El trabajo presentado en esta tesis se centra en el estudio del impacto de los elementos transponibles sobre los genes y genomas vegetales y en los mecanismos de control de la transposición en estos genomas. Para ello se ha analizado, por un lado, la dinámica que ha seguido la familia Emigrant de MITEs dentro del genoma de Arabidopsis. Y, por otro lado, se analiza el control de la transcripción del retrotransposón Tnt1 de tabaco.1. ESTUDIO DEL IMPACTO DE LOS ELEMENTOS TRANSPONIBLES SOBRE LOS GENOMAS VEGETALES: Análisis de la familia Emigrant de MITEs de Arabidopsis thaliana.Los MITEs son pequeños transposones de DNA sin capacidad codificante, presentes en un elevado número de copias en la mayoría de los genomas. Se postula que son movilizados por elementos autónomos emparentados, presentes en los mismos genomas. El primer grupo de MITEs descrito en Arabidopsis fue la familia Emigrant (Casacuberta et al., 1998).El objeto de nuestro estudio es conocer la dinámica de estos elementos y su efecto sobre la evolución de los genes y genoma de Arabidopsis.Gracias a la disponibilidad de la secuencia genómica de Arabidopsis se ha diseñado un programa informático para identificar todas las copias de elementos Emigrant contenidas en el genoma de Arabidopsis. Con tal de encontrar el máximo número de elementos Emigrant, se fundamentó la búsqueda en las repeticiones terminales (TIRs) conservadas que definen esta familia de MITEs. De esta forma se pueden encontrar subfamilias representadas por un bajo número de copias o aquellas copias antiguas y, por tanto, más divergentes, de transposones Emigrant, presentes en el genoma de Arabidopsis. También se han desarrollado otras herramientas informáticas que han permitido realizar análisis filogenéticos y evolutivos de estos elementos. A su vez, mediante técnicas moleculares se ha estudiado el polimorfismo de estos MITEs existente entre diferentes ecotipos de Arabidopsis.Mediante estos análisis se han identificado 151 copias Emigrant distribuidas por todo el genoma de Arabidopsis. La mayoría de éstas se pueden agrupar en tres familias, cada una de las cuales puede ser subdividida, a su vez, en subfamilias de variabilidad diferente. El análisis de estas subfamilias ha revelado que mientras que las copias más recientes se localizan lejos de secuencias génicas, aquellos elementos más antiguos aparecen frecuentemente asociados a genes. Esto sugiere que los elementos Emigrant han podido jugar un papel importante en la evolución de los genes de Arabidopsis. Los resultados obtenidos se han publicado en la revista de carácter científico Molecular Biology and Evolution (Santiago et al., 2002). Además la existencia de polimorfismos de inserción de estos transposones entre diferentes ecotipos de Arabidopsis indica la existencia de una actividad reciente de movilización de estos elementos.2. ESTUDIO DEL CONTROL DE LA TRANSPOSICIÓN: Análisis del control de la expresión del retrotransposón Tnt1 de tabaco.Tnt1 fue el primer retrotransposón activo de plantas descrito (Grandbastien et al., 1989). Está presente en cientos de copias en el genoma de tabaco y se expresa en ciertas condiciones de estrés (Casacuberta y Grandbastien, 1993; Mhiri et al., 1997).Por otra parte el silenciamiento génico parece ser el principal mecanismo por el que los diferentes organismos controlan la proliferación de los elementos transponibles y secuencias extrañas dentro de sus genomas (Vaucheret y Fagard, 2001; Hammond et al., 2001; Rudenko et al., 2003).En el trabajo presentado en esta memoria se analiza el control de la expresión del retrotransposón Tnt1 a nivel de la terminación de la transcripción y poliadenilación del mRNA y a nivel de la conformación de la cromatina, mediante el estudio de cambios en el silenciamiento de Tnt1 en condiciones de estrés. Se analiza la existencia y variación de intermediarios del silenciamiento, como siRNAs y modificaciones de la cromatina.En este trabajo se han diseñado diferentes estrategias para inducir el silenciamiento transcripcional de transgenes cuya expresión está promovida por el promotor 35S del CaMV. Los resultados obtenidos indican que en condiciones de estrés se relaja el silenciamiento del retrotransposón Tnt1 sin que se vea comprometido el silenciamiento de otros transgenes estudiados. Por esta razón se decidió caracterizar molecularmente el silenciamiento de Tnt1.Se han identificado siRNAs que pueden estar mediando la represión de Tnt1 en hoja de tabaco, cuando este elemento no se transcribe y sus secuencias promotoras están asociadas a cromatina inactiva. Por otra parte, con tal de conocer de qué manera Tnt1 supera su silenciamiento y se expresa en situaciones de estrés, se ha analizado la influencia de la región U3 de las LTRs de este retrotransposón (donde se localizan los elementos promotores de su transcripción) sobre este proceso. Los resultados obtenidos sugieren que la región U3 no es suficiente para superar el silenciamiento de Tnt1 y que quizás otras secuencias de la LTR o factores estructurales son las que permiten la expresión del retrotransposón. / The work presented in this doctorate thesis focuses on the analysis of plant transposable elements. Here is described the study of the impact these sequences have had on plant genes and genomes and, on the other hand, on the control of the proliferation of the transposable elements within genomes. In particular, I have analysed de dynamics of the Emigrant family of MITEs within the Arabidopsis genome and the transcriptional control of the tobacco Tnt1 retrotransposon.1. STUDY OF THE IMPACT OF TRANSPOSABLE ELEMENTS ON PLANT GENOMES: Genome-wide analysis of the Emigrant family of MITEs from Arabidopsis thaliana.MITEs are short DNA transposable elements lacking any coding capacity. They are found in a high copy number in most of the analysed genomes. They are supposed to be mobilized by other longer related autonomous elements present in the same genomes. The first MITE described in the plant Arabidopsis thaliana was the Emigrant family (Casacuberta et al., 1998).The object of the study here described is to understand the dynamics of these elements and their effect on the Arabidopsis genes and genome evolution.In order to detect divergent ancient copies and low copy number subfamilies with a different internal sequence we have developed a computer program to look for Emigrant elements based solely on the terminal inverted-repeat (TIR) sequence. The development of other computer applications has allowed us to do phylogenetic and divergence analysis of all the copies found. At the same time, using molecular biology methods we have analysed different Arabidopsis ecotypes in order to know if there are Emigrant insertion polymorphisms among them.We have detected 151 Emigrant elements distributed along the Arabidopsis genome. Most of these copies are grouped in three families, each of these containing different subfamilies of different sequence homogeneity. The analysis of these subfamilies has revealed us that the most recent elements are inserted out from genic sequences, contrary to the oldest ones that are preferentially associated to genes. These results suggest that the Emigrant MITEs have probably played an important role on Arabidopsis gene evolution. In addition, the existing polymorphism resulting from the presence or absence of different Emigrant copies detected between the Arabidopsis ecotypes imply a recent mobilization of these elements.2. STUDY OF THE CONTROL OF TRANSPOSITION: Analysis of the tobacco Tnt1 retrotransposon transcriptional control.Tnt1 is the first active plant retrotransposon described (Grandbastien et al., 1989). It is found in hundred copies in the tobacco genome and it is expressed under some stress conditions (Casacuberta y Grandbastien, 1993; Mhiri et al., 1997).On the other hand, gene silencing seems to be the major mechanism developed by the different organisms to control de proliferation of transposable elements and foreign sequences within their genomes (Vaucheret y Fagard, 2001; Hammond et al., 2001; Rudenko et al., 2003).In this section, I present the analysis of the control of Tnt1 retrotransposon expression at two different levels. I have analyzed the termination and polyadenylation of the Tnt1 mRNAs and, on the other hand, I have studied the epigenetic control of Tnt1 expression by gene silencing mechanisms and changes in the chromatin associated to Tnt1 sequences. I have looked for and analyzed silencing intermediates, like siRNAs and chromatin modifications.Different strategies to induce the transcriptional gene silencing of the CaMV 35S promoter are also here described. The results obtained from these approaches suggest that the gene silencing operating on Tnt1 retrotransposon disappears specifically in stress conditions when other silenced loci seem to be kept repressed.On the other hand, in order to understand how Tnt1 is transcriptionally re-activated under stress conditions we have analyzed the role of the U3 region of the Tnt1 LTRs (which contain the transcriptional promoter elements) in the change of its silencing status. The results here presented suggest that the U3 region not only is not able to overcome silencing but also seem to be target of this process when the endogenous copies of Tnt1 are expressed and that other different regions of the Tnt1 sequence as well as structural factors may take part in the retrotransposon re-activation.

In recent years there has been a growing interest in the field of non-coding RNA. This surge is a direct consequence of the discovery of a huge number of new non-coding genes, and of the finding that many of these transcripts are involved in key cellular functions. In this context, accurately detecting and comparing RNA sequences becomes extremely important. Aligning nucleotide sequences is one of the main requisite when searching for homologous genes. Accurate alignments reveal evolutionary relationships, conserved regions and more generally, any biologically relevant pattern. Comparing RNA molecules is, however, a challenging task. The nucleotide alphabet is simpler and therefore less informative than that of proteins. Moreover for many non-coding RNAs, evolution is likely to be mostly constrained at the structure level and not on the sequence level. This results in a very poor sequence conservation impeding the comparison of these molecules. These difficulties define a context where new methods are urgently needed in order to exploit experimental results at their full potential. These are the issues I have tried to address in my PhD. I have started by developing a novel algorithm able to reveal the homology relationship of distantly related ncRNA genes, and then I have applied the approach thus defined in combination with other sophisticated data mining tools to discover novel non-coding genes and generate genome-wide ncRNA predictions. / En los últimos años el interés en el campo de los ARN no codificantes ha crecido mucho a causa del enorme aumento de la cantidad de secuencias no codificantes disponibles y a que muchos de estos transcriptos han dado muestra de ser importantes en varias funciones celulares. En este contexto, es fundamental el desarrollo de métodos para la correcta detección y comparativa de secuencias de ARN. Alinear nucleótidos es uno de los enfoques principales para buscar genes homólogos, identificar relaciones evolutivas, regiones conservadas y en general, patrones biológicos importantes. Sin embargo, comparar moléculas de ARN es una tarea difícil. Esto es debido a que el alfabeto de nucleótidos es más simple y por ello menos informativo que el de las proteínas. Además es probable que para muchos ARN la evolución haya mantenido la estructura en mayor grado que la secuencia, y esto hace que las secuencias sean poco conservadas y difícilmente comparables. Por lo tanto, hacen falta nuevos métodos capaces de utilizar otras fuentes de información para generar mejores alineamientos de ARN. En esta tesis doctoral se ha intentado dar respuesta exactamente a estas temáticas. Por un lado desarrollado un nuevo algoritmo para detectar relaciones de homología entre genes de ARN no codificantes evolutivamente lejanos. Por otro lado se ha hecho minería de datos mediante el uso de datos ya disponibles para descubrir nuevos genes y generar perfiles de ARN no codificantes en todo el genoma.

Expression quantitative trait loci (eQTL) mapping constitutes a challenging problem due to the high-dimensional multivariate nature of continuous gene expression traits and discrete genotypes from genetical genomics experiments. Next to the expression heterogeneity produced by confounding factors and other sources of unwanted variation, indirect e ects spread throughout genes as a result of genetic, molecular and environmental perturbations. Disentangling direct from indirect e ects while adjusting for unwanted variability should help us moving from current parts list of molecular components to understanding how these components work together in networks of eQTL and gene to gene associations. There is a large body of statistical methodology to tackle this challenge within the context of linear models for continuous data. However, little has been investigated in using graphical Markov models (GMMs) and conditional independence on mixed continuous and discrete data from genetical genomics data sets, which are powerful tools for the analysis of complex associations. In this thesis we investigate the use of mixed GMMs to estimate eQTL networks from data. We develop procedures to simulate these models and data from them to gather insight into the propagation of additive e ects throughout the network. We derive the parameters for a likelihood ratio exact test that enables use of higher-order conditional independence with mixed GMMs. We exploit this test in the context of limited-order correlations and marginal distributions to obtain estimates of the underlying eQTL net- work. We show in the context of a yeast genetical genomics data set, that this estimate leads to a sparser network with more direct associations that provide valuable insight into the genetic control of gene expression in yeast. We develop an algorithm for accurate es- timation of the genetic e ects of eQTLs in the presence of missing data. All algorithms described in this thesis are implemented in the R/Bioconductor package qpgraph. / La cartogra a gen etica dels trets quantitatius d'expressi o (eQTL) esdev e un gran repte degut a la naturalesa multivariant d'alta dimensionalitat dels trets continus d'expressi o g enica i els genotips discrets dels experiments de gen omica gen etica. A m es de l'heterogene tat de l'expressi o produ da pels factors de confusi o i altres fonts de variabilitat no desitjada, els efectes indirectes s'estenen per tots els gens com a resultat de perturbacions gen etiques, moleculars i ambientals. L'identi caci o d'efectes directes tot ajustant pels efectes de variabilitat no desitjada, ens hauria de permetre entendre com els diferents components moleculars interaccionen en xarxes d'associacions entre eQTLs i gens. Per abordar aquest problema, existeixen nombrosos m etodes estad stics en el context dels models lineals per a dades cont nues. En canvi, els models gr a cs de Markov (GMMs) i la independ encia condicional, tot i que s on eines adients per a l'estudi d'associacions complexes, han estat poc investigades en el context de dades mixtes cont nues i discretes de gen omica gen etica. En aquesta tesi, investiguem l' us dels GMMs mixtes per a estimar xarxes d'eQTLs. Desenvolupem procediments per a simular GMMs mixtes i simular dades a partir d'aquests models per tal d'investigar la propagaci o dels efectes additius a trav es de la xarxa. Derivem els par ametres d'un test de versemblan ca exacte que ens permet utilitzar independ encies condicionals d'ordre gran amb els GMMs mixtes. Utilitzem aquest test en el context de correlacions d'ordre limitat i distribucions marginals per a obtenir estimacions de la xarxa d'eQTLs subjacent. Tamb e mostrem que, en el context d'un conjunt de dades de gen omica gen etica de llevat, aquesta estimaci o d ona lloc a una xarxa esparsa amb associacions m es directes que ens proporcionen informaci o rellevant sobre el control gen etic de l'expressi o dels gens en llevat. Desenvolupem un algoritme per estimar de manera acurada els efectes gen etics dels eQTLs a partir de dades missing. Tots els algoritmes descrits en aquesta tesi estan implementats en el paquet de R/Bioconductor qpgraph.

Male premutation carriers (PM) presenting between 55-200 CGG repeats in the Fragile X-associated (FMR1) gene are at risk to develop Fragile X Tremor/Ataxia Syndrome (FXTAS), and females to undergo Premature Ovarian Failure (POF1). These pathologies are caused by toxic gain of function of the premutated FMR1 mRNA. Functional alterations of several gene expression regulators provide a detrimental mechanism underlying FMR1 PM–associated pathologies. In this thesis, we have characterized the transcriptome alterations associated to FMR1 premutation and further characterized the relevance of the biogenesis and activity of a small RNAs formed by repeated CGG (sCGG) in neuronal dysfunction linked to FMR1-PM. In blood of FMR1 premutation carriers (fXPCs) we have detected a strong deregulation of genes enriched in FXTAS-relevant biological pathways. We have also identified a deregulated gene (EAP1) that may underlie POF1 in female fXPCs. In addition, we found increased levels of sCGG in different models of FMR1-PM and further demonstrated the neurotoxic activity of sCGG through a mechanism dependent on RNA induced silencing machinery. We propose that the activity of sCGG may contribute to transcriptome perturbations with downstream pathogenic consequences. Overall, we provide mechanistic insight into the disease process and further suggest targets for FXTAS diagnosis to the myriad of phenotypes associated with FXPC. / Homes portadors de la premutació (PM) en el gen associat Fràgil X (FMR1), presenten entre 55-200 repeticions de CGG, estan en risc de desenvolupar el síndrome de tremolor/atàxia associat al X fràgil (FXTAS), i les dones fallida ovàrica precoç (POF1). Aquestes malalties són causades per la funció tòxica de l'ARN missatger. Alteracions funcional de diversos reguladors de l'expressió gènica s'ha proposat com a causa subjacent a aquests trastorns. En aquesta tesi, s'han caracteritzat les alteracions associades al transcriptome de la premutació en l’FMR1 i analitzat la rellevància de la biogènesi i l'activitat d'un petit ARN format per CGG repetits (sCGG) en la disfunció neuronal relacionada amb la PM del FMR1. En sang de portadors de la premutació en l’FMR1 (fXPCs) s'ha detectat una forta desregulació de gens enriquit en vies biològiques rellevants en FXTAS. També hem identificat un gen desregulat (EAP1) que pot ser la base POF1 en dones fXPCs. A més, hem trobat un augment en els nivells de sCGG en diferents models de FMR1-PM i demostrem la seva activitat neurotòxica a través d'un mecanisme dependent en la maquinària de silenciament gènic. Proposem que l'activitat de sCGG pot contribuir a causar pertorbacions en el transcriptoma i desencadenar conseqüències patògenes.En general, oferim un nou enfoc en procés de la malaltia i un diagnòstic més exacte per la gran varietat de fenotips associats amb fXPCs.

Drosophila subobscura és una espècie amb un polimorfisme cromosòmic molt ric, adaptatiu i que actualment està responent al canvi climàtic. Malgrat això, encara es desconeixen els mecanismes selectius que mantenen les inversions a les poblacions i fan que aquestes siguin adaptatives. Existeixen tres hipòtesis descrites per tal d’explicar el manteniment de les inversions a les poblacions: la hipòtesi de la Coadaptació de Dobszhansky, la hipòtesi de la selecció supergènica de Wassermann i la hipòtesi de l’Adaptació local de Kirkpatrick i Barton. L’objectiu del present treball ha estat estudiar a D. subobscura el paper de les inversions cromosòmiques en l’adaptació a l’ambient i com es mantenen a les poblacions naturals. D’aquesta manera, es va analitzar el contingut genètic de les 4 inversions més freqüents del cromosoma O en set poblacions europees, localitzades al llarg d’un gradient latitudinal. S’han utilitzat marcadors moleculars com ara loci microsatèl•lits i gens candidats a l’adaptació tèrmica. Els resultats han mostrat una alta uniformitat genètica de les inversions cromosòmiques al llarg de la clina latitudinal, suggerint que el contingut genètic d’un determinat ordenament cromosòmic és constant a totes les poblacions. A més, en comparar diferents inversions, s’ha trobat una gran diferenciació genètica, essent l’OST el mes diferent. El gran desequilibri de lligament trobat entre dos dels gens, localitzats a més de 14Mb de distància i dins i fóra, respectivament de la inversió O7, podria estar suggerint l’existència d’interaccions epistàtiques entre ells. El conjunt dels nostres resultats indiquen que la hipòtesi de l’adaptació local és la que millor explicaria el manteniment de les inversions del cromosoma O de D. subobscura. Per altra banda també, s’ha analitzat la relació de diferents ordenaments cromosòmics amb la termotolerància i la resposta al xoc tèrmic. Els nivells basals d’HSP70 en els individus homocariotips O3+4 són molt elevats i equivalents als nivells de proteïna mesurats després d’un xoc tèrmic en tots els homocariotips independentment del seu ordenament. Això, sumat a que presenten una major termotolerància i termopreferència en relació als individus portadors de l’ordenament OST, podria estar relacionat amb la clina latitudinal de freqüència que presenta d’aquest ordenament. / Drosophila subobscura is a species with a highly rich inversion polymorphism, which has been shown to be adaptive and responding to global warming. However, the selective pressures acting on inversion how are they maintained in the populations are still unclear. Three main hypotheses have been proposed to explain the adaptive value of inversions: the Coadaptation hypothesis by Dobszhansky, the supergene selection postulated by Wassermann and the Local adaptation hypothesis of Kirkpatrick and Barton. In the present work we aimed to study in D. subobscura the role of chromosomal inversions in the adaptation to the environment and how are they maintained in the populations. To discriminate between the different hypotheses, the genetic content of the four more frequent arrangements of the O chromosome was analyzed in seven different populations located along a latitudinal cline. Different molecular markers such as microsatellite loci and candidate genes for thermal adaptation were used. The results showed a high genetic uniformity of inversions along the latitudinal cline, suggesting that the genetic content of each arrangement it is constant in all populations. Moreover, when comparing different arrangements, a high differentiation was found, being the OST the most different. The strong linkage disequilibrium found between two of the genes, despite being located 14Mb apart and inside and outside O7 inversion respectively could suggest the existence of epistatic interactions between them. Thus, the Local Adaptation hypothesis is the one that fits better our data and would explain the maintenance of the arrangements of the O chromosome of D. subobscura. Moreover, we have studied the relationship of the different chromosomal arrangements with the thermotolerance and the heat shock response. The results showed that O3+4 outbred individuals presented very high basal values of Hsp70 levels, equivalent to those measured after a heat shock in all the homokaryotypes independently of the arrangement. This, together with higher thermotolerance and thermopreference when comparing with the individuals carrying the OST arrangement, could be related whit the latitudinal cline of frequency that the O3+4 arrangement presents.

La presente tesis es un estudio exhaustivo de genómica de poblaciones en la especie modelo Drosophila melanogaster la cual combina aproximaciones bioinformáticas y teórico-estadísticas. El objetivo de este estudio es doble, queremos estimar la importancia relativa de distintos regímenes de selección natural y el impacto del efecto Hill-Robertson a lo largo del genoma de D. melanogaster. Hemos dividido los resultados y discusión en tres partes distintas. En la primera parte hemos desarrollado dos estimadores puntuales de la acción de la selección purificadora basados en el polimorfismo nucleotídico. En la segunda parte hemos aplicado nuestros nuevos estimadores, junto con estimadores existentes de la distribución de coeficientes de selección de nuevas mutaciones deletéreas y la tasa de evolución adaptativa, sobre secuencias genómicas de D. melanogaster provenientes del proyecto Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP). Este trabajo de tesis se inició como parte de un gran proyecto internacional el cual fue publicado en 2012 (Mackay et al. 2012). En la tercera y última parte hemos estudiado el efecto de la tasa de recombinación, la densidad génica y la tasa de mutación sobre el número de substituciones de cambio de amino ácido adaptativas ocurridas desde la separación de D. melanogaster y D. yakuba. Además, hemos estimado por primera vez cuantas substituciones adaptativas dejan de fijarse como consecuencia del efecto Hill-Robertson en el genoma codificador de D. melanogaster. Este trabajo ha sido publicado recientemente en 2016 (Castellano et al. 2016). / The present thesis is a comprehensive population genomic study in the model species Drosophila melanogaster which combines bioinformatic and theoretical-statistical approaches. The purpose of this study is two-fold, we want to estimate the relative importance of different regimes of natural selection and the impact of the Hill-Robertson effect along the genome of D. melanogaster. We have divided the results and discussion sections in three distinct parts. In the first part we have designed two new point estimators of the action of purifying selection using nucleotide polymorphism data. In the second part we have applied our new estimators together with existing methods to estimate the distribution of fitness effects (DFE) of new deleterious mutations and the rate of adaptive evolution using genomic sequences of D. melanogaster coming from the Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP) project. This thesis work has started as part of a large international project which was published in 2012 (Mackay et al. 2012). In the third and last part we have studied the effect of the rate of recombination, the mutation rate and gene density upon the number of adaptive amino acid substitutions that have occurred since the split between D. melanogaster and D. yakuba. Moreover, we have estimated for the first time how much the Hill-Robertson interference impedes the rate of adaptive evolution in the coding genome of D. melanogaster. This work has been recently published in 2016 (Castellano et al. 2016).

Aquesta tesi és una contribució al coneixement de les bases moleculars de la síndrome nefròtica idiopàtica concretament, la nefropatia membranosa idiopàtica i la síndrome nefròtica córtico-resistent (SNCR) o glomeruloesclerosis segmentària i focal (GESF). La primera part d’aquesta tesi presenta l’associació de determinades variants genètiques tan amb el risc de desenvolupar nefropatia membranosa idiopàtica com amb el curs clínic de la malaltia, en població espanyola. Els nostres resultats mostren que determinats al·lels en els gens HLA-DQA1 i PLA2R1 estan associats amb un major risc de desenvolupar nefropatia membranosa. A més, la combinació dels al·lels de risc per a aquests dos gens resulta en un risc encara més incrementat per a desenvolupar la malaltia. Per contra, no s’ha identificat cap associació significativa entre el nombre de copies en gens FCGR3A i FCGR3B i la susceptibilitat per desenvolupar nefropatia membranosa. Per primer cop, presentem evidència de la contribució d’al·lels de risc en els gens HLA-DQA1 i PLA2R1 en la predicció de la resposta al tractament immunosupressor i l’empitjorament de la funció renal. La segona part d’aquesta tesi es centra en la millora del diagnòstic genètic de la SNCR/GESF i l’estudi de les seves bases moleculars. En primer lloc, es va demostrar la idoneïtat de les tècniques de seqüenciació massiva per al diagnòstic genètic de la SNCR/GESF. A més, es van detectar pacients amb mutacions en un gen de la SNCR/GESF conjuntament amb COL4A3. Aquests pacients presentaven un fenotip més greu suggerint que mutacions en diferents gens que convergeixen en la barrera de filtració glomerular influencien en la severitat de la malaltia. El paper causal i modificador del gen TTC21B es va examinar en una cohort de pacients amb malaltia renal quística o glomerular. Els nostres resultats indiquen que la mutació p.P209L en homozigosi no és la única mutació d’aquest gen que causa GESF. A més, variants en heterozigosis en el gen TTC21B podrien agreujar el fenotip de pacients amb malalties renals quístiques o glomerulars. Finalment, s’ha desenvolupat un panell de gens associats amb malaltia renals com a eina diagnòstica per a malalties renals hereditàries quístiques i glomerulars, permetent el diagnòstic diferencial d’aquestes malalties, així com la identificació de variants estructurals, mutacions en mosaic i patrons d’herència complexes. Aquesta aproximació s’està utilitzant actualment en el diagnòstic genètic de rutina de pacients de tot Espanya i altres països, sent un clar exemple de recerca translacional. / This thesis is a contribution to the knowledge of the molecular bases of idiopathic nephrotic syndrome specifically, the idiopathic membranous nephropathy and steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS)/ focal segmental glomerulosclerosis (FSGS). The first part of this thesis is focused in the association of genetic polymorphisms with the risk to develop idiopathic membranous nephropathy and with its clinical course in the Spanish population. Our results showed that specific alleles within HLA-DQA1 and PLA2R1 genes are associated with a higher risk of idiopathic membranous nephropathy. In addition, the combination of the risk alleles for both genes results in an increased risk of disease development. In contrast, no significant association was found between copy number variants in FCGR3A and FCGR3B genes and susceptibility to idiopathic membranous nephropathy. For the first time, we presented evidence of the contribution of the risk alleles within HLA-DQA1 and PLA2R1 genes to predict response to immunosuppressive therapy and decline in renal function. The second part of these thesis focus on the improvement of SRNS/FSGS genetic testing and the study of its molecular bases. The suitability of massive parallel sequencing for genetic diagnosis of SRNS/FSGS was demonstrated. In addition, we detected patients with mutations in an SRNS/FSGS gene together with COL4A3 that showed increased disease severity, suggesting that mutations in different genes that converge in the glomerular filtration barrier influence disease severity. The causative and modifier role of TTC21B gene was examined in our cohort of cystic and glomerular patients. Our results showed that the homozygous p.P209L is not the only causative mutation of FSGS. Furthermore, heterozygous deleterious TTC21B variants may aggravate the phenotype of patients with glomerular and cystic kidney inherited kidney diseases. Finally, a kidney-disease gene panel was developed as a diagnostic tool for cystic and glomerular inherited kidney diseases, enabling the differential diagnosis of these diseases and the identification of mosaic mutations, structural variants and complex inheritance patterns. This approach is currently used in routine genetic diagnostic of patients from all over Spain and other countries, providing a nice example of translational research.

No description available.

En l'entramat metabòlic cel·lular, milers de substrats estan interconnectats mitjançant reaccions bioquímiques. Tot i que aquest alt grau d'interrelació podria conduir al flux de substrats en múltiples direccions simultàniament, a la pràctica els fluxos metabòlics passen a través de rutes específiques. Els nostres estudis evolutius sobre el metabolisme del glicogen mostren que els isoenzims que catalitzen les diverses etapes d'aquesta ruta contribueixen a definir i a aïllar els mòduls funcionals, un punt clau per entendre la organització metabòlica en els vertebrats. Aquests isoenzims específics de teixit sorgeixen per duplicació gènica a l'origen dels vertebrats i que les seves propietats bioquímiques co-evolucionen per adaptar-se a les necessitats metabòliques específiques dels teixits on s'expressen. La retroinhibició de les hexoquinases d'alta afinitat o l'activació al·lostèrica de les glicogen sintases, ambdós efectes mediats per la glucosa-6-fosfat, són clars exemples de que les característiques cinètiques dels isoenzims es modulen al llarg de l'evolució dels vertebrats per satisfer les diferents funcions del metabolisme del glicogen. A més, els nostres resultats ajuden a entendre la única situació descrita on, paradoxalment, els isoenzims del metabolisme del glicogen majoritaris en cervell, múscul i fetge es barregen i es co-expressen en el mateix teixit: el fetge embrionari de mamífer. Els resultats presentats en aquesta memòria indiquen que la síntesi de glicogen en el fetge embrionari, essencial per assegurar la supervivència del nounat, requereix la re-organització de l'expressió dels isoenzims que hi participen, a fi d'estabilitzar el contingut de glicogen embrionari en front de les variables condicions fisiològiques maternes.Estudis previs indicaven que els ratolins defectius per la isoforma muscular de la glicogen sintasa mostren greus defectes en el desenvolupament cardíac. Per aprofundir en les bases moleculars d'aquesta alteració, hem caracteritzat la translocació nucleo-citoplàsmica de la glicogen sintasa muscular humana i hem analitzat la seva funció en el nucli. Els nostres resultats mostren com aquest enzim transloca vers al nucli i forma agregats nuclears quan es deplecionen les reserves de glicogen de la cèl·lula. A més, els resultats obtinguts amb els mutants de deleció de l'enzim indiquen que el domini implicat en l'activació al·lostèrica de l'enzim per G6P, la regió rica en arginines, és crucial per a la seva acumulació nuclear. En conjunt, aquestes observacions suggereixen que, a part de la funció metabòlica, la glicogen sintasa podria participar en processos nuclears on es requerís un sensor de l'estat energètic de la cèl·lula. / In the metabolic network of the cell, hundreds of substrates are interconnected through biochemical reactions. Although such interconnection could lead to the simultaneous flow of substrates in numerous directions, in practice metabolic fluxes pass through specific pathways. Our metabolic and evolutionary studies on glycogen metabolism showed that isoenzymes contribute to define and isolate separate functional modules, a key issue to understand metabolic organisation in vertebrates. These tissue-specific isoenzymes are generated by gene duplication at the dawn of vertebrates and their biochemical properties co-evolved to suit specific metabolic roles of the tissues where they are expressed. The retro inhibition of high-affinity hexokinases, or glycogen synthase allosteric activation, both effects mediated by G6P, are clear examples of kinetic features that are modulated through vertebrate evolution to satisfy different roles of glycogen metabolism. Furthermore, our results help to understand the only reported situation where, paradoxally, isoenzymes of glycogen metabolism enzymes from liver, muscle and brain are merged and co-expressed in the same tissue: the mammalian embryonic liver. Our results indicate that embryonic glycogen synthesis in liver, essential for newborn survival, requires the re-design of isoenzyme distribution in order to buffer the embryonic glycogen content in front of changing maternal metabolic conditions. In addition, it has been described that muscle glycogen synthase isoenzyme (MGS) knockout mice show severe developmental heart defects. In order to adress the molecular basis of this growth alteration, we characterised the nucleo-cytoplasmic translocation of MGS and analyzed its nuclear function. We showed that this enzyme translocate into the nucleus and form nuclear aggregates when cells are depleted of glucose and glycogen deposits. Moreover, the results that we obtained with the deletion mutants indicate that the domain involved in the allosteric activation of the enzyme by G6P, the arginine-rich cluster, is crucial for its nuclear acumulation. Taken together, these observations suggest that, in addition to its metabolic function, MGS may participate in nuclear processes which would require a sensor of the cellular enregy state.

Reconstrucció de les condicions climàtiques i de conreu en el passata partir de l'anàlisi isotòpica de restes arqueobotàniquesL'aparició i progressiu desenvolupament de l'agricultura durant els darrers 10.000 anys ha alterat radicalmentl'estructura social i poblacional dels grups humans, així com la seva relació amb l'entorn. De fet, l'adopció del'agricultura pot constituir el primer exemple en el temps d'interacció recíproca entre el medi ambient i la humanitat.Per tant, la reconstrucció de les condicions ambientals (d'origen climàtic o degudes a l'acció humana) que vancaracteritzar aquest procés és de gran interès per tractar de conèixer-ne les causes, així com per entendre els efectes a llarg termini que ha tingut l'economia agrícola en el medi. L'objectiu general de la tesi és desenvolupar noves eines destinades a reconstrucció de les condicions climàtiques i de conreu durant l'origen i dispersió de l'agricultura a la prehistòria. La metodologia que es proposa està basada en l'estudi de les restes vegetals (fustes i llavors carbonitzades) que són recuperades rutinàriament en excavacions arqueològiques, posant especial èmfasi en l'ús dels isòtops estables com a indicadors paleoambientals. El treball es pot dividir en dos grans blocs. El primer pretén configurar l'entorn climàtic en el que va evolucionar l'agricultura, en tant que el segon se centra en la caracterització de les condicions específiques de creixement de les espècies conreades.El primer bloc té com a objectiu la posada a punt d'una metodologia que permeti quantificar els canvis d'aridesa en el passat, a partir de l'anàlisi isotòpica de carbons d'espècies forestals. Això requereix una calibració prèvia amb material actual, així com una valoració de l'efecte de la carbonització sobre la signatura isotòpica de la fusta. Al primer capítol, es va caracteritzar la signatura climàtica present a la composició isotòpica de carboni (d13C) de la fusta en condicions mediterrànies, fent servir Pinus halepensis Mill. i Quercus ilex L. Com a espècies de referència, trobant que en totes dues espècies aquesta es podia relacionar sobretot amb la precipitació. Al segon capítol, es va estudiar la relació entre el clima i la composició isotòpica d'oxigen (d18O) per P. halepensis, així com les diferències en la signatura isotòpica (d13C i d18O) present als dos components fonamentals de la fusta: cel×lulosa i lignina. Es va trobar que la component climàtica de la d13C és igualment present a cel×lulosa i lignina, en tant que per la d18º l'extracció de cel×lulosa és necessària per tal d'obtenir informació climàtica, fet que impedeix la seva aplicació en material arqueològic. Finalment, al tercer capítol es va poder demostrar com la carbonització, tot i alterar significativament la d13C de la fusta, no n'elimina la component climàtica original, que pot recuperar-se mitjançant una senzilla correcció, que fa servir el contingut de carboni com a variable de referència. Amb aquesta metodologia es reconstrueixen els canvis d'aridesa que han tingut lloc a les valls del Cinca i del Segre (Depressió de l'Ebre)durant els darrers 10.000 anys, trobant una major disponibilitat hídrica al llarg dels darrers mil×lenis que no pas en el present.El segon bloc aborda la descripció de diferents vessants de les condicions de conreu a l'agricultura prehistòrica, combinant l'anàlisi de la d13C amb mesures morfomètriques en llavors d'espècies conreades, fonamentalment cereals. El capítol quart constitueix una revisió crítica de les dades existent sobre isòtops estables en restes arqueobotàniques, proposant noves aproximacions per tal de maximitzar la informació que se'n pot derivar. Es mostra com la combinació d'anàlisis en espècies conreades i forestals, així com la comparació entre diferents conreus, pot ajudar a detectar canvis en la disponibilitat hídrica dels conreus, fruit de l'acció humana.El cinquè capítol desenvolupa una nova metodologia que permet estimar el pes del gra dels cereals conreats en el passat, a partir de les seves dimensions, tot considerant l'efecte de la carbonització. Això permet, per primer cop, establir una lligam directe entre les dades obtingudes a partir de restes arqueobotàniques i els estudis agronòmics. Finalment, el capítol sisè combina dades obtingudes a partir dels mètodes descrits en els tres capítols anteriors per resoldre les possibles causes dels canvis observats en la mida del gra als jaciments les valls del Cinca i del Segre durant els darrers 4.000 anys. / Reconstrucción de las condiciones climáticas y de cultivo en el pasado a partir del análisis isotópico de restos arqueobotánicosLa aparición y progresivo desarrollo de la agricultura durante los últimos 10.000 años ha alterado radicalmente la estructura social y poblacional de los grupos humanos, así como su relación con el entorno. De hecho, la adopción de la agricultura puede que constituya el primer ejemplo en el tiempo de interacción recíproca entre el medio ambiente y la humanidad. De ahí que reconstruir las condiciones ambientales (de origen climático o debidas a la acción humana) que caracterizaron este proceso sea de gran interés para tratar de conocer sus posibles causas, así como para entender los efectos a largo plazo que ha tenido la economía agrícola en el medio. El objetivo general de esta tesis es el desarrollo de nuevas herramientas destinadas a reconstruir las condiciones climáticas y de cultivo durante el origen y dispersión de la agricultura en la prehistoria. La metodología propuesta se basa en el estudio de los restos vegetales (maderas y semillas carbonizadas) que son recuperados rutinariamente en excavaciones arqueológicas, poniendo especial énfasis en el empleo de los isótopos estables como indicadores paleoambientales.El trabajo se puede dividir en dos grandes bloques. El primero pretende configurar el entorno climático en el que evolucionó la agricultura, mientras que el segundo se centra en caracterizar las condiciones específicas decrecimiento de las especies cultivadas.El primer bloque tiene como objeto la puesta a punto de una metodología que permita cuantificar los cambios de aridez en el pasado, partiendo del análisis isotópico de carbones de especies forestales. Esto requiere una calibración previa con material actual, así como una valoración del efecto de la carbonización en la señal isotópica de la madera.En el primer capítulo, se caracterizó la señal climática presente en la composición isotópica de carbono (d13C) de la madera en condiciones mediterráneas, empleando Pinus halepensis Mill. y Quercus ilex L. como especies de referencia, encontrando que en ambas especies ésta se podía relacionar fundamentalmente con la precipitación. En el segundo capítulo, se estudió la relación entre el clima y la composición isotópica de oxígeno (d18O) para P.halepensis, así como las diferencias en la señal isotópica (d13C y d18O) presente en los dos componentes principales de la madera: celulosa y lignina. Se encontró que la señal climática de la d13C es igualmente presente en celulosa y lignina, mientras que para la d18O la extracción de celulosa es necesaria para obtener una información climática, lo que impide su aplicación en material carbonizado. Finalmente, en un tercer capítulo se demostró cómo la carbonización, si bien afecta significativamente la d13C de la madera, no elimina la señal climática original, que puede recuperarse mediante una simple corrección, incluyendo el contenido de carbono como variable de referencia.Mediante este metodología se reconstruyen los cambios de aridez ocurridos en los valles del Cinca y del Segre (Depresión del Ebro) durante los últimos 4.000 años, observando una mayor disponibilidad hídrica en los últimos milenios en relación con el presente.El segundo bloque se centra en describir diferentes aspectos de las condiciones de cultivo en la agriculturaprehistórica, combinando el análisis de la d13C con medidas morfométricas en semillas de especies cultivadas,fundamentalmente cereales. El capítulo cuarto constituye una revisión crítica de la información isotópica existente sobre restos arqueobotánicos, proponiendo nuevos enfoques destinados a maximizar la información extraíble a partir de estos datos. Se muestra cómo la combinación de análisis en especies cultivadas y forestales, así como la comparación entre cultivos, puede ayudar a detectar cambios en la disponibilidad hídrica de los cultivos debidos a la acción humana. El capítulo quinto desarrolla una nueva metodología que permite estimar el peso del grano en los cereales cultivados en el pasado, a partir de sus dimensiones, y considerando el efecto de la carbonización. Esto permite, por primera vez, una comparación directa entre los datos obtenidos a partir de restos arqueobotánicos y la bibliografía agronómica. Finalmente, el capítulo sexto combina datos obtenidos mediante los métodos descritos en los tres capítulos anteriores para resolver las posibles causas de los cambios en el tamaño del grano observados en los valles del Cinca y del Segre durante los últimos 4.000 años. / Reconstruction of climatic and crop conditions in the past based on the isotope signature of archaeobotanical remainsThe onset and progressive development of agriculture during the last 10,000 years has modified radically thesocial and demographic structure of human groups, as well as their interaction with the environment. In fact, the adoption of agriculture is probably the first example of reciprocal interaction between the environment and the humanity. Thus, reconstructing the environmental conditions (either climatic or anthropogenic) that characterised this process is of great interest in order to know their potential causes, as well as to understand the long-term effects of agriculture economy on the environment. The general objective of this Thesis is the development of new tools addressed to the reconstruction of climatic and crop conditions during the origins and spread of agriculture in Prehistory. The proposed methodology is based on the study of plant remains (wood charcoal and charred seeds) routinely recovered during archaeological excavations, with special emphasis on the use of stable isotopes as palaeoenvironmental indicators. The work can be divided into two main blocks. The first attempts to get a picture of the climatic context in which evolved agriculture, while the second one is centred on the specific growing conditionsof cultivated crops.The objective of the first bock is to obtain a methodology allowing the quantification of aridity changes in thepast from the stable isotope analysis of wood charcoal from forest species. This requires a previous calibration with modern material, as well as the assessment of the effect of carbonisation on the stable isotope signature of wood.The first chapter characterises the climatic signature in carbon isotope composition (d13C) of wood in Mediterranean conditions, using Pinus halepensis Mill. and Quercus ilex L. as reference species, finding that in both species d13C is mostly related to precipitation. The second chapter studies the relationship between climate and oxygen isotope composition (d18O) for P. Halepensis, as well as the differences in the isotopic signature (d13C and d18O) in the two major components of wood: cellulose and lignin. We found that the climatic signal of d13C is equally present in cellulose and lignin, whereas for d18O cellulose extraction is necessary to obtain a climatic signal, which prevents its application in carbonised material. Finally, the third chapter shows how carbonisation, although affecting significantly the d13C of wood, does not remove the original climatic signal, which can be recovered by means of a simple correction, taking carbon concentration as a reference variable. Using this methodology, we reconstructed aridity changes in the Cinca and Segre valleys (Ebro Depression) during the last 4,000 years, finding greater water availability in the last millennia than in present.The second block describes different aspects of crop conditions in prehistoric agriculture, combining d13Canalyses with morphometrical variables of cultivated species, mostly cereals. Chapter four constitutes a critical review of the isotopic data available for archaeobotanical remains, proposing new approaches in order to maximise the information retrieved from these data. It shows how the combined analysis of crop and forest species, as well as the comparison among different crops, may help to detect human-driven changes in crop water availability. Chapter five develops a new methodology to estimate grain weight in cereals cultivated in the past, from charred grain dimensions, and considering the effect of carbonisation. This allows, for the first time, a direct comparison between archaeobotanical data and current agronomic studies. Finally, Chapter six combines data obtained using the methods described in the three former chapters to study the potential causes of the observed grain weight changes in Cinca and Segre valleys during the last 4,000 years.