Alternative splicing is an essential regulatory layer of gene expression that expands the coding potential of the genome in multicellular organisms. The spliceosome -the sophisticated machinery involved in intron removal- allows versatile regulation of gene expression programs. The splicing process relies on the dynamic interplay between hundreds of components of the spliceosome, and the steps at which the complex process of the splicing reaction can be regulated remain largely unknown. The main objective of this thesis has been to develop high- throughput approaches to systematically identify novel regulators of alternative splicing, as well as to study the mechanisms by which they modulate splice site choice. We have identified a variety of regulators of Fas/CD95 alternative splicing within and outside of the splicing machinery and provide novel insights into connections between iron homeostasis and alternative splicing regulation. Using computational networks, we carried out a systematic functional analysis of the spliceosome components and their regulatory potential. Our results reveal the extensive regulatory plasticity of core spliceosome components throughout its assembly process. They also identified links between alternative splicing and iron homeostasis, providing a mechanism by which iron modulates alternative splicing through regulation of the RNA binding properties of a Zinc knuckle domain in the SR regulatory protein SRSF7. The results of this thesis highlight the value of high throughput technologies and network analyses to study complex molecular mechanisms, and unveils novel functional connections between the splicing machinery and other cellular processes. / El procesamiento alternativo del pre-ARNm constituye uno de los pilares esenciales en la regulación de la expresión génica y expande la capacidad codificadora del genoma en organismos multicelulares. El Espliceosoma – la maquinaria encargada de la eliminación alternativa de los intrones- permite una regulación multifacética de los programas genéticos en el interior de la célula. El proceso de corte y empalme se sustenta en la interacción dinámica de cientos de componentes del Espliceosoma, y los distintos niveles de regulación de la compleja reacción de splicing permanecen aun sin descubrir. El objetivo principal de esta tesis se ha centrado en el desarrollo de tecnologías sistematicas de alto cribado para identificar reguladores potenciales del procesamiento alternativo del pre- ARNm, así como los mecanismos implicados en su regulación. Hemos identificado una gran variedad de reguladores del procesamiento alternativo de Fas/CD95, tanto componentes esenciales del espliceosoma como factores implicados en otros procesos biologicos, y hemos observado una conexión inédita entre la regulación del splicing alternativo y el proceso de homeostasis modulado por hierro. Mediante el uso de redes computacionales, hemos llevado a cabo un análisis sistemático y funcional de los componentes del Espliceosoma y hemos identificado el potencial regulador de los mismos en la reacción de corte y empalme. Nuestros resultados reflejan una inmensa plasticidad de los factores esenciales del Espliceosoma a lo largo de toda a reacción de ensamblaje. Además, hemos conseguido identificar el mecanismo potencial por el cual la homeostasis del hierro ejerce su función en splicing alternativo a través de la modulación de la actividad de unión a RNA -mediada por un dominio de unión a cinc- en la proteína reguladora de splicing SRSF7. Los resultados de esta tesis enfatizan la relevancia de las tecnologías emergentes de alto cribado y el análisis de redes computacionales en el estudio de complejos mecanismos moleculares, y desvelan nuevas conexiones funcionales entre la maquinaria de splicing y otros procesos celulares.

Entre un 30% i un 80% dels pacients diagnosticats de Leucèmia o de Síndrome Mielodisplàstica (SMD) presenten alteracions citogenètiques que poden variar amb l’edat i el sexe, i cada una d’elles confereixen un pronòstic diferent. D'altra banda, la predisposició genètica de cada individu, l’exposició a factors medi ambientals i l’estil de vida poden influir a l’aparició d’una Leucèmia o SMD. Els objectius de la tesi han estat: 1.- caracteritzar i determinar la freqüència d’alteracions citogenètiques de pacients diagnosticats de diferents tipus de leucèmia i SMD de quatre regions sanitàries diferenciades geogràficament: Barcelonès Nord i Baix Maresme (hospital Germans Trias i Pujol – HGTIP), Tarragonès i Terres d'Ebre (hospitals Verge de la Cinta i Joan XXIII – HVC/HJXXIII), Gironès, Plà de L'Estany i Selva Interior (Hospital Josep Trueta – HJT) i Hospitalet, Prat del Llobregat, Garraf, Anoia i Alt Penedès (Hospital Duran i Reynals – HDiR) entre els anys 1990 i 2009; 2.- Analitzar si existeixen diferències entre les quatre regions sanitàries en els diferents tipus de leucèmia (leucèmia mieloide crònica - LMC, leucèmia mieloide aguda - LMA, leucèmia limfoblàstica aguda - LLA i leucèmia limfàtica crònica - LLC) i SMD respecte: la freqüència del cariotip alterat, els diferents tipus d’anomalia, el grau de complexitat i en la distribució dels grups de risc citogenètics. Pacients, material i mètode: pacients ≥15 anys diagnosticats consecutivament de Leucèmia o SMD entre els anys 1990 i 2009. El diagnòstic es va establir per citologia i immunofenotip. L’estudi citogenètic s’ha realitzat en un sol centre aplicant les tècniques del cariotip i de la hibridació in situ per fluorescència (FISH). El cariotip ha estat mitjançant el cultiu de 24 hores de les cèl·lules immadures en el cas de la LMC, LMA, LLA i SMD, cultiu de 72 hores i estimulació amb phorbol 12-myristate 13-acetate de les cèl·lules de fenotip B en el cas de la LLC. L’anàlisi cromosòmic ha estat segons el patró de bandes G (ISCN 2009). La FISH s’ha aplicat quan era necessari completar l’estudi del cariotip i en tots els casos de LLC. Les sondes de FISH utilitzades han estat: en la LMC Abbot LSI BCR-ABL sonda de dos colors i de dues fusions, en la LMA Abbot LSI CBFB, inv(16), MLL sonda de dos colors, LSI PML/RARA sonda de dos colors i de dues fusions, en la LLA Abbot LSI BCR-ABL sonda de dos colors i de dues fusions, LSI MLL sonda de dos colors i en la LLC Abbot LSI D13S319 / 13q3413q34 / CEP 12 / LSI ATM / LSI TP53. Conclusions: 1. El percentatge de casos amb cariotip alterat en els casos diagnosticats de SMD ha estat del 40,3%, en les LMA del 56,5%, en les LLA del 75,3%,i en el casos diagnosticats de LLC del 77,9% (cariotip més FISH). 2. L’anomalia més freqüent en els pacients diagnosticats de SMD ha estat la deleció 5q, en la LMA la t(15;17)(q22;q12), en la LLA la t(9;22)(q34;q11.2) i en la LLC la trisomia 12 per cariotip i la del(13)(q14) per FISH. 3. El percentatge de casos amb cariotip complex en els pacients diagnosticats de SMD ha estat del 24,4%, en la LMA del 31,1%, en la LLA del 28,5% i en la LLC ha estat del 17,2%. 4. En el grup de pacients menors de 60 anys les anomalies més freqüents que s’han observat de manera estadísticament significativa han estat la t(15;17)(q22;q12), t(8;21)(q22;q22) i inv(16)(p13q22) en el cas de la LMA, i la t(1;19)(q23;p13.3), t(4;11)(q21;q23) i hiperdiploïdia en el cas de la LLA. En el grup de pacients de 60 anys o més grans les anomalies més freqüents que s’han observat de manera estadísticament significativa han estat el cariotip complex en el cas de la LMA i la t(9;22)(q34;q11.2) en el cas de la LLA. 5. En el grup de pacients de sexe femení les anomalies més freqüents que s’han observat de manera estadísticament significativa han estat la deleció 5q en el cas de les SMD i la trisomia 12 en el cas de la LLC. En el grup de pacients de sexe masculí les anomalies més freqüents que s’han observat de manera estadísticament significativa han estat la trisomia8 en el cas de les SMD i les delecions 11q22.3/ATMen el cas de la LLC. 6. Els pacients que han estat diagnosticats en l’Hospital ICO-HGTIP (regió R1, Barcelonès Nord/Baix Maresme) presenten de manera estadísticament significativa en el cas de les SMD, més proporció de cariotips alterats i un percentatge de casos en el grup de risc citogenètic advers superior a la resta de centres. 7. Els pacients que han estat diagnosticats en l’Hospital ICO-HJT (Regió R3, Gironès/Pla de l’Estany/Selva Interior) presenten de manera estadísticament significativa més casos de translocació variant a la t(9;22) en el cas de la LMC i més cariotips complexos en el cas de les SMD que la resta de centres. 8. Els pacients que han estat diagnosticats en els Hospitals HVC/HJXXIII (regió R2, Terres de l’Ebre/Tarragonès) presenten de manera estadísticament significativa en el cas de la LMA un percentatge de casos en el grup de risc citogenètic favorable inferior a la resta de centres. / Between 30% and 80% of patients diagnosed with leukemia or Myelodysplastic Syndromes (MDS) have cytogenetic abnormalities that may vary with age and sex, and each one confers a different prognosis. On the other hand, the genetic predisposition of each individual, exposure to environmental factors and lifestyle may influence the occurrence of leukemia or MDS. The aim of the study was: 1. - Characterize and determine the frequency of cytogenetic abnormalities in patients diagnosed with different types of leukemia and MDS among four geographically distinct health regions: Barcelona Nord and Baix Maresme (Hospital Germans Trias i Pujol - HGTIP), Tarragona and Terres d'Ebre (Hospitals Verge de la Cinta and Joan XXIII - HVC / HJXXIII), Girona, Plà de l’Estany i Selva Interior (Josep Trueta Hospital - HJT) and Hospitalet, Prat de Llobregat, Garraf, Alt Penedès and Anoia (Hospital Duran i Reynals - HDiR ) between 1990 and 2009; 2. - Analyze the differences between the four health regions in different types of leukemia (chronic myeloid leukemia - CML, acute myeloid leukemia - AML, acute lymphoblastic leukemia - ALL and chronic lymphocytic leukemia - CLL) and MDS respect: the frequency of abnormal karyotypes, the different types of anomaly, and the degree of complexity and distribution of the cytogenetic risk groups. Patients, material and methods: Patients ≥ 15 years old consecutively diagnosed of leukemia or MDS between 1990 and 2009. Diagnosis was established by cytology and immunophenotype. The cytogenetic study was conducted in a single center using the techniques of karyotyping and fluorescence in situ hybridization (FISH). The karyotype was 24 hours by culturing of immature cells in the case of CML, AML, ALL and MDS, growing 72 -hour stimulation with phorbol 12 - myristate 13 - acetate on cell phenotype B in the case of CLL. The chromosomal analysis was according to the G banding (ISCN 2009). FISH was applied when necessary to complete the study of the karyotype and in all cases of CLL. The FISH probes used were: the LSI BCR -ABL, LSI CBFB, LSI MLL, LSI PML-RARA, LSI D13S319 / 13q3413q34 / CEP 12 / LSI ATM / LSI TP53 (Abbot). Conclusions: 1. Percentage of cases with abnormal karyotype in MDS has been 40.3 % , 56.5 % in AML, 75.3 % in the ALL and 77 , 9% in the CLL. 2. Anomaly more common in patients diagnosed with MDS has been deletion 5q, in AML t(15,17), in ALL t(9;22) and in CLL del(13)(q14 ). 3. Percentage of cases with complex karyotype in MDS was 24.4 %, AML was 31.1%, ALL was 28.5 % and CLL was 17.2 %. 4. In the group of patients younger than 60 years old the most frequent abnormalities observed were the t(15,17), t(8;21) and inv(16) for AML and t(1,19), t(4,11) and hyperdiploidy in the case of LLA (statistically significant). In the group of patients aged 60 and older the most frequent abnormalities observed were complex karyotype for AML and t(9;22) for LLA (statistically significant). 5. The 5q deletion in cases of MDS and trisomy 12 in cases of CLL are more frequent in the group of female patients (statistically significant). Trisomy 8 in cases of MDS and deletions of 11q22.3/ATM en cases of the LLC are more frequent in the group of male patients (statistically significant). 6. Patients with MDS who have been diagnosed at the HGTIP have higher proportion of altered karyotypes and more cases in the adverse cytogenetic risk group than the other centers (statistically significant). 7. Patients with CML who have been diagnosed at the HJT have more cases of variant translocation t(9,22) and patients with MDS have more complex karyotypes to the other centers (statistically significant). 8. Patients with AML who have been diagnosed in hospitals HVC/HJXXIII have more cases in the favorable cytogenetic risk group below the other centers (statistically significant).

La maduración del fruto es un proceso metabólico y fisiológico complejo, está altamente regulado e influye directamente sobre la calidad organoléptica y su valor económico. Un compuesto importante es el etileno, y en función de su patrón de síntesis los frutos pueden ser divididos en climatéricos y no climatéricos. En los frutos climatéricos ésta hormona vegetal coordina y acelera el proceso de maduración a través de la regulación a nivel transcripcional y traduccional de varios genes. Las rutas de regulación génica tanto dependientes como independientes de etileno coordinan el proceso en ambos tipos de maduración, aunque se conoce mucho menos sobre la maduración no climatérica. La existencia de variedades de melón con ambos tipos de maduración y el avanzado desarrollo de herramientas genéticas y genómicas convierten a esta especie en un buen modelo para el estudio de la maduración del fruto. El QTL eth6.3, objeto de estudio de esta tesis doctoral, fue detectado junto con eth3.5 durante la caracterización de la línea casi isogénica SC3 5 1 (portadora de los dos QTLs), obtenida a partir del cruzamiento entre “Piel de Sapo” (PS) y “Songwhan Charmi” (SC). Ambos QTLs son capaces de inducir una maduración climatérica por separado, pero cuando están juntos interaccionan produciendo un fenotipo climatérico más fuerte. En este trabajo se ha realizado el clonaje posicional de eth6.3 a través del desarrollo de una población de mapeo obtenida a partir de un individuo con alelos de PS en homocigosis para eth3.5 y segregante para eth6.3. El análisis fenotípico de 15 recombinantes en el intervalo del QTL permitió identificar el gen MELO3C016540, miembro de la familia de factores de transcripción tipo NAC en melón, como responsable de eth6.3. Para su validación se buscaron mutantes en una colección de TILLING con fondo climatérico, encontrándose dos familias con mutaciones dentro del dominio NAC que mostraron un retraso en el proceso de maduración respecto a frutos no mutados. El análisis de MELO3C016540 en un panel con 54 variedades de melón, representativas de la variabilidad existente dentro de la especie, reveló una alta conservación en los haplotipos de este gen entre variedades con el mismo tipo de maduración que sugiere un papel central en la regulación de este proceso. Finalmente, también se inició una nueva aproximación para la caracterización de MELO3C016540 mediante el desarrollo de construcciones genéticas para su silenciamiento mediante RNAi en líneas portadoras de eth6.3. De forma complementaria, en la última parte de este trabajo de tesis se ha realizado un estudio transcriptómico del fruto de la línea SC3 5 1 y PS a lo largo de la maduración, observándose una reprogramación genética global entre frutos maduros de las dos líneas. Se encontró expresión diferencial de algunos genes implicados en procesos de maduración climatérica como la biosíntesis y señalización de etileno, el reblandecimiento de la pared celular y la biosíntesis de compuestos aromáticos, así como genes pertenecientes a las familias de factores de transcripción NAC, MADS box, F box y HD zip. En conjunto, este trabajo ha permitido profundizar en el estudio de la regulación de la maduración en melón y comenzar a entender las diferencias entre frutos climatéricos y no climatéricos de esta especie. / Fruit ripening is a complex and highly regulated metabolic and physiological process that has a great influence in the organoleptic quality and economical value of the fruit. Ethylene is the main plant hormone involved in ripening regulation and, depending on its expression pattern, fruits can be classified as climacteric and non-climacteric. In climateric fruits, ethylene coordinates and accelerates ripening through gene regulation at the transcriptional and traslational level. Ethylene-dependent and independent regulation pathways coordinate both kinds of ripening, but much less is known about non-climacteric ripening. The existence of both climacteric and non-climacteric genotypes and the advances in the development of genetic and genomic tools make melon a suitable model for fruit ripening studies. The aim of this doctoral thesis in the study of QTL eth6.3, which was detected along with eth3.5 during the characterization of near isogenic line SC3-5-1 (that harbors both QTLs), obtained from a cross between “Piel de Sapo” (PS) and “Songwhan Charmi” (SC). Both QTLs can induce climacteric ripening on their own, but together they interact producing a stronger climacteric phenotype. This work presents the positional cloning of eth6.3 through the development of a mapping population obtained from an individual with PS homozygous alleles in eth3.5 and segregant in eth6.3. Phenotypic analysis of 15 recombinant lines in the QTL interval allowed the identification of MELO3C016540, a NAC domain transcription factor, as responsible of eth6.3. For validation, a TILLING collection in a climacteric background was screened for mutants. Two families with mutations in the well-conserved NAC-domain showed a delay in ripening when compared with wild-type individuals. The analysis of MELO3C016540 in a collection of 54 melon varieties representing the existing variability within the species revealed that the haplotypes within this gene are highly conserved among varieties that show the same kind of ripening, suggesting a central role in its regulation. Finally, a new approach for the characterization of MELO3C016540 was started by the development of genetic constructions for gene silencing mediated by RNAi in lines harboring eth6.3. Complementarily, a fruit transcriptome study of lines SC3-5-1 and PS during ripening was performed, revealing a global genetic reprogramming between ripe fruits from both lines. Genes involved in climacteric ripening processes like ethylene biosynthesis and signaling, fruit softening, aroma biosynthesis, and transcription factor families NAC, MADS-box, F-box and HD-zip were differentially expressed. In conclusion, this work has contributed to increase the knowledge of melon ripening regulation and to start uncovering the differences between climacteric and non-climacteric fruit ripening.

M. pneumoniae is one of the smallest self-replicating organisms. Many organism wide studies have been performed on M. pneumoniae and provide a wealth of information on the bacteria. However, the genetic tools to manipulate and engineer this microorganism are currently insufficient. Therefore one focus of this project is to extend the genetic toolbox for M. pneumoniae. In parallel, we developed first a proof of concepts study for the use of M. pneumoniae as therapeutical vector. For this purpose the secretome of M. pneumoniae has been investigated to define all secretion signals in this bacterium. This knowledge was used to modify M. pneumoniae to secrete three proteins with therapeutical applications. Further we could show for two of the proteins that they are active after secretion and therefore that M. pneumoniae can be used to engineer therapeutic vectors for treating lungs diseases. / M. pneumoniae es uno de los microrganismos auto-replicativos más pequeños descritos hasta el momento. En nuestro grupo se ha empleado como modelo en Biología de Sistemas y se ha caracterizado a diferentes niveles (genoma, transcriptoma, proteoma...etc). Sin embargo, las herramientas genéticas para manipular y emplear este microorganismo como modelo en Bilogía Sintética, son insuficientes. Por lo tanto, uno de los objetivos de este proyecto es ampliar el repertorio de herramientas moleculares de M. pneumoniae. En paralelo, hemos desarrollado por primera vez una “prueba de concepto” para el uso de M. pneumoniae con finalidades terapéuticas. Con este propósito, primero hemos determinado el secretoma de M. pneumoniae que ha permitido identificar todas las señales de secreción de esta bacteria. Posteriormente, se ha aplicado este conocimiento para obtener cepas de M. pneumoniae capaces de secretar tres proteínas con aplicaciones terapéuticas. Hemos demostrado que dos de las tres proteínas son activas tras la secreción, abriendo nuevas perspectivas en el uso de M. pneumoniae para el tratamiento de enfermedades pulmonares.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / La via de Calcineurina (Cn)- Factor Nuclear de Cèl·lules T Activades (NFAT) ha estat descrita clàssicament com a via de senyalització essencial en el funcionament de les cèl·lules T del sistema immunològic i amb els NFATc com a factor de transcripció clau en la resposta immunitària contra els òrgans trasplantats. Actualment s'usen fàrmacs com la Ciclosporina A i el FK506 per a inhibir la calcineurina i la conseqüent activació de NFAT en teràpies immunosupressores per al tractament del rebuig d'òrgans. Aquests fàrmacs, però, inhibeixen la totalitat d'activitat fosfatasa de la calcineurina de manera que no només la via Cn-NFAT en resulta afectada. Com a conseqüència, el tractament amb aquests fàrmacs porta associat tota una llista d'efectes secundaris indesitjats. La proteïna RCAN3 sencera i/o el pèptid RCAN3178-210 (pèptid derivat de la proteïna RCAN3, aminoàcids 178-210) inhibeixen específicament la via de Cn-NFATc mitjançant competició de RCAN3 amb NFATc per unir-se a calcineurina mitjançant un motiu aminoacídic similar en les dues proteïnes anomenat PxIxIT. RCAN3, per tant, pot ser un regulador específic i, el més important, endogen de la via Cn-NFAT. Donat que els factors de transcripció NFATc estan implicats en varis processos del desenvolupament tumoral (pàncrees, pell, mama), l'objectiu principal d’aquest treball és determinar l’efecte biològic i funcional de la sobreproducció de RCAN3 i del pèptid R3178-210 que conté el motiu PxIxIT com a inhibidor de la via de Cn-NFATc en la progressió tumoral i avaluar la possibilitat d’usar aquesta proteïna o pèptid, o derivats o mimètics d’aquests, en el tractament de la progressió tumoral i metàstasi en el càncer de mama humà triple negatiu (TNBC) usant ratolins com a models ortotòpics d'aquest tipus de càncer. La hipòtesi d'aquest treball és que RCAN3 i el pèptid CIC inhibeixen la progressió tumoral mitjançant la inhibició de la via de Cn-NFATc i serien per se possibles nous agents terapèutics antitumorals. Els resultats indiquen que la sobreproducció de RCAN3, així com el pèptid R3178-210 inhibeixen la translocació dels NFATc a nucli afectant així la transcripció de gens dependents de NFAT (com el gen proangiogènic de la Ciclooxigenasa 2 (cox-2) i el gen proinflamatori de la Interleukina 8 (Il-8)) i el nivell de producció de les corresponents proteïnes (COX-2 i IL-8). En models ortotòpics TNBC, s'ha observat una reducció significativa en el volum dels tumors que sobrexpressen RCAN3 possiblement com a conseqüència d'una alteració en l'angiogènesi tumoral. A més, aquests tumors presenten un increment en l'apoptosi cel·lular i una disminució en el número de cèl·lules en proliferació en comparació amb els tumors control. Els tumors RCAN3 també presenten una reducció en el número de cèl·lules immunitàries infiltrades en el tumor. Aquest resultat es creu que podria ser degut, entre d'altres factors, a l'efecte indirecte de la sobrexpressió de RCAN3 sobre il-8. El TNBC és un càncer que fàcilment crea metàstasis a partir d'una transició epitelio-mesenquimal (TEM) i per això s'han analitzat marcadors que s'associen a la formació de metàstasis com S100A4 i marcadors TEM com la e-cadherina i la vimentina. Els resultats indiquen que els tumors RCAN3, tot i no presentar canvis en les proteïnes epitelio-mesenquimals escollides, presenten una inhibició del marcador premetastàtic S100A4. Respecte als tumors R3178-210, s'han obtingut els mateixos resultats, tot i que amb significances una mica més modestes. Aquest fet reforça el paper clau dels aminoàcids 178-210 de RCAN3 en a la regulació endògena de la via Cn-NFAT i la seva implicació en càncer TBNC. Finalment s'ha realitzat una primera aproximació experimental per utilitzar el pèptid R3178-210 com a eina terapèutica i els resultats preliminars han sigut que, malgrat no observar reducció en el volum tumoral dels animals tractats amb el pèptid, sí que es repeteix l'efecte inhibitori sobre l'angiogènesi. / The members of the human regulators of calcineurin (RCAN) protein family are endogenous regulators of the calcineurin (CN)-cytosolic nuclear factor of activated T-cells (NFATc) pathway activation. This function is due to the presence of a highly conserved aminoacidic motif in RCAN3 protein, which has been shown to compete with NFATc for the binding to CN. As a consequence, RCAN3 is able to inhibit NFATc activation by CN. Very recently, emerging roles for NFATc proteins in transformation, tumour angiogenesis and metastasis have been described in different cancer cell types. In this work, we report that the overexpression of RCAN3 dramatically inhibits tumour growth and tumour angiogenesis in an orthotopic human Triple Negative Breast Cancer mouse model. We also observed a decrease in proliferative cells and an increase in apoptotic cells compared to control tumours. We suggest that RCAN3 exerts these effects in a CN-dependent manner, as mutation of the aminoacidic motif in RCAN3 abolishes the tumour suppressor effect. Moreover, the expression of the R3178-210 peptide, spanning the motif of RCAN3, is able to reproduce all the antitumor effects of RCAN3 full-length protein. Also we show that RCAN3 and the R3178-210 peptide inhibit the CN-NFATc signalling pathway and the induction of the NFATc-dependent gene cyclooxygenase-2 and IL-8. Our work suggests that the R3178-210 peptide possess potent tumour suppressor properties and therefore constitutes a novel lead for the development of potent and specific antitumoral agents. With these results, we've done a first approach using the peptide R3178-210 as a treatment against this disease. We've treated the tumours with the peptide and we've seen that although no changes in tumour volume were observed, the effect on tumour angiogenesis repeated significantly. We propose the targeting of the CN-NFATc pathway in the tumour cells could constitute an effective way to hamper tumour progression by impairing the paracrine network among tumour, endothelial and immune tumour infiltrated cells.

L’arròs es un cultiu bàsic, consumit per mes de 3 billons de persones. Es una font pobra en ferro (Fe) i zinc (Zn) per la qual cosa les poblacions pobres que depenen de l’arros per a la seva supervivència, sofreixen d’anèmia por deficiència de ferro (IDA) i zinc (ZnD). La desnutrició es un repte important, especialment en els països en desenvolupament on no hi ha les mesures nutritives comunes als països industrialitzats (una dieta variada, programes de fortificació i suplements dietètics). El bio-enriquiment mitjançant l’enginyeria genètica del contingut de Fe y Zn en arròs es una estratègia prometedora y pot resultar en un augmentant de les seves concentracions. Amb l’objectiu d’aconseguir arròs que acumuli nivells mes elevats de Fe y Zn he obtingut una població d’arròs transgènic mitjançant transformació combinatòria amb quatre gens implicats en l’absorció, transport, acumulació i biodisponibilitat d’aquestos dos minerals. Aquesta població combinatòria m’ha servit per a identificar els mecanismes antagònics i sinèrgics que son essencials per a controlar l’acumulació de Fe i Zn. / El arroz es un cultivo básico para más de 3 billones de personas. El arroz es una fuente pobre de hierro (Fe) y zinc (Zn) por lo cual las poblaciones pobres que dependen del arroz para su supervivencia, sufren de anemia por deficiencia de hierro (IDA) y zinc (ZnD). La desnutrición es un reto importante, especialmente en los países en desarrollo donde están ausentes las medidas que son comunes en los países industrializados (dieta variada, programas de fortificación y suplementos dietéticos). El bio-enriquecimiento mediante la ingeniería genética del contenido de Fe y Zn en arroz es una estrategia prometedora para aumentar sus concentraciones. Con el objetivo de producir granos con más alto nivel de Fe y Zn he obtenido una población de arroz transgénico mediante transformación combinatoria con cuatro genes implicados en la absorción, transporte, acumulación y biodisponibilidad de estos dos minerales. Esta población combinatoria me sirvió para identificar los mecanismos antagónicos y sinérgicos que son esenciales para controlar la acumulación de Fe y Zn. / Rice is staple crop for more than 3 billion people, since rice is poor source of iron (Fe) and zinc (Zn) world’s poorest people who depend on rice for their survival suffer from iron deficiency anaemia (IDA) and zinc deficiency (ZnD). Malnutrition is a significant challenge, particularly in the developing world where measures that are commonplace in industrialized countries (varied diet, fortification schemes, and dietary supplements) are largely absent. Biofortification of rice with Fe and Zn by genetic engineering is a promising strategy to increase Fe and Zn concentration. I established a combinatorial transgenic rice population by transformation with four genes involved in uptake, transport, accumulation and bioavailability of Fe and Zn, aiming to produce grains containing higher level of these two minerals. This combinatorial population helped to identify key antagonistic and synergistic mechanisms controlling Fe and Zn accumulation.

Within the great interest in the characterization of genomic structural variants (SVs) in the human genome, inversions present unique challenges and have been little studied. This thesis has developed "GRIAL", a new algorithm focused specifically in detect and map accurately inversions from paired-end mapping (PEM) data, which is the most widely used method to detect SVs. GRIAL is based on geometrical rules to cluster, merge and refine both breakpoints of putative inversions. That way, we have been able to predict hundreds of inversions in the human genome. In addition, thanks to the different GRIAL quality scores, we have been able to identify spurious PEM-patterns and their causes, and discard a big fraction of the predicted inversions as false positives. Furthermore, we have created â ˘ AIJInvFESTâ˘A˙I, the first database of human polymorphic inversions, which represents the most reliable catalogue of inversions and integrates all the associated information from multiple sources. Currently, InvFEST combines information from 30 different studies and contains 1092 candidate inversions, which are categorized based on internal scores and manual curation. Finally, the analysis of all the data generated has provided information on the genomic patterns of inversions, contributing decisively to the understanding of the map of human polymorphic inversions. / Dentro del estudio de las variantes estructurales en el genoma humano, las inversiones han sido las menos han consolidado sus resultados y constituye uno de los principales retos en la actualidad. Esta tesis aborda el tema a través de la implementación de "GRIAL" un nuevo algoritmo específicamente diseñado para la detección más precisa posible de las inversiones usando el mapeo de secuencias apareadas (del inglés PEM) que es el método más utilizado para estudiar la variación estructural. GRIAL se basa en reglas geométricas para agrupar los patrones de PEM que señalan un posible punto de rotura (del inglés breakpoint) de inversión, además une cada breakpoint correspondientes a inversiones independientes y refina lo más exacto posible su localización. Su uso nos permitió predecir cientos de inversiones. Un gran aporte de nuestro método es la creación de índices (del inglés score) de fiabilidad para las predicciones mediante los cuales identificamos patrones de inversión incorrectos y sus causas. Esto nos permitió filtrar nuestro resultado eliminando un gran número de predicciones posiblemente falsas. Además se creó "InvFEST", la primera base de datos especialmente dedicada a inversiones polimórficas en el genoma humano la cual representa el catálogo más fiable de inversiones, integrando además a cada inversión conocida la información asociada disponible. Actualmente InvFEST contiene (y mantiene la clasificación según el nivel de certeza) un catálogo de 1092 inversiones clasificadas, a partir de datos de 30 estudios diferentes. Finalmente el análisis de toda la información generada nos permitió describir algunos patrones de las inversiones polimórficas en el genoma humano contribuyendo de este modo a la comprensión de esta variante estructural y el estado de su información en los estudios del genoma humano. / Inversió genòmica

Detecting positive selection in genomic regions is a recurrent topic in human population genetics studies. Over the years, many positive selection tests have been implemented to highlight specific genomic patterns left by a selective event when compared to neutral expectations. However, there is little consistency among the regions detected in several genome-wide scans using different tests and/or populations: population-specific demographic dynamics, local genomic features or different types of selection acting along the genome at different times and selective coefficients might explain such discrepancies. The present doctoral thesis is focused in the study of this problem and the development of a innovative solution: a machine-learning classification framework that exploits the combined ability of some selection tests to uncover the different features expected under the hard sweep model, such as sweep completeness and age of onset. The method was calibrated and applied to three reference populations from The 1000 Genome Project to generate a genome-wide classification map of hard selective sweeps. This study improves the way a selective sweep is detected by overcoming the classical selection vs. no-selection classification strategy, and offers an explanation to the lack of consistency observed among selection tests when applied to real data. / La detecció de selecció positiva en regions genòmiques ha estat un tema recurrent en molts estudis de genètica de poblacions humanes. En conseqüència, durant els últims anys s'han publicat molts mètodes estadístics per detectar els senyals genòmics creats per un procés de selecció molecular. No obstant això, en general hi ha poca consistència entre les regions detectades pels diferents mètodes: dinàmiques demogràfiques especifiques de població, propietats locals de les regions analitzades o diferents tipus de selecció actuant a diferents marcs temporals i intensitats podrien explicar aquestes discrepàncies. Aquesta tesi doctoral està centrada en l'estudi d'aquest problema i en el desenvolupament d'una solució: un mètode de classificació de selecció positiva basat en algoritmes d'aprenentatge automàtic. El mètode combina diferents tests per detectar selecció positiva per obtenir informació sobre el tipus i mode de selecció que afecta una regió genòmica determinada. Aquest nou mètode presenta una alta sensitivitat cap a senyals de selecció positiva i és capaç de proveir informació sobre l'edat del esdeveniment selectiu, així com del seu estat final. Aquest treball millora la forma en què la selecció positiva és detectada avui en dia i proporciona una explicació a la falta de consistència observada entre els mètodes de detecció de selecció positiva quan s'apliquen en dades reals.

Se ha predicho teóreticamente que la epistasis, es decir, las interacciones genéticas entre diferentes mutaciones, cumple un rol sustancial en procesos evolutivos, tales como la emergencia de la reproducción sexual, la recombinación, la especiación y la evolución adaptativa. Sin embargo, existe poca evidencia experimental o estadística de la ubicuidad de las interacciones epistáticas en la naturaleza. Aquí, estudiamos la evolución de las proteínas a largo plazo, y demostramos que el modelo constante de selección independiente, no es capaz de describir las tasas y patrones de divergencia encontrados en las proteínas: las proteínas divergen mas allá de los límites teóricos y la tasa de divergencia es mucho mas lenta que la esperada. A su vez, demostramos que la evolución de las proteínas se explica mejor bajo la suposición de un intercambio rápido entre los valores de eficacia biológica asociados con aminoácidos individuales. Mas aún, extendemos nuestro estudio computacional y construimos un modelo teórico que captura el efecto de la selección inconstante sobre la evolución molecular. / Epistasis, or genetic interactions between different mutations, is theoretically predicted to play a substantial role in such evolutionary processes as emergence of sexual reproduction and recombination, speciation, adaptive evolution. However, there is little experimental or statistical evidence of the ubiquity of epistatic interactions in nature. Here, we study long-term protein evolution and show that the constant independent selection model cannot describe rates and patterns of protein divergence: protein sequences diverge beyond theoretical limits and the rate of divergence is much slower than predicted. We show that protein evolution is best explained under the assumption of rapid turnover of fitness values associated with individual amino acids. We further extend this computational study and build a theoretical model to capture the effect of non-constant selection on molecular evolution.

The maintenance of genome stability is crucial for homeostasis, development and suppression of diverse pathologies that include developmental disorders, premature aging and cancer. The DNA damage response coordinates the appropriate cellular responses following the detection of lesions to prevent genomic instability. The MRE11 complex is a sensor of DNA double strand breaks and plays key roles in multiple aspects of the DNA damage signaling, including the initiation of DNA end resection that is critical for the accurate break repair and the replication fork maintenance. Many studies have implicated the exonuclease EXO1 in DNA resection and shown that the MRE11 complex functions upstream, but the exact influence of EXO1 on double strand break responses remain unclear. In this thesis we examine the genetic relationship between the MRE11 complex and EXO1 during mammalian development and the cellular responses to DNA damage. Our work shows that the deletion of Exo1 in mice expressing a hypomorphic allele of Nbs1, a member of the MRE11 complex, leads to severe developmental defects, embryonic death and chromosomal instability. While EXO1 deficiency does not strongly affect DNA replication, DNA repair or checkpoint signaling in normal cells, our results reveal a crucial role for EXO1 in these functions when the MRE11 complex is compromised. / El mantenimiento de la estabilidad del genoma es esencial para la homeostasis y para la supresión de diversas patologías que incluyen trastornos del desarrollo, el envejecimiento prematuro y el cáncer. La adecuada respuesta al daño del ADN coordina las funciones celulares originadas por la detección de lesiones, para prevenir la acumulación de inestabilidad en el genoma. El complejo MRE11 es un sensor de roturas en el ADN de doble cadena y juega un papel clave en múltiples aspectos de la señalización del daño en el ADN; incluido el inicio de la resección del ADN terminal, que es a su vez fundamental para la reparación precisa de escisiones y el mantenimiento de la horquilla de replicación. La función del complejo MRE11 precede a las funciones de la exonucleasa EXO1, la cual está implicada en la resección del ADN y en las respuestas a los daños del ADN. En esta tesis examinamos la relación genética entre el complejo MRE11 y la proteína EXO1 durante el desarrollo de células de mamífero y las respuestas celulares al daño en el ADN. Nuestro trabajo muestra que la eliminación del gen Exo1 en ratones que expresan un alelo hipomórfico de Nbs1, un miembro del complejo MRE11, conduce a un defecto severo del desarrollo embrionario, la muerte del embrión y la inestabilidad cromosómica. Aún cuando la eliminación de EXO1 no afecta significativamente la replicación o reparación del ADN ni el control de la señalización, en conjunto, nuestros resultados revelan un papel crucial de EXO1 en estas funciones cuando el complejo MRE11 está comprometido.