<p>Vanlig tarmbakterie som Escherichia coli (E. coli) kan bland annat orsaka infektioner i bukhålan och urinvägsinfektioner. Infektioner orsakade av bakterien har ofta behandlats med betalaktamantibiotika, som penicilliner och cefalosporiner, vilket har resulterat i selektion av antibiotikaresistenta bakterier. Extended-Spectrum Beta-Lactamases (ESBL) är enzymer som hydrolyserar 3:e generationens cefalosporiner som cefotaxim, ceftazidim och ceftriaxon, men kan även bryta ner penicilliner, monobaktamer och övriga cefalosporiner. ESBL förekommer främst hos E. coli och Klebsiella pneumoniae. I början utgjordes ESBL-enzymerna av TEM och SHV, men idag är CTX-M den vanligaste ESBL-varianten. CTX-M genen finns i över 50 olika varianter, vilka delas in i fem subgrupper (CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 och CTX-M-25). Syfte med arbetet var att utföra en genotypisk bestämning av ESBL-producerande E. coli, som isolerats i Kronobergs län 2009, med hjälp av realtids-PCR (Polymerase Chain Reaction). För detektion av CTX-M användes multiplex-realtids-PCR med vilken de fem olika grupperna kunde detekteras under samma PCR-analys. Resultatet visade att den vanligaste ESBL-varianten bland ESBL-producerande E. coli i Kronobergs län 2009 var CTX-M-1 (88 positiva av 123), men ett stort antal var positiva både för CTX-M-1 och TEM (41 isolat). Den minst förekommande varianten visade sig vara SHV (2 isolat). En ökad antibiotikaresistens kan leda till svårigheter att behandla vissa vanliga infektioner som urinvägsinfektioner och infektioner efter bukoperationer. Med tanke på att E. coli är en vanlig tarmbakterie är det viktigt att motverka uppkomst och spridning av ESBL. En genotypisk karaktärisering av förekommande ESBL-stammar i Kronoberg är därför en viktig del av övervakningen<em>.</em></p>

Šio tyrimo tikslas palyginti diskų difuzijos ir automatizuotą metodus, nustatančius Enterobacteriaceae šeimos bakterijų plataus veikimo &#946;-laktamazių (PVBLazių) fenotipą ir įvertinti PVBLazių paplitimą Vilniaus universiteto ligoninės Santariškių klinikose 2008-2010 metais. Tyrimų analizei buvo pasirinkta 58 Enterobacteriaceae šeimos bakterijos, išskirtos 2009-2011 metais ligoniams, besigydžiusiems Vilniaus Universiteto ligoninės Santariškių klinikose. Bakterijos ištirtos naudojant fenotipinius PVBL nustatymo metodus: automatizuotą Phoenix sistemą (Becton Dickenson, Sparks, MD, JAV), kombinuotą diskų difuzijos metodą ir dvigubos difuzijos metodą. Automatizuota Phoenix sistema tyrime laikyta kaip patvirtinantis metodas identifikuojant bakterijas ir nustatant PVBLazių gamybos fenotipą. Tiriamąją grupę sudarė šios bakterijų rūšys: K. pneumoniae, E.coli, Enterobacter spp., Proteus spp., Serratia spp., Morganella spp. ir Providencia spp.. Ištyrus 58 bakterijas patvirtinačiu metodu nustatyta, kad 31 iš jų gamina plataus veikimo beta-laktamazes. Atliktas palyginamasis diskų difuzijos metodų įvertinimas ir nustatytas jautrumas, specifiškumas, teigiama prognostinė vertė (PPV) ir neigiama prognostinė vertė (NPV). Įvertinus atliktų tyrimų duomenis nustatyta, kad kombinuoto diskų difuzijos metodo jautrumas - 100%, specifiškumas - 100%, PPV - 100%, NPV - 100%. Dvigubos difuzijos metodo jautrumas - 100%, specifiškumas – 88,9%, PPV – 91,2%, NPV - 100%. Gauti tyrimų rezultatai rodo, jog... [toliau žr. visą tekstą] / The aim of this study is to compare disk diffusion and automated methods for determining the Enterobacteriaceae extended spectrum-&#946;-lactamases (ESBL) phenotype and to assess the prevalence of (ESBL) at University Hospital Clinics in 2008-2010. For the study were chosen 58 bacteria from the Enterobacteriaceae family that were isolated in 2009-2011 in patients that were treated at Vilnius University Hospital Clinic. The bacteria studied using phenotypic methods ESBL: Phoenix automated system (Becton Dickenson, Sparks, MD, USA) combined disc diffusion method and the double-diffusion method. Automated system of Phoenix for the study was considered as a method of confirming the identification of bacteria and determination of (ESBL) production phenotype. The studied group consisted of the following bacterial species: K. pneumoniae, E. coli, Enterobacter spp., Proteus spp., Serratia spp., Morganella spp. and Providencia spp . The examination with the validated method of 58 bacteria showed that 31 of them produce an extended spectrum beta lactamases. A performed comparative disc diffusion method was made and the evaluation of the sensitivity, specificity, positive prognostic value (PPV) and negative prognostic value (NPV) was identified. The evaluation of the data from studies showed that the combined disc diffusion method for sensitivity - 100% and specificity - 100%, PPV - 100%, NPV - 100%. Double-diffusion method for sensitivity - 100% and specificity - 88.9%, PPV - 91.2%... [to full text]

Vanlig tarmbakterie som Escherichia coli (E. coli) kan bland annat orsaka infektioner i bukhålan och urinvägsinfektioner. Infektioner orsakade av bakterien har ofta behandlats med betalaktamantibiotika, som penicilliner och cefalosporiner, vilket har resulterat i selektion av antibiotikaresistenta bakterier. Extended-Spectrum Beta-Lactamases (ESBL) är enzymer som hydrolyserar 3:e generationens cefalosporiner som cefotaxim, ceftazidim och ceftriaxon, men kan även bryta ner penicilliner, monobaktamer och övriga cefalosporiner. ESBL förekommer främst hos E. coli och Klebsiella pneumoniae. I början utgjordes ESBL-enzymerna av TEM och SHV, men idag är CTX-M den vanligaste ESBL-varianten. CTX-M genen finns i över 50 olika varianter, vilka delas in i fem subgrupper (CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 och CTX-M-25). Syfte med arbetet var att utföra en genotypisk bestämning av ESBL-producerande E. coli, som isolerats i Kronobergs län 2009, med hjälp av realtids-PCR (Polymerase Chain Reaction). För detektion av CTX-M användes multiplex-realtids-PCR med vilken de fem olika grupperna kunde detekteras under samma PCR-analys. Resultatet visade att den vanligaste ESBL-varianten bland ESBL-producerande E. coli i Kronobergs län 2009 var CTX-M-1 (88 positiva av 123), men ett stort antal var positiva både för CTX-M-1 och TEM (41 isolat). Den minst förekommande varianten visade sig vara SHV (2 isolat). En ökad antibiotikaresistens kan leda till svårigheter att behandla vissa vanliga infektioner som urinvägsinfektioner och infektioner efter bukoperationer. Med tanke på att E. coli är en vanlig tarmbakterie är det viktigt att motverka uppkomst och spridning av ESBL. En genotypisk karaktärisering av förekommande ESBL-stammar i Kronoberg är därför en viktig del av övervakningen.

Objetivos: Avaliar o perfil de suscetibilidade, a prevalência da produção de AmpC, β-lactamase de espectro estendido (ESBL) e Metalo-β-lactamase (M-βla) em Pseudomonas aeruginosa obtidas de dois hospitais universitários distintos (ISCMPA e HCPA) em Porto Alegre. Em adição, tipagem molecular por PFGE foi realizada entre os isolados produtores de M-βla para avaliar a relação clonal. Métodos: Foi determinada a suscetibilidade de 238 isolados de P. aeruginosa para 8 agentes antimicrobianos, através do teste de disco-difusão, usando agar Müller-Hinton (MH) de acordo com “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS) . Todos isolados foram avaliados para produção de AmpC com o disco de imipenem (indutor) próximo ao disco de cefepima/ceftazdima (substrato). Um achatamento no halo de cefepime/ceftazidima pela indução da enzima pelo imipenem, indicava resultado positivo para AmpC. Todos isolados forma avaliados para a presença de ESBL através do teste de aproximação de disco com ceftazidima, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona e ticarcilina-clavulanato como inibidor de β-lactamase. A produção de M-βla foi determinada através do teste de aproximação de discos de CAZ a discos impregnados com ácido2-mercatopropiônico (2-MPA). As taxas de resistência foram comparadas através do Teste Exato de Fisher. Valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Análise de macrorestrição com a enzima speI foi realizada em isolados produtores de M-βla. Resultados: As taxas de resistência para todos os agentes foram superiores entre os isolados obtidos na ISCMPA em relação aos do HCPA. A ceftazidima mostrou ser o antibiótico mais efetivo contra os isolados de ambos Hospitais (ISCMPA e HCPA) com taxa de resistência de 25,7% (ISCMPA) e 6,1% (HCPA). A expressão de AmpC foi observada em 190 isolados (83,7% HCPA e 77,1% ISCMPA). Não foi possível detectar a presença de ESBL entre todos as P. aeruginosa avaliadas em ambos hospitais. Foi observada a presença de M-βla em 28 isolados (20,0%) da ISCMPA. Mas não foi detectada M-βla em nenhuma P. aeruginosa do HCPA. A análise de macrorestrição mostrou que 14 de 16 P. aeruginosa Mβla positivas pertenciam a um clone (denominado clone A), e seus subclones. Apenas dois outros clones (B e C) foram identificados em um isolado cada. / Objectives: To evaluate susceptibility profile, the prevalence of extendedspectrum β-lactamases (ESBL) production, AmpC and Metallo-β-lactamases (M-βla) in Pseudomonas aeruginosa obtained from two distinct hospitals (ISCMPA and HCPA) in Porto Alegre, Brazil. In addiction, molecular typing by PFGE was perfomed among isolates producing M-βla in order to evaluate probably clonal relatedness. Methods: The susceptibility of 238 P. aeruginosa to 8 antimicrobial agents was determined by the disk diffusion method, using Müller-Hinton agar (MH) in accordance with “National Committee for Clinical Laboratory Standards” guidelines. All isolates were evaluated for AmpC production with the imipenem disk (strong inducer) near of the cefepime/ceftazidime disk (substrate). A blunting of the cefepime/ceftazidime zone by imipenem-induced enzyme, indicated positive result for AmpC. All isolates were evaluated for ESBL production by disk approximation test with ceftazdime, cefepime, cefotaxime, ceftriaxone plus ticarcillin-clavulanate as inhibitor. M-βla production was determined by disk approximation test with disks containing CAZ and 2-mercatopropionic acid (2-MPA). The results were compared by the Fisher’s Exact Test. Macrorestriction analysis by SpeI, followed by PFGE, was perfomed in isolates M-βla positive. The resistance rates were compared by The Fisher’s Exact Test. P values < 0.05 were considered to be statistically significant. Results: The resistance rates to all antimicrobial agents were higher among isolates obtained from ISCMPA than those obtained from HCPA. The ceftazidime was the more active antibiotic against the isolates in both hospitals with resistance rates of 25,7% (ISCMPA) and 6,1% (HCPA). The derepression of AmpC was observed in 190 isolates (83,7% HCPA and 77,1% ISCMPA). It was not possible to detect the presence of ESBL among all P. aeruginosa evaluated in both hospitals. Positive results for M-βla production were observed in 28 isolates (20,0%) from ISCMPA. But none M-βla production was identified in P. aeruginosa from HCPA. The macrorestriction analysis by PFGE, showed that 14 of 16 M-βla positive P. aeruginosa beloneed to one clone (named clone A) and its subclones.Only two others clones (B and C) were identified in one isolate each.

No description available.

The prevalence of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae producing extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) and carbapenemases is increasing worldwide. Therapeutic options for infections with these bacteria are limited not only by the production of ESBLs and carbapenemases, which confer resistance to cephalosporins and carbapenems, but also by frequent co-resistance to other antibiotics. The overall aim of this thesis was to obtain a better understanding of multidrug-resistant E. coli and K. pneumoniae in relation to epidemiology, selection and susceptibility to antibiotic therapy. In a prospective study ESBL-producing E. coli was found to spread easily through international travel. Twenty-four of 100 Swedes travelling outside Northern Europe acquired ESBL-producing E. coli in the intestinal flora. The risk was highest for travelers visiting India and those suffering from gastroenteritis during travel. To minimize selection of ESBL-producing K. pneumoniae during a hospital outbreak with these bacteria, an educational antibiotic intervention was performed at Uppsala University Hospital in 2006. The primary aim of the intervention was to reduce the consumption of parenteral cephalosporins. An immediate and radical reduction of cephalosporins was demonstrated with interrupted time series analysis. The outbreak declined during 2007 and no increased resistance to replacement antibiotics was detected. The impact of ESBL production on the antibacterial activity of ertapenem was studied in time-kill experiments. It was shown that porin-deficient subpopulations with reduced susceptibility to ertapenem frequently emerged in ESBL-producing E. coli during exposure to ertapenem at concentrations simulating human pharmacokinetics. Further, the antibacterial effects of antibiotic combinations against four strains of K. pneumoniae producing carbapenemases of the metallo-beta-lactamase type were studied in time-kill experiments. Double and triple combinations of aztreonam, fosfomycin, meropenem, rifampin and colistin at clinically relevant static concentrations were effective despite that the bacteria were frequently resistant to the individual drugs. These results indicate that there is a largely unexplored potential of antibiotic combination therapy for multidrug-resistant K. pneumoniae.

Objetivos: Avaliar o perfil de suscetibilidade, a prevalência da produção de AmpC, β-lactamase de espectro estendido (ESBL) e Metalo-β-lactamase (M-βla) em Pseudomonas aeruginosa obtidas de dois hospitais universitários distintos (ISCMPA e HCPA) em Porto Alegre. Em adição, tipagem molecular por PFGE foi realizada entre os isolados produtores de M-βla para avaliar a relação clonal. Métodos: Foi determinada a suscetibilidade de 238 isolados de P. aeruginosa para 8 agentes antimicrobianos, através do teste de disco-difusão, usando agar Müller-Hinton (MH) de acordo com “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS) . Todos isolados foram avaliados para produção de AmpC com o disco de imipenem (indutor) próximo ao disco de cefepima/ceftazdima (substrato). Um achatamento no halo de cefepime/ceftazidima pela indução da enzima pelo imipenem, indicava resultado positivo para AmpC. Todos isolados forma avaliados para a presença de ESBL através do teste de aproximação de disco com ceftazidima, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona e ticarcilina-clavulanato como inibidor de β-lactamase. A produção de M-βla foi determinada através do teste de aproximação de discos de CAZ a discos impregnados com ácido2-mercatopropiônico (2-MPA). As taxas de resistência foram comparadas através do Teste Exato de Fisher. Valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Análise de macrorestrição com a enzima speI foi realizada em isolados produtores de M-βla. Resultados: As taxas de resistência para todos os agentes foram superiores entre os isolados obtidos na ISCMPA em relação aos do HCPA. A ceftazidima mostrou ser o antibiótico mais efetivo contra os isolados de ambos Hospitais (ISCMPA e HCPA) com taxa de resistência de 25,7% (ISCMPA) e 6,1% (HCPA). A expressão de AmpC foi observada em 190 isolados (83,7% HCPA e 77,1% ISCMPA). Não foi possível detectar a presença de ESBL entre todos as P. aeruginosa avaliadas em ambos hospitais. Foi observada a presença de M-βla em 28 isolados (20,0%) da ISCMPA. Mas não foi detectada M-βla em nenhuma P. aeruginosa do HCPA. A análise de macrorestrição mostrou que 14 de 16 P. aeruginosa Mβla positivas pertenciam a um clone (denominado clone A), e seus subclones. Apenas dois outros clones (B e C) foram identificados em um isolado cada. / Objectives: To evaluate susceptibility profile, the prevalence of extendedspectrum β-lactamases (ESBL) production, AmpC and Metallo-β-lactamases (M-βla) in Pseudomonas aeruginosa obtained from two distinct hospitals (ISCMPA and HCPA) in Porto Alegre, Brazil. In addiction, molecular typing by PFGE was perfomed among isolates producing M-βla in order to evaluate probably clonal relatedness. Methods: The susceptibility of 238 P. aeruginosa to 8 antimicrobial agents was determined by the disk diffusion method, using Müller-Hinton agar (MH) in accordance with “National Committee for Clinical Laboratory Standards” guidelines. All isolates were evaluated for AmpC production with the imipenem disk (strong inducer) near of the cefepime/ceftazidime disk (substrate). A blunting of the cefepime/ceftazidime zone by imipenem-induced enzyme, indicated positive result for AmpC. All isolates were evaluated for ESBL production by disk approximation test with ceftazdime, cefepime, cefotaxime, ceftriaxone plus ticarcillin-clavulanate as inhibitor. M-βla production was determined by disk approximation test with disks containing CAZ and 2-mercatopropionic acid (2-MPA). The results were compared by the Fisher’s Exact Test. Macrorestriction analysis by SpeI, followed by PFGE, was perfomed in isolates M-βla positive. The resistance rates were compared by The Fisher’s Exact Test. P values < 0.05 were considered to be statistically significant. Results: The resistance rates to all antimicrobial agents were higher among isolates obtained from ISCMPA than those obtained from HCPA. The ceftazidime was the more active antibiotic against the isolates in both hospitals with resistance rates of 25,7% (ISCMPA) and 6,1% (HCPA). The derepression of AmpC was observed in 190 isolates (83,7% HCPA and 77,1% ISCMPA). It was not possible to detect the presence of ESBL among all P. aeruginosa evaluated in both hospitals. Positive results for M-βla production were observed in 28 isolates (20,0%) from ISCMPA. But none M-βla production was identified in P. aeruginosa from HCPA. The macrorestriction analysis by PFGE, showed that 14 of 16 M-βla positive P. aeruginosa beloneed to one clone (named clone A) and its subclones.Only two others clones (B and C) were identified in one isolate each.

Resumo: A produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) em membros da família Enterobacteriaceae pode conferir resistência a cefalosporinas de amploespectro, aztreonam e penicilinas. Devido a esse fenômeno, a detecção exata dos produtores de ESBL é essencial para a seleção apropriada da antibioticoterapia. Para detectar a produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) em bacilos Gram-negativos, foi usado um teste de triagem com os discos de aztreonam (ATM), ceftazidima (CAZ), cefotaxima (CTX) e ceftriaxona (CRO) sobre 300 cepas, das quais trinta e cinco eram suspeitas da presença de ESBL. A produção de ESBL foi demonstrada por três métodos fenotípicos confirmatórios de fácil utilização. Os três testes fenotípicos para confirmar a produção de ESBL incluíram o teste do sinergismo (double disk), E-test? ESBL e disco combinado. Os discos utilizados no teste do sinergismo e do disco combinado foram: aztreonam (30?g-ATM), cefotaxima (30?g-CTX), ceftazidima (30?g-CAZ), cefpodoxima (10?g-CPD) ceftriaxone (30?g-CRO) e amoxicilina+ácido clavulânico(30?g-AMC), cefotaxima+ácido clavulânico (30?g-10?g), ceftazidima+ácido clavulânico (30?g- 10?g), cefpodoxima+ácido clavulânico (10?g-1? g). Para E-test foram utilizadas fitas contendo as cefalosporinas: ceftazidima versus ceftazidima/ácido clavulânico; cefotaxima versus cefotaxima/ácido clavulânico. Os testes fenotípicos confirmaram a presença de ESBL em cinco cepas de enterobactérias (1,66%). Todos os métodos são de fácil execução, contudo o método do Etest requer experiência para interpretar os resultados. Os três testes oferecem uma solução viável para confirmar a produção de ESBL no laboratório clínico. / Abstract: The production of extended spectrum beta-lactamase (ESBL) in the members of the family Enterobacteriaceae can check resistance to cephalosporins of extended-spectrum, aztreonam and penicilins. Due to this phenomenon, the exact detection of the producers of ESBL are essential for the appropriate selection of antimicrobial therapy. To detect the production of extended spectrum beta-lactamase (ESBL) in Gram-negative bacilli, a test of screening was used with the discs of aztreonam (ATM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX) e ceftriaxone (CRO) in 300 strains, of which thirty-five were suspicious of the presence of ESBL. The production of ESBL was demonstrated by three phenotypic methods confirmed of easy utilization. The three phenotypic tests to confirm the production of ESBL included the test of sinergy (double disk), E-test? ESBL and combination disk. The disks used on the test sinergy and the combination disk were: aztreonam (30?g-ATM), cefotaxime (30?g-CTX), ceftazidime (30?g-CAZ), cefpodoxime (10?g-CPD) ceftriaxone (30?g- CRO) e amoxicillin+clavulanic acid (30?g-AMC), cefotaxime+clavulanic acid (30?g- 10? g), ceftazidime+clavulanic acid (30?g-10? g), cefpodoxime+clavulanic acid (10?g- 1? g). For E-test, were utilized strips containing the cephalosporins: ceftazidime and ceftazidime/clavulanic acid; cefotaxime and cefotaxime/clavulanic acid. The phenotypic tests confirmed the presence of ESBL in five strains Enterobacteriaceae (1,66%). All of the methods are of easy execution; however, the method of Etest requires experiment to interpret the results. The three tests offer a viable solution to confirm the production of ESBL on a clinic laboratory. / Orientador: Elisabeth Loshchagin Pizzolitto / Coorientador: Antonio Carlos Pizzolitto / Banca: Wilton Rogério Lustri / Banca: Izabel Yoko Ito / Mestre

Objetivos: Avaliar o perfil de suscetibilidade, a prevalência da produção de AmpC, β-lactamase de espectro estendido (ESBL) e Metalo-β-lactamase (M-βla) em Pseudomonas aeruginosa obtidas de dois hospitais universitários distintos (ISCMPA e HCPA) em Porto Alegre. Em adição, tipagem molecular por PFGE foi realizada entre os isolados produtores de M-βla para avaliar a relação clonal. Métodos: Foi determinada a suscetibilidade de 238 isolados de P. aeruginosa para 8 agentes antimicrobianos, através do teste de disco-difusão, usando agar Müller-Hinton (MH) de acordo com “National Committee for Clinical Laboratory Standards” (NCCLS) . Todos isolados foram avaliados para produção de AmpC com o disco de imipenem (indutor) próximo ao disco de cefepima/ceftazdima (substrato). Um achatamento no halo de cefepime/ceftazidima pela indução da enzima pelo imipenem, indicava resultado positivo para AmpC. Todos isolados forma avaliados para a presença de ESBL através do teste de aproximação de disco com ceftazidima, cefepima, cefotaxima, ceftriaxona e ticarcilina-clavulanato como inibidor de β-lactamase. A produção de M-βla foi determinada através do teste de aproximação de discos de CAZ a discos impregnados com ácido2-mercatopropiônico (2-MPA). As taxas de resistência foram comparadas através do Teste Exato de Fisher. Valor de P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Análise de macrorestrição com a enzima speI foi realizada em isolados produtores de M-βla. Resultados: As taxas de resistência para todos os agentes foram superiores entre os isolados obtidos na ISCMPA em relação aos do HCPA. A ceftazidima mostrou ser o antibiótico mais efetivo contra os isolados de ambos Hospitais (ISCMPA e HCPA) com taxa de resistência de 25,7% (ISCMPA) e 6,1% (HCPA). A expressão de AmpC foi observada em 190 isolados (83,7% HCPA e 77,1% ISCMPA). Não foi possível detectar a presença de ESBL entre todos as P. aeruginosa avaliadas em ambos hospitais. Foi observada a presença de M-βla em 28 isolados (20,0%) da ISCMPA. Mas não foi detectada M-βla em nenhuma P. aeruginosa do HCPA. A análise de macrorestrição mostrou que 14 de 16 P. aeruginosa Mβla positivas pertenciam a um clone (denominado clone A), e seus subclones. Apenas dois outros clones (B e C) foram identificados em um isolado cada. / Objectives: To evaluate susceptibility profile, the prevalence of extendedspectrum β-lactamases (ESBL) production, AmpC and Metallo-β-lactamases (M-βla) in Pseudomonas aeruginosa obtained from two distinct hospitals (ISCMPA and HCPA) in Porto Alegre, Brazil. In addiction, molecular typing by PFGE was perfomed among isolates producing M-βla in order to evaluate probably clonal relatedness. Methods: The susceptibility of 238 P. aeruginosa to 8 antimicrobial agents was determined by the disk diffusion method, using Müller-Hinton agar (MH) in accordance with “National Committee for Clinical Laboratory Standards” guidelines. All isolates were evaluated for AmpC production with the imipenem disk (strong inducer) near of the cefepime/ceftazidime disk (substrate). A blunting of the cefepime/ceftazidime zone by imipenem-induced enzyme, indicated positive result for AmpC. All isolates were evaluated for ESBL production by disk approximation test with ceftazdime, cefepime, cefotaxime, ceftriaxone plus ticarcillin-clavulanate as inhibitor. M-βla production was determined by disk approximation test with disks containing CAZ and 2-mercatopropionic acid (2-MPA). The results were compared by the Fisher’s Exact Test. Macrorestriction analysis by SpeI, followed by PFGE, was perfomed in isolates M-βla positive. The resistance rates were compared by The Fisher’s Exact Test. P values < 0.05 were considered to be statistically significant. Results: The resistance rates to all antimicrobial agents were higher among isolates obtained from ISCMPA than those obtained from HCPA. The ceftazidime was the more active antibiotic against the isolates in both hospitals with resistance rates of 25,7% (ISCMPA) and 6,1% (HCPA). The derepression of AmpC was observed in 190 isolates (83,7% HCPA and 77,1% ISCMPA). It was not possible to detect the presence of ESBL among all P. aeruginosa evaluated in both hospitals. Positive results for M-βla production were observed in 28 isolates (20,0%) from ISCMPA. But none M-βla production was identified in P. aeruginosa from HCPA. The macrorestriction analysis by PFGE, showed that 14 of 16 M-βla positive P. aeruginosa beloneed to one clone (named clone A) and its subclones.Only two others clones (B and C) were identified in one isolate each.

Orientador: Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingos_DanielaFerreira_M.pdf: 1627311 bytes, checksum: ba7a6545a75d72a741bfe8d1cda234f4 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O número de animais de companhia tem crescido substancialmente na sociedade atual, com estimativas de 48 milhões de cães e gatos no Brasil. A relação entre animais de companhia e os humanos mudou radicalmente nos últimos anos, esses estão em contato mais próximo com humanos. Como consequência dessas mudanças, agentes antimicrobianos, incluindo antibióticos usados no tratamento de infecções humanas, tem sido utilizados em cães. O objetivo deste trabalho foi investigar fenotipicamente a ocorrência de ß-lactamase de espectro estendido (ESBL) em amostras de Escherichia coli isoladas de cães e identificar os genes de resistência nestas amostras. A presença e variedade de integrons nas amostras de E. coli foi analisada. A classificação das amostras nos grupos filogenéticos A, B1, B2 e D também foram investigadas. Dentre 158 amostras de E. coli isoladas de cães sendo 51 de ITU (infecção do trato urinário), 52 de piometra e 55 de fezes de cães sadios, foram selecionadas 67 amostras que apresentavam pelo menos uma marca de resistência aos ß-lactâmicos. As amostras selecionadas: 41 isoladas de ITU, 20 isoladas de piometra e seis isoladas de fezes de animais sadios, foram submetidas a testes de sensibilidade microbiana pelo método de difusão de disco. A produção de ESBL foi verificada pelo método de aproximação de disco. A identificação dos genes das ß-lactamases foi realizada em ensaios de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) com primers específicos para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaGES-1, blaOXA-10, ampC e cmy. A classificação filogenética (chuA, yjaA, TspE4.C2), bem como a detecção de integrons das classes 1 e 2 (intI1 e intI2) também foram realizadas por PCR. Os resultados dos antibiogramas mostraram elevada resistência aos ß-lactâmicos de 1ª geração, ampicilina (82,0%) e cefalexina (62,7%) entre as amostras selecionadas. Resistência aos antimicrobianos ß-lactâmicos de 3ª e 4ª geração e ao monobactam foi observada em 7,5% das amostras. As amostras também apresentaram resistência aos antimicrobianos tetraciclina (82,0%), trimetoprim-sulfametoxazol (62,7%), enrofloxacina (35,8%), florfenicol (34,3%) e ciprofloxacina (32,3%). A expressão fenotípica de ESBL foi observada em duas amostras (3,3%), ambas isoladas de animais sadios. Na análise genotípica, foram identificados os genes blaTEM, (98,5%), ampC (95,5%), blaCTX-M (35,8%), blaSHV (6%) e cmy (2,9%) destacando que os genes blaCTX-M, blaSHV e cmy apresentaram-se associados ao blaTEM e ao ampC. Pelo sequenciamento foi possível identificar as ß-lactamases do tipo TEM-1 e CTX-M-2. Na classificação filogenética as amostras foram agrupadas nos grupos B2 (59,7%), B1 (25,4%) e A (14,9%). Dentre as 67 amostras com marcas de resistência aos ß-lactâmicos, o gene int foi detectado em 26,9% , das quais 71,4% da classe 1 e 28,6% da classe 2. Por outro lado, dentre as 91 amostras sem marcas de resistência a à ß-lactâmicos, somente 3,3% apresentaram integrons, sendo todos da classe 1. As amostras com integrons foram mais comumente alocadas nos grupos filogenéticos A e B1. A presença de ESBL, de genes de resistência e integrons em E. coli isoladas de cães é um achado importante, uma vez que o contato íntimo entre humanos e cães oferece condições para a transmissão das amostras e ainda, que estes animais podem servir de reservatórios de genes de resistência. Esses resultados reforçam a necessidade de controle no uso de antimicrobianos em animais de companhia e bem como o papel dos animais domésticos como reservatório de genes de resistência bacteriana, precisa ser melhor investigado / Abstract: The number of cats and dogs has substantially increased in modern society, with an estimated population of above 48 million in Brazil. The relationship between companion animals and humans has radically changed throughout the years, and animals have become in closer contact with humans. As a consequence of these changes, antimicrobial agents, including antimicrobial preparations licensed for human use, are frequently used in dogs. The aim of this study was to investigate, in Escherichia coli strains isolated from dogs, the occurrence of ß-extended-spectrum ß-lactamase (ESBL) phenotype and to identify resistance genes in these samples. The presence and diversity of integrons in strains of E. coli was analyzed. The classification of microorganisms in the phylogenetic groups A, B1, B2 and D was also determined. Among 158 E.coli strains isolated from dogs (51 from UTI [urinary tract infection], 52 from piometra and 55 from faeces of healthy dogs) 67 strains were selected that had at least one sign of resistance to ß-lactams. The strains selected: 41 isolated from UTI, 20 isolated from piometra and six isolated from the faeces of healthy dogs, were tested for antibiotic sensitivity by the disk diffusion method. ESBL production was screened by the double-disk synergy method. The identification of ß-lactamases was performed by PCR (Polymerase Chain Reaction) using specific primers for blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaGES-1, blaOXA-10, ampC and cmy and, subsequently, sequencing of the PCR product of strains showing the ESBL phenotype was performed. The phylogenetic classification (chuA, yjaA, TspE4.C2), as well as the detection of class 1 and class 2 integrons, were also determined by PCR. The results of susceptibility tests showed high resistance to 1st generation ß lactams, ampicillin (82.0%) and cephalexin (62.7%), among the selected strains. Resistance to 3rd and 4th generation ß-lactam antibiotics and monobactam was observed in 7.5% of isolates. The strains also showed resistance to antimicrobial tetracycline (82%), trimethoprim-sulfamethoxazole (62.7%), enrofloxacin (35.8%), florfenicol (34.3%) and ciprofloxacin (32.3%). Phenotypic expression of ESBL was observed in 2 samples (3.3%), both isolated from healthy animals. In the genotypic analysis, were identified the genes, blaTEM, (98.5%), ampC (95.5%), blaCTX-M (35.8%), blaSHV (6%) and cmy (2.9%); the genes blaCTX-M, blaSHV and cmy were shown to be associated with blaTEM and ampC. By sequencing, it was possible to identify the TEM-1 and CTX-M-2 ß-lactamases. In the phylogenetic classification, strains were classified B2 (59.7%), B1 (25.4%) and A (14.9%) groups. Among the 67 strains with resistance markers to ß-lactams, the int gene was detected in 26.9% of the strains (71.4% of class 1 and 28.6% of Class 2). Moreover, among the 91 samples without a trace of resistance to ß-lactams, only 3.3% had integrons, all of class 1. Strains with integrons were more commonly housed in the phylogenetic groups A and B1. The presence of ESBL, resistance genes and integrons in E. coli isolated from dogs is an important finding, due to close contact between humans and dogs provides conditions for the transmission of microorganisms and these animals may also serve as reservoirs of isolates harboring resistance genes. These results emphasize the need to control the use of antimicrobials in companion animals and the role of livestock as a reservoir for genes of resistance should be further investigated / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular