La importancia de los plaguicidas recae tanto en los numerosos beneficios que tienen para la sociedad (protectores de plagas de las cosechas, erradicación de vectores que propagan enfermedades, etc.); como en los efectos negativos que representan para la salud (problemas reproductivos, sarcomas, linfomas, etc.). Los colectivos en contacto más directo con estos productos, como son los agricultores, tienen un mayor riesgo de sufrir los efectos adversos que se han asociado con los plaguicidas.Esta Tesis comprende una serie de trabajos sobre la evaluación del daño genotóxico de los plaguicidas en cuatro poblaciones agrícolas europeas, mediante la técnica de micronúcleos (MN) en dos tipos celulares: linfocitos de sangre periférica y células de descamación de la mucosa bucal. Paralelamente, también se determinó el índice de proliferación celular (CBPI).Las poblaciones que se han estudiado pertenecen a colectivos agrícolas con una continua exposición a plaguicidas, procedentes de Almería (España), Malopolska (Polonia), Nea Makri (Grecia) y del sudeste de Hungría. Cada población ha sido evaluada individualmente y finalmente se han agrupado y analizado los datos conjuntos, para obtener una visión general de los efectos de la exposición.Además, en la población almeriense se realizó un estudio longitudinal, para evaluar la existencia de diferencias estacionales en dos periodos de distinta aplicación de plaguicidas. Asimismo, en esta población se evaluó la posible influencia de los genotipos GSTM1 y GSTT1 sobre la susceptibilidad individual en al respuesta genotóxica a la exposición a plaguicidas. Únicamente se observó una relación entre GSTM1 y CBPI disminuyendo este último en presencia del producto del gen GSTT1 en los agricultores.A pesar de que en alguna población se observa una tendencia a un mayor número de células binucleadas con micronúcleos (BNMN), en los linfocitos de los individuos expuestos a plaguicidas, en ninguna de las poblaciones evaluadas individualmente ni en el análisis global de la población, las diferencias observadas llegan a alcanzar un nivel estadísticamente significativo. Lo mismo ocurre con las células bucales con MN (CBMN).Respecto del CBPI, en la mayoría de poblaciones se observan descensos, significativos o no, de los valores del mismo en el colectivo agrícola. Al valorar toda la población en global estas variaciones se traducen en un descenso significativo del CBPI en los individuos expuestos a plaguicidas, lo que refleja el efecto citotóxico de los mismos.En el análisis global, observamos que el hecho de pertenecer a un país u otro confiere una serie de características particulares a cada grupo, que se reflejan en una mayor frecuencia de un determinado tipo de daño genético según el sistema celular estudiado.Otro de los objetivos de la Tesis era valorar los factores higiénicos, de salud, de exposición a plaguicidas, de protección laboral, de alimentación, etc., que podían influir en las variaciones de la frecuencia de micronúcleos y en la proliferación celular. Entre los factores que han mostrado tener un efecto significativo en la variación de las frecuencias de las variables de estudio están la edad, el hecho de ser mujer, el tabaco, la exposición a rayos X por diagnóstico médico, así como factores de la dieta (consumo de vegetales crudos, pescado y aceite de oliva). Hay que destacar el incremento significativo en el porcentaje de abortos encontrados en la población agrícola de Polonia, lo que junto con el elevado número de intoxicaciones y el descenso del CBPI en este colectivo nos indica que, a pesar de no observarse un incremento significativo de daño genético detectable mediante el ensayo de MN, los plaguicidas están ejerciendo efectos biológicos adversos sobre los agricultores. / The importance of pesticides can be reflected as much on the benefits that they represent for society (crops pest prevention, vector erradication); as on the negative effects they have on health (reproductive problems, sarcomas, lymphomas, etc.). These adverse effects mainly affect occupationally exposed populations, such as farmers.This PhD Thesis comprises a series of works on the evaluation of genotoxic damage caused by pesticide exposure of four agricultural European populations, using the micronucleus assay (MN). Both lymphocytes of peripheral blood and exfoliated cells of the oral mucosa were used. The cytokinesis-block proliferation index (CBPI) was also calculated to detect possible variations in the proliferative kinetics of lymphocytes (due to the pesticide exposure).Populations from Greece, Spain, Poland and Hungary, all with an intense and continuous agriculture activity, were evaluated individually. Finally, in order to obtain a general effect of the exposure to pesticides, all the data was pooled and analysed together.Furthermore, a follow-up study was carried out in the Spanish population to determine, at two different periods of time and different pesticide intensity application, if there were season-related differences in the MN frequency.In this population, to look for relationship between the genotypes and the cytogenetic response, each donor was assessed for the presence or absence of glutathione S-transferase M1 and GSTT1. Only in the exposed individuals, the CBPI appeared to be affected, decreasing in the presence of GSTT1.Although in some populations we observed a trend to a high number of BNMN (binucleated cells with micronucleus) in the lymphocytes of farmers exposed to pesticides, none of the statistical analysis showed significant differences between controls and farmers, for neither lymphocytes nor buccal cells with MN.Regarding the CBPI, decreases were observed in most of the pesticide-exposed populations. In the evaluation of all the populations, the group occupationally exposed to pesticides showed a significantly lower CBPI level, indicating some cytotoxicity due to the exposure.The global analysis showed us that the increases in genetic damage seemed to be related to different cellular systems for each country, revealing the particular characteristics of the populations evaluated.One of the aims was to assess the hygienic and health factors, exposure to pesticides, work protective measures, diet, etc., that could influence on the frequency variations of MN and cell proliferation. From the studied variables, those with a significant effect on the frequencies studied were age, the fact of being woman, tobacco, X-ray medical exposure and some diet factors (consuming raw vegetables, fish and olive oil).The agricultural Polish population showed a significant increase in the percentage of miscarriages, which together with the high number of intoxications and the CBPI decrease in this group, showed us that pesticides do have biological adverse effects on the farmers despite the lack of a significant increase of cytogenetic damage evaluated by the MN assay.

Al arsénico se le considera un problema de salud mundial debido a la cantidad de poblaciones expuestas crónicamente al mismo y a la gravedad de los efectos inducidos, incluyendo el incremento de algunos tipos de cáncer. Aunque los mecanismos de acción del arsénico no están del todo dilucidados, está ampliamente aceptado su potencial citotóxico, genotóxico y carcinógeno. En este trabajo se pretende estudiar sus efectos genotóxicos, entender los mecanismos implicados en el proceso de su metabolización e investigar posibles biomarcadores de susceptibilidad asociados a la exposición.Inicialmente, se llevó a cabo un estudio de biomonitorización para averiguar las posibles correlaciones entre efectos genotóxicos y exposición ocupacional al arsénico. Se utilizaron los niveles de arsénico y de sus metabolitos en orina como biomarcador de exposición y los ensayos de MN y de SCE como medida de daño citogenético.Dado que recientemente se ha propuesto que los dos miembros funcionales de la nueva clase Omega, GSTO1 y GSTO2, juegan un papel importante en la homeostasis celular, estando también involucradas en la biotransformación del arsénico, hemos postulado que, polimorfismos en estos genes podrían estar correlacionados con cambios en la actividad de estas proteínas que lleven a diferencias en el perfil de excreción del arsénico y, consecuentemente, a diferencias de respuesta frente a una exposición. La segunda parte del trabajo ha consistido en el análisis de los polimorfismos de GSTO1 y de GSTO2 entre tres grupos étnicos y en la caracterización enzimática de dos de las variantes de GSTO1. Además, los polimorfismos de GSTO1 y de GSTO2 también se han analizado en la población de trabajadores chilenos, estableciéndose correlaciones entre genotipos, perfil de excreción y daño citogenético, integrando así las dos partes del estudio.A pesar de los avances en los estudios de expresión de GTSO1, el papel que ejerce esta enzima en el metabolismo y en la toxicidad del arsénico sigue en discusión. Así, se han utilizado dos líneas celulares con diferentes niveles de expresión de GSTO1, junto con la reducción de sus niveles de expresión mediante la técnica de RNAi, para evaluar las diferencias de respuesta frente a distintos compuestos de arsénico. No se han detectado diferencias en la toxicidad del arsénico relacionadas con los diferentes niveles de expresión. En contraste, la reducción del estrés oxidativo por la NAC indica que diferencias en los niveles de GSTO1 pueden estar modulando las diferencias de respuesta al estrés oxidativo inducido por los compuestos de arsénico. Nuestros resultados no excluyen la participación de otras enzimas en el proceso de biotransformación y toxicidad del arsénico. / Arsenic has become a major world health problem, due to the size of the exposed population and the seriousness of its effects, which are mainly related with the increase of cancer cases among the chronically exposed populations. Even though the mechanisms of action of this element are not fully understood, it has been clearly reported that it is cytotoxic, genotoxic and carcinogenic in humans. In this context, we planned to study the genotoxic effect of this metal, to understand the metabolic mechanisms involved in this process, and to find biomarkers of susceptibility to arsenic exposure.Initially, a biomonitoring study was carried out to investigate the correlation between arsenic occupational exposure and genotoxic effects in smelting plant workers, using the levels of arsenic and its metabolites excreted in urine as an exposure biomarker and the SCE and the MN assays as measures of cytogenetic damage.Two members of the recently identified Omega class glutathione S-transferase enzymes (GSTO1 and GSTO2) have been proposed to play an important role in cellular homeostasis and in the arsenic reduction pathway. Therefore, polymorphisms in these genes could be related with variations in the protein activity leading to changes in the arsenic excretion profile, and consequently with the response to chronic exposures. The second part of this study was based on the analysis of hGSTO1/2 polymorphisms among three ethnical groups and the enzymatic characterization of two GSTO1 variants. Moreover, GSTO1 and GSTO2 polymorphisms were also analyzed in the Chilean workers. Then, the first and the second part of this work have been linked, establishing correlations among genotypes, variations of urine arsenic profile and cytogenetic damage. Despite the recent progress in the study of GSTOs expression and pharmacokinetics, the role of these enzymes in the arsenic metabolism and toxicity is under discussion. To clarify this, two cell lines with different expression levels of GSTO1 have been used to evaluate the cytotoxic response of various arsenic compounds. In addition, depletion of the GSTO1 levels with siRNA has also been used. Results do not shown significant variations in arsenic toxicity, according to the different expression levels. In contrast, reduction of oxidative stress by NAC indicates that differences at GSTO1 expression levels could modulate the response to the oxidative stress induced by arsenic compounds. These results do not rule out others enzymes participating in the arsenic metabolism and toxicity.

El presente estudio tiene como objetivo analizar la genotoxicidad de los metales mercurio, plomo y níquel en D. melanogaster. Para este propósito, se han utilizado y desarrollado dos ensayos in vivo: 1) el ensayo de mutación y recombinación somáticas (SMART) en alas de D. melanogaster; y 2) el ensayo del cometa en hemocitos de Drosophila. Los resultados obtenidos con el ensayo SMART en alas de D. melanogaster indican que ninguno de los tres metales muestra una actividad genotóxica detectable. Sin embargo, al analizar la interacción de estos metales frente al daño genotóxico inducido por la radiación gamma, se observa que únicamente los compuestos de níquel muestran una interacción de tipo sinérgica, lo cual indicaría una interferencia con los mecanismos involucrados en la reparación. Por otro lado, los resultados obtenidos con el ensayo del cometa en hemocitos aislados de larvas previamente tratadas con metales, muestran un daño genético significativo con el metilmercurio, el nitrato de plomo y el sulfato de níquel, indicando una mayor sensibilidad de este ensayo en comparación con el ensayo SMART de alas.Como conclusión final de este trabajo de tesis doctoral se desprende que la genotoxicidad de los metales pesados evaluados en D. melanogaster podría se considerada débil y dependiente de su formulación química. / The present study aims at analysing the genotoxicity of mercury, lead and nickel metals in D. Melanogaster. Two in vivo assays have been employed and developed in order to achieve this: 1) the somatic mutation and recombination test (SMART) in D. melanogaster wings, and, 2) the comet test in Drosophila haemocytes.Our results with the SMART test in D. melanogaster indicate that none of the three metals show a detectable genotoxic activity. However, when analysing the interaction of these metals with the genotoxic damage induced by gamma irradiation, only nickel compounds show a synergic interaction, indicating an interference with the repair mechanisms. On the other hand, the results obtained in the comet assay with isolated haemocytes from larvae previously treated with the metals show a significant genetic damage under methylmercury, lead nitrate, and nickel sulphate, indicating that this test is more sensitive than the SMART assay.Finally, through this doctoral dissertation we have been able to conclude that the genotoxicity of heavy metals on D. melanogaster can be considered weak and dependant of its chemical formulation.

La integridad del DNA es un aspecto fundamental para la salud y el buen funcionamiento de nuestro organismo. Sin embargo, sabemos que el material genético es susceptible de ser dañado por numerosos agentes y/o procesos. Aunque la mayoría del daño que se produce en nuestro material genético es separado eficientemente, parte de él escapa a este proceso constituyendo uno de los sustratos para el potencial desarrollo de un proceso carcinogénico. En los últimos años, se han desarrollado con éxito nuevas metodologías capaces de evaluar el daño en el DNA, diseñándose técnicas que permiten medir directamente roturas de cadena simple (SSB) y de doble cadena (DSB) en el DNA. Entre ellas, el ensayo del cometa se ha convertido en una de las más populares para la evaluación de este tipo de daño. Aunque el ensayo del cometa se ha propuesto como una herramienta apropiada, todavía existen muchos aspectos que deben reconsiderarse, por lo que el objetivo principal de este trabajo de Tesis fue la optimización del ensayo del cometa como biomarcador de daño en el DNA y su aplicación tanto en radiobiología, mediante la construcción de una curva de calibración, como en la biomonitorización de dos cohortes de madres e hijos de dos localidades de Barcelona. Las metodologías del ensayo del cometa que se aplican en los diferentes laboratorios son variadas pero, sin duda alguna, la versión alcalina es la más utilizada. A pH >13, la técnica resulta más sensible para la detección de niveles bajos de daño, por lo que la hemos elegido como versión estándar. Se desarrollaron numerosos experimentos con modificaciones que optimizaron el ensayo en aspectos como: el soporte utilizado, que permitió la manipulación de un elevado número de muestras en un mismo ensayo; la utilización de enzimas de reparación para la detección de daño oxidativo, y la criopreservación para el almacenamiento masivo de muestras valorables mediante el ensayo. En cuanto a las aplicaciones, la construcción de una curva de calibración resulto ser un gran aporte ya que con ella se pudo establecer el daño genético basal de una población, en términos de roturas/109 Da de DNA. Además, se ha puesto de manifiesto que la radiosensibilidad individual puede ser medida con el ensayo de cometa, lo que respalda a la técnica como un buen indicador de inestabilidad genómica individual. Finalmente, en el área de la biomonitorización humana, se encontró una fuerte correlación, tanto en el daño basal como oxidativo, entre madres e hijos; aunque, no se pudo establecer fehacientemente una influencia significativa de ninguno de los factores de confusión considerados. Esto pone en evidencia los problemas asociados con la reciente inclusión del ensayo del cometa en los estudios de biomonitorización, por lo que surge la necesidad de desarrollar estudios específicos que tengan como objetivo principal la determinación de aquellos factores que puedan incidir significativamente en los niveles de daño en el DNA de poblaciones humanas. / The DNA integrity is a fundamental aspect for human health and for the suitable functions of our organism. However, the genetic material is susceptible to be damaged by many agents and processes. Although the majority of damage induced in our genetic material is repaired efficiently, a part of this damage escapes from this process and becomes one of the substrates for the potential development of a carcinogenic process. During the last years new methodologies have been developed to assess the DNA damage by performing techniques which allow to measure single strand breaks (SSB) and double strand breaks (DSB) directly. The comet assay has become one of the most popular approaches to evaluate this type of damage. Although this technique has been proposed as an appropriate tool, many aspects must be still reconsidered. For this reason, the aim of this Thesis was to contribute to the optimization of the comet assay as a biomarker of DNA damage and its application in radiology, by means of the construction of a calibration curve and, also, biomonitoring of two cohorts composed by mothers and newborns recruited from two hospitals of the Barcelona province.The methodologies of the comet assay, which are applied in the different laboratories, are variable but, with no doubt, the alkaline version is the most used. This technique is more sensitive to detect lower levels of damage at pH>13. For this reason, we have chosen it as the standard version to be used in our study. We have developed numerous experiments with modifications which have optimized the assay in three aspects: the type of support utilized, which allows the manipulation of many samples in the same experiment; the use of repair enzymes in order to detect the oxidative damage; and the cryopreservation to keep many samples which can be properly evaluated in the assay.As regards the applications, the construction of a calibration curve was an important contribution because, with its use we have been able to establish the basal genetic damage of the population, in terms of breaks /109 Da DNA. Moreover, it has been proposed that the individual radiosensitivity can be measured with the comet assay. This supportsthat this technique is a satisfactory indicator of individual genomic instability.Finally, in the area of human biomonitoring, we have found a strong correlation for both the DNA basal damage and oxidative damage between mothers and children; but we couldn't clearly establish a significant influence of any of the confusion factors that has been considered in this study. This evidence has revealed related problems with the recent use of comet assay in biomonitoring studies, and has resulted in the necessity to develop specific studies in order to determine these factors, which can influence significantly on the levels of DNA damage in human populations.

La insuficiencia renal crónica (IRC) es una patología que se caracteriza por la disminución de la función renal, con un filtrado glomerular (FG) menor de 60 mL/min 1,73 m2. En los pacientes con IRC existe una alta incidencia de enfermedades cardiovasculares y cáncer, que diversos autores atribuyen a una disminuida capacidad de reparación del DNA, a su disminuida capacidad antioxidante, así como a la evidente acumulación de especies reactivas de oxígeno (EROS), y de productos de la glicación y lipoxidación avanzada (AGE/ALE). En este contexto los objetivos del presente estudio son, determinar si en los pacientes con IRC los niveles de daño genotóxico expresado como la frecuencia de binucleadas con micronúcleos (BNMN) en linfocitos de sangre periférica, son mayores que los obtenidos en un grupo control, así como si dichos pacientes muestran una sensibilidad especial a los efectos de la radiación ionizante. Asimismo, se pretende evaluar si dichos los parámetros se relacionan con la evolución de la patología y/o tratamiento con hemodiálisis (HD). En el presente trabajo se ha estudiado a una población total de 201 pacientes con IRC, en la que 98 se encuentran en tratamiento con HD convencional, y a una población control de 57 individuos sanos. De los pacientes en HD, 33 se muestrearon por segunda vez después de un año, para ver los efectos del tratamiento con HD. Como biomarcador de daño genómico se ha utilizado la frecuencia de micronúcleos en linfocitos de sangre periférica, siguiendo el protocolo de bloqueo de citocinesis con citocalasisna-B. Los valores de radiosensibilidad se obtuvieron después de irradiar las muestras con 0,5 Gy. El análisis estadístico se realizo con el programa SPSS 17,0; se normalizó la variable de BNMN mediante la transformación de log10, se llevo a cabo un análisis utilizando un modelo lineal general para ambos parámetros, así como regresiones lineales para evaluar la progresión de la IRC y el tiempo en HD, y se realizaron pruebas t para las comparaciones entre grupos. El nivel de significación estadística usado fue del 95%. Nuestros resultados indican que tanto la frecuencia de BNMN como la radiosensibilidad son mayores en los pacientes con IRC que en los controles. La frecuencia de BNMN (daño basal) se asocia con la progresión de la IRC, sin embargo la radiosensibilidad no. La frecuencia de BNMN disminuye en pacientes que se encuentran bajo tratamiento con HD, sin embargo la radiosensibilidad no se ve afectada por el tratamiento con HD. Por lo tanto, se concluye que los pacientes con IRC poseen inestabilidad genómica. Así, el daño genómico presente en los pacientes con IRC es el resultado de dos factores, la acumulación de agentes genotóxicos como las EROS y los AGE que se correlacionan con la evolución de la patología, y la inestabilidad genómica, que no se correlaciona con el desarrollo de la misma. / Chronic renal failure (CRF) is a disease that is characterized by the progressive loss of renal function, with a glomerular filtration rate (GFR) lower than 60 mL/min 1,73 m2. In patients with CRF there is a high incidence of cardiovascular disease and cancer, which several authors attribute to a low DNA repair capacity, low antioxidant capacity, as well as to the evident accumulation of reactive oxygen species (ROS), advanced glication and lipoxidation end products (AGE/ALE). In this context the objectives of the present study are, to determine if in the patients with CRF the levels of genomic damage expressed as binucleated cells with micronuclei frequency (BNMN) in peripheral blood lymphocytes, are higher than the levels obtained in a control group, and if these patients show a special sensitivity to the effects of ionizing radiation. Furthermore, we pretend to evaluate if these parameters are related to the evolution of the disease and/or to the treatment with hemodialysis (HD). In the present work a population of 201 patients with CRF has been studied, from which 98 are under conventional HD, as well as a control population of 57 healthy subjects. From the HD patients, 33 where sampled for a second time after one year, to evaluate the effects of the HD treatment. The genomic damage biomarker that has been used is the frequency of micronucleus in peripheral blood lymphocytes, following the cytocalasin-B cytokinesis-block protocol. Radiosensitivity values where obtained after the irradiation of the samples with 0.5 Gy. The statistical analysis was carried out with the SPSS 17.0 program; the BNMN variable was normalized by log10, an analysis was done using a general lineal model for both parameters, lineal regressions where done to evaluate if the progression of the CRF and the effects of time in HD, and the student t test was used to compare between groups. The statistical significance level used was 95 %. Our results indicate that the basal BNMN as well as the radiosensitivity are higher in CRF patients than in controls. The BNMN frequency (basal damage) is associated to the progression of CRF, however the radiosensitivity is not. The BNMN frequency is lower in patients under HD, however the radiosensitivity doesn’t seem to be affected by the HD treatment. Therefore, CRF patients have a genomic instability. Then, the genomic damage present in CRF is the result of two factors, the accumulation of genotoxic agents like the ROS or the AGE that correlate to the evolution of the disease, and the genomic instability, that doesn’t correlate with the development of the disease.

Esta Tesis Doctoral se centra en la evaluación de los niveles de daño genómico en pacientes con insuficiencia renal crónica (IRC) y su relación con diferentes parámetros clínico-analíticos y el tratamiento sustitutivo. Se han estudiado un total de 364 pacientes de los cuales 121 sometidos a tratamiento de hemodiálisis (HD), 184 pacientes en diferentes estadios de insuficiencia renal que aún no se encuentran sometidos a terapia sustitutiva y 59 controles. Éstos pacientes constituyen una población con alta incidencia de diferentes patologías, como el cáncer y las patologías cardiovasculares que se relacionan con la inestabilidad genómica y también muestran elevados niveles de daño oxidativo, incluyendo daño en el DNA, posiblemente como consecuencia de una disminuida capacidad de reparar lesiones en el DNA. Los objetivos principales de este estudio fueron: 1) la evaluación del daño genómico en los pacientes con IRC mediante el ensayo del cometa (un ensayo con amplia aplicación en los estudios de biomonitorización de poblaciones, ensayos clínicos y en estudios de genotoxicidad). 2) la evaluación del daño oxidativo mediante el uso de enzimas de la familia de las enzimas reparadoras del DNA. 3) determinar posibles asociaciones entre los niveles de daño genómico y la evolución de la enfermedad renal. 4) comprobar cómo el tiempo en tratamiento de hemodiálisis y el cambio de la técnica de hemodiálisis influyen a los niveles de daño en el DNA. 5) comprobar la capacidad de reparar lesiones en el DNA de los pacientes sometidos a tratamiento sustitutivo, llevando a cabo un estudio de cinética de reparación. 6) estudiar la relación entre la mortalidad de los pacientes en hemodiálisis y los niveles de daño genómico. 7) identificar los factores involucrados en la génesis de la patología. En primer lugar, se evaluó el daño en el DNA de los pacientes con IRC y los controles. Posteriormente se realizó un estudio de cinética de reparación con 21 pacientes en tratamiento de HD. Los resultados de esta Tesis muestran que el daño en el DNA en los pacientes estudiados se encuentra significativamente elevado en comparación con los controles. El daño basal en el DNA aumenta con el desarrollo de la enfermedad y está negativamente relacionado con los valores del filtrado glomerular. Los niveles de daño oxidativo también se encuentran elevados en los pacientes con IRC en comparación con los controles. La elevada mortalidad en los pacientes con IRC en tratamiento de HD está relacionada con la elevada edad, con los niveles de la proteína C reactiva y con el tiempo en tratamiento sustitutivo. El tiempo en tratamiento de HD afecta a los niveles de daño en el DNA, así, los pacientes tratados por menos de un año muestran niveles de daño basal más bajos en comparación con los tratados por más de 3 años. Por otro lado el cambio de tratamiento de HD convencional a HD on-line resulta reducir significativamente el daño oxidativo, mientras que este cambio no se observa en los pacientes que han continuado sometidos a HD convencional. Las patologías presentes en la población estudiada, parecen no afectar a los niveles de daño en el DNA. Las diferencias en los niveles de daño en los pacientes en HD se deben a las diferencias en la capacidad de reparar y los pacientes con mayor tiempo en tratamiento de HD tienen mayor nivel de daño y menos capacidad de reparar. / This doctoral thesis focuses on evaluation the levels of genomic damage in patients with chronic renal failure (CRF) and its relationship with clinical and laboratory parameters and renal replacement therapy. We studied a total of 364 patients of whom 121 underwent hemodialysis (HD), 184 patients at different stages of kidney failure that are not yet subject to replacement therapy and 59 controls. These patients constitute a population with high incidence of various diseases such as cancer and cardiovascular diseases that are related to genomic instability and also show high levels of oxidative damage, including DNA damage, possibly due to a decreased ability to repair lesions in the DNA. The main objectives of this study were: 1) the assessment of genomic damage in patients with CKD using the comet assay (a test widely used in biomonitoring studies of populations, clinical trials and studies of genotoxicity). 2) the evaluation of oxidative damage using the enzymes from the family of DNA repair enzymes. 3) determine possible associations between the levels of genomic damage and renal disease progression. 4) determine how the time on hemodialysis and the change of the hemodialysis technique influence the levels of DNA damage. 5) test the ability to repair DNA damage in patients undergoing replacement therapy, conducted a study of kinetics of repair. 6) study the relationship between mortality of hemodialysis patients and the levels of genomic damage. 7) identify the factors involved in the genesis of the disease. First, we evaluated the DNA damage in patients with CRF and controls. Subsequently, a study of repair capacity with 21 patients on HD was performed. The results of this thesis show that the DNA damage in the patients studied is significantly higher compared with controls. The basal DNA damage increases with the development of the disease and is negatively related to the values of glomerular filtration rate. The levels of oxidative damage are also elevated in patients with CRF compared with controls. The high mortality in patients with CRF on HD treatment is associated with the high age, with levels of C-reactive protein and the replacement therapy. The HD treatment time affects the levels of DNA damage as well, patients treated for less than a year showed basal levels of damage lower compared with those treated for over 3 years. On the other hand, the change in treatment of conventional HD to HD on-line significantly reduces oxidative damage, while this change is not observed in patients who have continued to undergo conventional HD. The pathologies presented in the population, appear not to have an affect over the levels of DNA damage. Differences in damage levels in HD patients are due to differences in the ability to repair and patients with more time on treatment of HD have higher levels of damage and reduced repair capacity.

La exposición a xenobióticos durante el período prenatal puede tener implicaciones importantes sobre la salud del recién nacido, incidiendo en lo que puede ocurrir más adelante en su vida a nivel de ciertas enfermedades como asma, alérgias, retraso en el desarrollo neurológico, diabetes, enfermedades cardiovasculares y cáncer, entre otras. Por lo tanto, es necesario dotarnos de buenas herramientas para llevar a cabo análisis sistemáticos sobre el riesgo potencial en los niños, como consecuencia de estas exposiciones vía materna. El uso de biomarcadores de efecto genotóxico, evidencía los efectos tempranos de una sustancia tóxica sobre el material genético, siendo éste el primer paso de un variado conjunto de alteraciones de la salud. En nuestro estudio de biomonitorización, hemos utilizado el ensayo del cometa como biomarcador específico que nos permite evaluar los niveles de daño genético basal y oxidativo, así como la capacidad de reparación del DNA. Esto lo hemos podido aplicar a una población conformada por 200 parejas madres-hijos que fue reclutada entre Octubre de 2008 y Marzo de 2010 en el Hospital del Mar de Barcelona. Dado que los efectos de las exposiciones endógenas/exógenas a agentes genotóxicos, pueden verse modulados por la nutrición durante la fase de embarazo, en nuestro trabajo se han utilizado los patrones dietéticos de las madres durante el embarazo para evaluar los alimentos ingeridos en la dieta, y estimar su posible papel modulador. Además, hemos considerado a la dieta como un vehículo para ingerir distintos contaminantes ambientales con potencialidad genotóxica. Los resultados indican que los niveles del daño genético basal, los niveles de oxidación del DNA (purinas y pirimidinas oxidadas), al igual que la capacidad de reparación detectada en los linfocitos de cordón umbilical de los hijos, se encuentran correlacionados con los niveles de estos parámetros en los linfocitos de sangre de sus madres. La asociación positiva observada entre el daño genotóxico en el DNA de los linfocitos del cordón umbilical y el de las madres, sugiere la existencia de intercambios transplacentarios de los agentes involucrados en la inducción de lesiones en el DNA. Por otra parte, el ensayo del cometa es capaz de detectar alteraciones en el DNA causadas por la exposición endógena y/o exógena a compuestos genotóxicos o como resultado de la interacción con algunos factores como la edad, el indice de masa corporal, los micronutrientes, la temporada del parto, el género y otros factores ambientales. En este estudio, se ha demostrado también que los recién nacidos de mujeres expuestas a contaminantes potencialmente inductores de estrés oxidativo no presentan un mayor nivel de daño oxidativo en su DNA. Por último, los datos apoyan la hipótesis de que la exposición materna y los intercambios transplacentarios son eventos biológicos medibles y sus efectos se pueden detectar en el cordón umbilical, demostrando una posible exposición in utero. La falta de resultados que nos indiquen una asociación entre la ingesta de estos compuestos y la aparición de efectos genotóxicos, nos indican que se necesitan más estudios sobre cómo el consumo de alimentos ricos en estos contaminantes y/o sus precursores podrían relacionarse con el riesgo de efectos genotóxicos y sus consecuencias en el recién nacido. / Fetal exposure to xenobiotic agents during prenatal period may have important implications on the health of newborns, as well as adverse health diseases later in child life, such as asthma, allergies, neurologic impairment, diabetes, cardiovascular diseases and cancer, among others. Therefore, it is necessary to develop and use sensitive tools to carry out a systematic analysis of the potential risk in children resulting from exposures to genotoxic agents through the mother. A cross-sectional study of 200 voluntary and healthy pregnant women, at the Hospital del Mar in Barcelona, was performed. Biological samples were obtained from 2008 to 2010. In our study, we have used the comet assay as a biomarker of effect, allowing to assess the level of basal and DNA oxidative damage by incorporating lesion-specific bacterial DNA repair enzymes, such as formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) and endonuclease III (EndoIII), as well as to evaluate DNA repair capacity in mothers-newborns lymphocytes. Since the effect of exposure to hazardous environmental agents may be modified by diet during the pregnancy, in our work we used the dietary patterns of these mothers to assess food intake during pregnancy and their possible modulating effect. We have also considered dietary intake as a vehicle for exposure to various environmental pollutants potentially genotoxic. The results of this study indicated that the levels of basal damage, oxidative damage (oxidized purines and pyrimidines), and repair capacity measured in mothers and children are correlated. These positive associations may indicate transplacental exchange of agents involved in the induction of DNA lesions. So, the comet assay can detect DNA alterations caused by exposure to endogenous and/or exogenous genotoxic compounds, as well as interaction with factors such as age, body mass index, micronutrients, season of birth, gender and other environmental factors. In this study, we have also shown that infants born from women exposed to contaminants that may induce potentially oxidative stress, does not present higher level of oxidative damage in DNA. Finally, our data support the hypothesis that maternal exposure and transplacental exchanges are biological events measurable, and they can be detected in the umbilical cord, indicating a possible exposure in utero. The lack of results indicating an association between intake of these genotoxics compounds and the occurrence of genotoxic effects, lead us to suggest that further studies are necessary to show how the consumption of foods with high content of contaminants and/or their precursors can be related to increased risk of genotoxic effects in the newborns.

El cáncer es una patología compleja, con respecto a su génesis, donde participan factores tanto ambientales, como genéticos y epigenéticos; sin embargo, se conoce que los mecanismos de reparación tienen una gran influencia sobre su desarrollo debido a su implicación en el mantenimiento de la integridad del genoma, característica que se pierde en varios tipos de cánceres. Es por este motivo que nuestro grupo viene trabajando en la búsqueda de factores genéticos que puedan suponer un riesgo para el desarrollo de cáncer de tiroides. Existe un vínculo crítico entre la capacidad individual de reparar el daño en el DNA y el desarrollo y progresión de cáncer, así como con la respuesta frente a la terapia contra esta enfermedad. En este estudio se ha evaluado el posible riesgo que supone la presencia de cinco polimorfismos en genes de reparación [OGG1 (rs1052133) y XRCC1 (rs25487, rs25489), involucrados en la vía de reparación por escisión de bases; y de XRCC2 (rs3218536) y XRCC3 (rs1799796) involucrados en la vía de reparación por recombinación homóloga] sobre el desarrollo de cáncer de tiroides. También se ha evaluado la sensibilidad a la radiación ionizante en un grupo de pacientes que desarrollaron cáncer de tiroides, así como la posible influencia de los polimorfismos citados anteriormente sobre los niveles de daño en el DNA. Adicionalmente, siguiendo el mismo modelo de análisis para los genes de reparación, también se han evaluados tres polimorfismos del gen WDR3 (rs3754127, rs3765501, rs4658973) para conocer su influencia sobre los niveles de daño en el DNA, debido a que nuestro grupo ha encontrado recientemente una asociación entre este gen y el riesgo de desarrollar cáncer de tiroides papilar. Así, se ha encontrado que la presencia de la variante A del polimorfismo rs25489 del gen XRCC1 supone un incremento de riesgo para el desarrollo de cáncer de tiroides en la población española. Con respecto a la sensibilidad a la radiación ionizante, no se han encontradodiferencias significativas entre un grupo de pacientes con cáncer de tiroides y un grupo control, cuando se induce un daño con radiación ionizante en linfocitos de sangre periférica en la etapa G0 del ciclo celular. Finalmente, se ha encontrado que los niveles de daño en el DNA, tanto basales como inducidos por radiación ionizante parecen estar influenciados por la presencia de las variantes menos frecuentes del polimorfismo rs1052133 del gen OGG1 y de los tres polimorfismos del gen WDR3. / Cancer is a complex disease with the involvement of environmental, genetic and epigenetic factors; however, it is known that repair mechanisms have a major influence on their development because of its involvement in maintaining genome integrity, characteristic which is lost in several types of cancers. This is the reason why our Group has been working in the search of genetic factors that may have a influence on the risk for the development of thyroid cancer. There is a critical relationship between the capacity to repair DNA damage and the development and progression of cancer, as well as with the response to the therapy used against this disease. In this study we evaluated the potential risk of five polymorphisms in repair genes [OGG1 (rs1052133) and XRCC1 (rs25487, rs25489), involved in base excision repair pathway, and XRCC2 (rs3218536) and XRCC3 (rs1799796) involved in homologous recombination repair pathway] on the development of thyroid cancer. We also assessed the sensitivity to ionizing radiation in a subgroup of patients of thyroid cancer and the possible influence of the polymorphisms mentioned above on the levels of DNA damage. Since our Group has reported an association between the WDR3 gene and the risk of developing papillary thyroid cancer, additionally and following the same model of analysis used for the repair genes, three WDR3 gene polymorphisms (rs3754127, rs3765501, rs4658973) were also evaluated to establish their influence on the levels of DNA damage. Thus, it was found that the presence of the A variant (rs25489) in XRCC1 gene is a genetic factor associated with an increased risk for developing thyroid cancer in the Spanish population. In spite of the sensitivity to ionizing radiation showed by thyroid cancer patients, no significant differences were found between patients with thyroid cancer and controls, when DNA damage was induced by ionizing radiation in peripheral blood lymphocytes in the G0 phase of the cell cycle. Finally, we found that the levels of DNA damage, both basal and induced by ionizing radiation appear to be significantly influenced by the presence of variants of the assayed polymorphisms rs1052133 (OGG1) and rs3754127, rs3765501, rs4658973 (WDR3).

El arsénico inorgánico (i-As) es un metaloide tóxico que se encuentra en el medio ambiente y que afecta a millones de personas en todo el mundo. Se considera un compuesto carcinogénico siendo el hígado un órgano diana. Además de su efecto carcinogénico, está relacionado con un aumento de la prevalencia de la diabetes. Los factores nucleares 1 y 4 α (HNF1α y HNF4α) son miembros clave de la red de transcripción esencial para el mantenimiento de la arquitectura del hígado. Los cambios en la expresión de HNF1α y HNF4α están claramente asociados con el desarrollo de cáncer de hígado y de diabetes en humanos. En este trabajo, la línea celular hepática HepG2 y los hámsteres Golden Syrian han sido expuestos a dosis subtóxicas de arsenito sódico, dosis medioambientalmente relevantes (inferiores a 10 µM in vitro y de 15 mg/L in vivo) con la finalidad de evaluar si el arsénico es capaz de comprometer la expresión de los factores nucleares hepáticos (HNFs). También, como medida de los efectos inducidos por el i-As se ha estudiado in vitro la expresión de varios marcadores de diferenciación hepática y el estado de metabolización de la glucosa. Los resultados muestran una disminución de la expresión de HNF1α y HNF4α cuando la línea celular HepG2 se expone al arsénico, momento en el que se observa: (i) adquisición de resistencia a la toxicidad/apoptosis, (ii) pérdida de las características específicas de tejido (disminución de la expresión de ALDOB, PEPCK y CYP1A2, inducción de la transición epitelio-mesenquima (EMT) y la hipersecreción de metaloproteinasas de matriz 2 y 9), (iii) fallo del mantenimiento del balance del programa de auto-renovación (desregulación de C-MYC, OCT3/4, LIN28 y NOTCH2) y (iv) desregulación del metabolismo de la glucosa. Concluimos que la disminución de la expresión de HNF1α y HNF4α inducida por el i-As bajo un escenario de exposición crónica puede jugar un papel central en el efecto del arsénico en el cáncer de hígado y en la diabetes. / Inorganic arsenic (i-As) is a naturally occurring toxic metalloid affecting millions of people world-wide. It is known to be carcinogen, liver being an important target, and related to the prevalence of diabetes in arseniasis-endemic areas. Hepatocyte nuclear factor 1 and 4 alpha (HNF1α and HNF4α) are key members of a transcriptional network essential for normal liver architecture. Changes in HNF1α and HNF4α expression are clearly associated with the development of liver malignancies and diabetes in humans. In this work, hepatic HepG2 cells and Golden Syrian hamsters were exposed to sub-toxic, environmentally relevant doses of sodium arsenite (SA; up to 10 µM in vitro, 15 mg/L in vivo) in order to evaluate whether arsenic is able to compromise the expression of hepatocyte nuclear factors (HNFs). Also, several markers of hepatocyte differentiation and glucose metabolism status were determined in vitro as a measure of i-As-induced effects. Results show a consistent down-regulation of HNF1α and HNF4α under an scenario of exposure where HepG2 cells (i) gained resistance to arsenic-induced toxicity/apoptosis, (ii) attained loss of tissue specific features (as shown by the observed downregulation of ALDOB, PEPCK and CYP1A2, the triggering of the epithelial-to-mesenchymal transition program (EMT) and the hypersecretion of matrix metalloproteinase-2 and 9), (iii) failed to maintain balanced their self-renewal program (as shown by the observed deregulation of C-MYC, OCT3/4, LIN28 and NOTCH2) and (iv) showed glucose metabolism impairment. We conclude that the i-As-induced down-regulation of HNF1α and HNF4α under chronic settings may play a central role in the observed features of disease and cancer.

The Prunus genus belongs to the Rosaceae family and includes stone fruit crops such as peach (P. persica), apricot (P. armeniaca), European plum (P. domestica), Japanese plum (P. salicina), sweet cherry (P. avium) and sour cherry (P. cerasus), as well as almond (P. dulcis), a species cultivated for its seeds. This work aims to develop simple-sequence repeat (SSR) or microsatellite markers in almond and Japanese plum, the only two diploid Prunus species lacking these markers when this thesis began, and to study their variability in a collection of cultivars of each species. In addition, we studied the transferability of the microsatellites obtained from Prunus in other cultivated rosaceous species, including six Prunus species, and three other genus: apple (Malus x domestica), pear (Pyrus comunis) and octoploid strawberry (Fragaria x ananassa). To develop new microsatellite markers, we used two methods: one from enriched DNA genomic library (for sequences CT/AG), for which we obtained 31 SSRs in almond and 27 in Japanese plum, and another using the available sequences of ESTs (expressed sequence tags) of almond (22 SSRs) and peach (25 SSRs). All these microsatellites were polymorphic in a set of eight cultivars of their respective species. We used the obtained markers in an extensive collection of almond varieties (30) to study their genetic variability using 47 microsatellites derived from this species (25 genomic and 22 derived from ESTs). A similar study was conducted in 38 varieties of Japanese plum with 27 genomic SSRs obtained in this species. These markers were highly variable in both species, with an average of 7.3 alleles per locus in almond and 7.2 in Japanese plum, allowing us to distinguish individually all the studied genotypes. Our data indicated that the SSRs of the same species are more variable than those developed in other related species. In addition, in almond we found that the microsatellites derived from ESTs, and particularly those located in coding regions, were less variable than those obtained from genomic sequence. The grouping of the studied varieties in function of their genetic distance (dendrogram) or their population structure was quite similar both in almond and Japanese plum. The almond varieties were grouped by their geographical origin and their flowering time, whereas the Japanese plum varieties, of recent origin and largely developed in the United States, were clustered according to the breeding programs of the different States they were obtained. A total of 145 Prunus SSRs [25 genomic from almond, peach and Japanese plum, 25 ESTs derived from peach, 22 ESTs derived from almond and 23 derived from apricot (10 genomic and 13 from ESTs)] were chosen to study transferability, all polymorphic and identifying a single locus in the origin species. These microsatellites were studied in eight varieties of the following nine species: almond, peach, European plum, Japanese plum, apricot, sweet cherry, apple, pear and strawberry. Eighty-three percent (83%) of these markers amplified bands of the expected size in the other Prunus species and 63.9% were polymorphic, indicating the high transferability within this genus. This transferability decreased as the genetic distance between the species origin of the SSR and the studied species increased. Thus, only 16.3% of the tested SSRs were transferable to species of other rosaceous genera (apple, pear and strawberry). No significant differences were detected between microsatellites of different origins (genomic and ESTs) regarding their transferability, nor their capacity to detect variability. From the studied SSRs, 31 amplified and were polymorphic in all tested Prunus species. Twelve, selected to cover the whole genome, were proposed as the universal set for the analysis of variability in Prunus.