Les souches Lactobacillus rhamnosus RW-9595M et ATCC 9595 possèdent 17 cadres de lecture ouverts (ORF) identiques à 99 % identifiés comme gènes de biosynthèse putatifs des EPS. Par contre, les quantités produites diffèrent avec 543 mg l-1 pour RW-9595M et 108 mg l-1 pour ATCC 9595. La phosphorylation réversible a été proposée comme mécanisme pour réguler la polymérisation des EPS chez les bactéries lactiques. Parmi les protéines participant à la polymérisation, on propose la tyrosine kinase, la tyrosine phosphatase et la co-polymérase. Cette étude cherche à démontrer l’impact de la phosphorylation de ces protéines, surtout la co-polymérase (Wzd), sur le complexe de ces protéines chez L. rhamnosus. Afin de tester l’effet de la phosphorylation sur leurs interactions, Wzd (co-polymérase) et Wze (kinase) ont été exprimées chez L. lactis ou chez E. coli. Chez L. lactis ssp. cremoris, certaines combinaisons de gènes peuvent être associées à la production d'EPS in vivo. Chez E. coli, l'expression des gènes peut être contrôlée, permettant d'exprimer et de purifier des protéines dans le but d'effectuer l'étude de leurs interactions in vitro. Les clones de la souche L. lactis ssp. cremoris MG1363 (naturellement non productrice d’EPS) transformée avec l’opéron EPS de RW-9595M ou ATCC 9595 produisent respectivement 326 et 302 mg l-1, mais avec des rendements inférieurs à la production chez la souche d'origine RW-9595M. Lors des essais in vitro, Wzd et Wze ne s’autophosphorylent pas lorsqu'elles sont seules, mais ensemble elles forment un complexe. Le complexe entre ces deux protéines non phosphorylées permet la phosphorylation de Wzd par Wze en présence d’ATP. Wze est libérée par la déstabilisation de cette interaction suivant la phosphorylation. L’existence de Wzd phosphorylée et de l’ATP conduit à l’auto-phosphorylation de Wze par une interaction transitoire. De plus, l’activité de Wzd est modulée par la phosphorylation des tyrosines en permettant l’autophosphorylation de Wze. Or, la phosphorylation de Wzd peut être une étape de phosphorylation réversible pour la polymérisation des EPS. Cette étude contribue à la compréhension de la relation entre les caractéristiques et les fonctions biologiques des polymères d'EPS. / Lactobacillus rhamnosus RW-9595M and ATCC 9595 have 99 % identical 17 open reading frames (ORFs) identified as putative genes coding for EPS biosynthesis and both strains produce very different EPS amounts: 543 mg l-1 (RW-9595M) and 108 mg l-1 (ATCC 9595). Reversible phosphorylation has been proposed as a mechanism to regulate the polymerization of EPS in lactic acid bacteria and three proteins, tyrosine kinase, tyrosine phosphatase and co-polymerase are proposed to be responsible for this regulation. The aim of this project was to demonstrate the impact of the phosphorylation of these proteins, especially the co-polymerase (Wzd), on the protein complex for EPS polymerization in L. rhamnosus. To test the effect of phosphorylation on their interactions, Wzd and Wze were expressed in L. lactis subsp. cremoris and E. coli. In L. lactis subsp. cremoris, the presence of certain combinations of genes can be associated with EPS production yields. In E. coli, gene expression can be controled and the proteins purified in order to study their interactions and phosphorylation state in vitro. Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363, a non EPS-producing strain, was transformed with two recombinant plasmids coding for the genes required for EPS synthesis. These transformants with operons from either RW-9595M or ATCC 9595 produce 326 and 302 mg l-1 respectively, with lower yields than RW-9595M. The proteins encoded by wzd and wze are respectively the co-polymerase and the kinase which theoretically participate in determining the chain length of the EPS. These two proteins do not autophosphorylate when they are alone, but together form a complex. The non-phosphorylated complex of two proteins allows the phosphorylation of Wzd by Wze, in the presence of ATP. This phosphorylation destabilizes the protein interaction with Wze. The transient interaction with phosphorylated Wzd leads to autophosphorylation of Wze in the presence of ATP. In addition, the activity of Wzd is modulated by tyrosine phosphorylation allowing autophosphorylation of Wze. Thus, the phosphorylation of Wzd may be an additional step of reversible phosphorylation for polymerization of EPS. This study may help advance our understanding of the relationship between the characteristics and biological functions of these polymers.

Les bifidobactéries sont des bactéries probiotiques exerçant différents effets bénéfiques sur la santé de l’hôte. Parmi les effets revendiqués, la modulation des différentes fonctions immunitaires demeure l’un des effets les plus intéressants. Plusieurs travaux sont rapportés dans la littérature sur les effets immunomodulateurs de certaines souches probiotiques. Cependant, les résultats sont parfois controversés et les mécanismes impliqués dans cet effet immunomodulateur sont encore très peu élucidés. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel immunomodulateur de certaines souches de bifidobactéries isolées à partir de fèces de bébé, et d’identifier les mécanismes moléculaires par lesquels ces bifidobactéries exercent leurs effets sur les différentes fonctions immunitaires. Trois souches de bifidobactéries d’origine fécale productrices d’exopolysaccharides (B. thermoacidophilum RBL81, RBL82 et RBL64), une souche de Bifidobacterium lactis Bb12 et des souches ATCC (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B. pseudolongum) ont été utilisées. Les résultats obtenus montrent que la paroi cellulaire induit la plus forte stimulation de la prolifération cellulaire (splénocytes), accompagnée d’une forte production de IFN-γ et d’une augmentation de la sécrétion de IL-10. Une stimulation des fonctions immunitaires a également été observée avec le contenu cytoplasmique mais à un niveau moindre par rapport à la paroi. Par contre, les exopolysaccharides bruts ou fractionnés n’ont induit aucun effet. Une étude plus approfondie utilisant B. lactis Bb12 comme modèle a démontré que l’activité immunomodulatrice du contenu cytoplasmique est associée à la présence de peptides et/ou protéines acides, de poids moléculaire très variable et de faible hydrophobicité. Par ailleurs, le pouvoir immunogène de la paroi de bifidobactéries a été mise à profit pour produire des anticorps monoclonaux spécifiques capables de détecter les espèces du genre Bifidobacterium. Ces anticorps semblent être spécifiques à une protéine majeure d’environ 58 kDa de poids moléculaire (PM) commune à plusieurs bifidobactéries. Une fois purifiés, ces anticorps ont été utilisés pour développer un test d’immuno-culture original permettant la détection spécifique et sensible des bifidobactéries. / Bifidubaktiri d iprubyuteken (probiotiques) i yetwassnen atas assagi, yeεni ţ-ţibaktiryin mara twarnunt i tgulliyin ţţakent ayen yelhan i tdawsa. Tibaktiriyin agi zemrent ad snernint kra n tsuγnin yeţhuddun γef tfekka mgal atanan n uεebbud d izerman n bnadem. D acu kan, ar assa, ur nessin ara amek tibaktiriyin stanent tafekka. Iswi n usenfar agi d anelmud n unezmar n usnerni n ustan n bifidubaktiri. Ayagi i wakken a d-naf isemduyen n kra n tsegrin n tsiluliyin (cellules) am iferdisen (éléments) yellan daxel, s-ufella neγ i d-deggirent ar berra γef tririt n uhuddu. Krad (3) n ccetlat n bifidubaktiri id-yekkan seg izerman llufan ţwalmendent ţwasdemrent ar yiwet n ccetla tamselγut Bifidobacterium lactis Bb12. Agmuden i d-nessufeγ qqaren-d d akken asnerni yelhan n ufadi n tsiluliyin n udihan (rate) n amumad, i d- yettabaε unerni amuqran n IFN-γ yakw d usennerni n usufeγ (sécrétion) n IL-10, yefkaten-id ulesi n tsilulit (paroi cellulaire). Ayen yellan daxel n tsilulit d tazunin-ines (ipeptidiyen yak tiprutiniyin) snernayent drus γef ulesi. Ma d ayen yεenan EPS (exopolysaccharides) ulac asnnerni i d-yekkan segsen. Ma d tiprutiniyin n ulesi n bifidubakiri (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B. pseudolongum) banent-ed d timesnerniyin timuqranin n uhareb γef tfekka n umumad (Balb/c) ssutuyent afares amuqran n tfekkamgalin. Tifekkamgalin i d-yeffγen d yiwet n txellalt (IgG) mgal B. longum ţwafursent-ed s trennawet u sknent-ed tasedmirt tanmidagt (réaction croisée) yakw d ccetlat nniden n bifidubakiri. Anecta yekka-d seg yiwet n teprutint (protéine) tamsihart i yezzayen 58 kd. Tulmist n tfekkamgalin i d-yefursen yeţwasentem-ed s usadez (test) ibaw i d- yelummzen mi ţ-nerεed yakkw d cctali nniden n tbaktiriyin. Tufin n bifidubaktiri yeddren s tfekkamgalin i d-yedran yefursen yedra-d s usadez n immuno-culture. Tifekkamgalin tulmisin i-d yekkan seg yiwet n txellayt id-nessenfel zemrent ad ţwaqedcent i tifin n cctali n bfidobktiri di tgwellyin. / Probiotic bifidobacteria are known to have beneficial effects on host health. One of the interesting properties of these bacteria is their capacity to modulate the host immune function. However, the mechanisms by which the bifidobacteria influence the immune response are not well known. This project aimed to evaluate the immunodulatory potential of some bifidobacterial strains isolated from newborn feces. We tried to determine the cellular and molecular mechanisms involved in immune response induced by cytoplasmic content, cell wall and exopolysaccharides from bifidobacteria. Three exopolysaccharide-producing fecal strains of bifidobacteria (B. thermoacidophilum RBL81, RBL82, and RBL64) and a commercial available strain (Bifidobacterium lactis Bb12) were tested using mouse splenocytes. The results demonstrate that a high stimulation of cell proliferation and interferon-gamma (IFN-γ) production were induced by cell wall. In addition, a concomitant stimulation of interleukin-10 (IL-10) secretion was observed. The cytoplasmic content was also shown to be immunostimulating, but less than cell wall. However, the effects observed were dose or strain-species-dependent. B. lactis Bb12 was found to be significantly more immunostimulating than other bifidobacterial strains used. Partially fractionated peptides and acidic fraction from B. lactis Bb12 showed a low hydrophobicity and appeared heat stable and mitogenic. In contrast, no immunostimulating effects were induced by exopolysaccharides. The mitogenic properties of cell wall protein were then explored to develop specific monoclonal antibodies (Mab) able to detect bifidobacteria species in food. Common proteins were revealed in cell wall extracts from bifidobacteria (B. animalis, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum et B. pseudolongum). The proteins obtained were found to be immunonogenic in Balb/c mouse. Monoclonal antibodies (IgG) -anti-B. longum- produced cross-reacted with all bifidobacteria tested. The shared antigenicity shown by bifidobacteria was revealed by an epitope supported by a common protein of 58 kDa. This was confirmed by immune-transmission electron microscopy observation, which showed the specific interaction of these antibodies with bifidobacterial cell wall proteins. The Mab produced was also shown to be sensitive (105 cfu/ml) and specific to members of the bifidobacterial genus. The Mab developed allowed detection of viable cells of bifidobacteria using immuno-culture test.

Le microbiote intestinal est un écosystème complexe jouant un rôle très important dans la santé humaine. L’établissement du microbiote intestinal s’effectue dans la première année de vie. Afin de stimuler chez les enfants nourris avec des préparations infantiles les bifidobactéries et lactobacilles, les laits infantiles pourraient être supplémentés avec des probiotiques ou des prébiotiques. Cette supplémentation pourrait leur apporter une protection renforcée contre les troubles intestinaux, les infections et les risques allergiques. Les études in vivo chez les enfants étant difficiles à réaliser à cause de problèmes d’accessibilité et d’éthique, des outils permettant de faire des études in vitro ont été développés. Les systèmes de fermentation continu sont ceux qui se rapprochent le plus des conditions in vivo. Différents modèles ont été proposés, tous utilisent des bactéries fécales libres alors que la microflore bactérienne est présente à l’état planctonique et sessile dans le côlon. Peu de modèles in vitro ont été proposés pour simuler l’écosystème colique chez l’enfant. Le but de cette étude était donc de développer un nouveau modèle de fermentation colique avec cellules immobilisées pour simuler l’écosystème intestinal chez l’enfant. Nous avons montré qu’une microflore fécale pouvait être immobilisée et que sa diversité bactérienne était conservée au cours de la fermentation en continu. La composition et l’activité métabolique de la microflore bactérienne s’équilibraient en fonction des conditions de fermentation à des niveaux voisins de ceux observés in vivo chez l’enfant. Ensuite un modèle de fermentation en continu à trois réacteurs pour simuler le côlon proximal, distal et transverse chez l’enfant a été développé et validé. Ce nouveau modèle a ensuite permis de comparer les effets d’un prébiotique connu (fructooligosaccharide) et d’un exopolysaccharide produit par L. rhamnosus RW-9595M sur l’écosystème intestinal chez l’enfant. Le fructooligosaccharide testé influençait favorablement l’écosystème intestinal alors que l’exopolysaccharide n’était pas métabolisé par le microbiote intestinal chez les enfants. Ce nouveau modèle avec cellules immobilisées possède l’avantage d’obtenir une grande stabilité à la fois de la composition bactérienne et de l’activité métabolique de la microflore, faisant de ce nouveau modèle de fermentation colique un outil de travail pratique, fiable et facile à opérer. / The intestinal microbiota is a complex ecosystem playing a key role in human health. The intestinal microbiota establishment occurred during the first year of life. To stimulate bifidobacteria and lactobacilli in formula fed infants, infant formula could be supplemented with probiotics or prebiotics, food ingredient able to improve human health. This supplementation could provide to them a better protection against gastro-intestinal disorders, infections and allergic risks. In vivo studies are difficult to carry out in infants due to accessibility and ethic problems, then in vitro studies become important. Continuous fermentation systems display the closest conditions to those encountered in vivo. Different fermentation systems have been proposed, all are using free-cell cultures whereas in vivo bacteria are present in colon at planktonic and sessile states. To our knowledge only one in vitro model has been proposed to simulate infant colonic fermentation. The aim of this study was to develop a new in vitro system with immobilized cells to simulate infant colonic ecosystem. First a feasibility study was done, we showed that a complex fecal microflora could be immobilized and the inoculum bacterial diversity was conserved in the ecosystem established in the fermentation system. The bacterial composition and metabolic activities of the microbiota reached an equilibrium specific to the fermentation conditions tested. These equilibriums were closed to those detected in vivo in infant colon. Then a three-stage chemostat using immobilized fecal bacteria was developed and validate to simulate simultaneously, proximal, transverse and distal infant colon conditions. This last in vitro colonic fermentation model was used to compared the effect of a well-known prebiotic (fructooligosaccharide) with an exopolysaccharide produced by L. rhamnosus RW-9595M on the infant colonic microbiota. The fructooligosaccharide used beneficially influenced the bacterial ecosystem whereas exopolysaccharide substrate did not seem to be metabolized by infant colonic microbiota. The main advantage of this system with immobilized cells is the great stability of the bacterial composition and metabolic activities of the microflora established in the model. For this, the in vitro colonic fermentation system with immobilized cells is a very efficient tool, easy to operate and reliable.