products able to interfere with the detoxification. However the best results were found in the hydrolysate hydrothermally pretreated with 87.94% efficiency and fermentation alcohol content of 7.41%, compared to the pre-treated hydrolysate with acid and 5.11% 75.05% respectively. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O bagaço de cana-de-açúcar possui alto teor de material lignocelulósico, o que viabiliza o estudo para a produção do etanol de segunda geração, sendo necessária a aplicação de um pré tratamento que promova a ruptura da fração fibrosa, para tornar os açucares acessíveis para fermentação. Existem vários pré-tratamentos que visam essa quebra, e na busca pelo mais produtivo são aplicadas condições severas de temperatura e pressão. Isso propicia a formação de produtos indesejáveis ao processo de produção do bioetanol, sendo necessária a etapa de destoxificação para remoção os inibidores. Nesse trabalho, foi empregado a etapa de destoxificação para dois pré-tratados acido e hidrotérmico, na metodologia utilizada elevou-se o pH dos hidrolisados provenientes do pré-tratamento acido para 7,0 com oxido de cálcio e em seguida o decaimento ate pH 4,0 com acido fosfórico, os hidrolisados do pré-tratamento hidrotérmico tiveram seu pH reduzidos para 4,0 com a adição do acido fosfórico, ambos os pré-tratados foram submetidos a adsorção em carvão ativado (1% m/v, 100rpm, 30 minutos a 50°C), condições escolhidas apos planejamento 22 com triplicata no ponto central. Avaliação da eficácia destes procedimentos foi feita quanto a remoção dos compostos tóxicos em função do rendimento fermentativo com a levedura Saccharomyces cerevisiae, de hidrolisados com e sem destoxificação, avaliando a quantidade de açúcares liberados para conversão em etanol de segunda geração. De acordo com os resultados, a alteração de pH combinada a adsorção com carvão ativo propiciou maiores rendimentos fermentativos em ambos os hidrolisados pré-tratados acido 38,51% e hidrotérmico 44,85%, quando comparados ao rendimento de amostras não destoxificadas, a esses resultados pode estar associado a interferência da lignina no bagaço, que pode formar produtos de condensação capazes de interferir na destoxificação. No entanto os melhores resultados foram encontrados no hidrolisado pré-tratado hidrotémicamente com 87,94% de eficiência de fermentação e teor alcoólico de 7,41%, quando comparado ao hidrolisado pré-tratado com acido de 75,50% e 5,11%, respectivamente.