Fumonisin B1 is the most prevalent congener of the fumonisin mycotoxins produced by Fusarium verticilliodies and is considered by many to be the most toxic. Fumonisin B1 has been classified by IARC as a class 2B carcinogen. This is primarily due to evidence suggesting increased exposure to FB1 through contaminated foodstuffs is responsible for increased incidence of esophageal cancer in regions of China and South Africa. Fumonisin B1 exposure has also been implicated in the increased incidence of neural tube defects along the Texas/Mexico border. Therefore the principal goals of this research were to 1) Identify sorbent materials that would be compatible with the chemical characteristics of fumonisin B1 and evaluate their ability to sequester the toxin using established in vitro techniques; 2) evaluate urinary FB1 as a biomarker of exposure from a fumonisin contaminated diet; 3) utilize urinary FB1 as a diagnostic tool to evaluate the efficacy of NS in reducing biomarkers of FB1 bioavailability in a Ghanaian population suspected to be co-exposed to aflatoxins and fumonisins. Isothermal analysis and an alternative animal model were examined and compared to previously published results to determine the sorbent toxin interaction activity in vitro as a predictor of in vivo efficacy. An HPLC method for detection and quantitation of urinary FB1 was developed based on methods previously adapted for primary amine and biomarker analysis. Urinary FB1 was evaluated as an HPLC detectable biomarker using a rodent model. Calcium and sodium montmorillonite clays were selected to interact with the positive charge on FB1 at low pH and sorb the molecule. Ferrihydrite was selected to interact with the negative charge on the FB1 molecule at neutral to high pH. While both polarities of sorbent were effective, montmorillonite clays demonstrated a higher capacity for sorption of FB1 than ferrihydrite. These in vitro results were confirmed in a rodent model where urinary FB1 was reduced 27% in NovaSil treated rats vs. controls. Finally, in a Ghanaian population co-exposed to aflatoxins and fumonisins, urinary FB1 was significantly reduced at 2 time points when the NovaSil treatment was compared to placebo.

O objetivo deste estudo foi verificar a ocorrência de aflatoxina e fumonisina no sistema de produção de frango de corte e o impacto destas micotoxinas nos índices produtivos em uma empresa integradora localizada no Estado de São Paulo. Adicionalmente, foram identificados os principais fatores para a produção de micotoxinas em rações e a ocorrência de resíduos de aflatoxinas e fumonisinas em tecidos comestíveis de frango (músculo peitoral, fígado e moela). Foram realizadas as contagens de fungos e leveduras totais, de fungos dos gêneros Aspergillus ssp. e Fusarium ssp. e quantificação de aflatoxina e fumonisina nas principais matérias-primas da ração (milho e farelo de soja), na ração de abate e na cama de frango. O isolamento de fungos nas amostras de milho, farelo de soja e ração foi realizado em ágar DG18, enquanto que, para as amostras de cama de frango, utilizou-se o ágar PDA. Para a extração de aflatoxinas e fumonisinas, foram utilizadas colunas de imunoafinidade (Neogen®) e colunas SAX de troca iônica, respectivamente. A quantificação das aflatoxinas e fumonisinas foi realizada através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O milho foi o alimento onde foi observada a maior frequência de Aspergillus ssp. e Fusarium ssp., e também maior positividade para aflatoxinas e fumonisinas, sendo que uma das amostras ultrapassou o limite de aflatoxinas recomendado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). As quantidades de aflatoxinas e fumonisinas encontradas na ração não influenciaram significativamente os índices produtivos. Não foram encontrados níveis detectáveis de resíduos de aflatoxinas e fumonisinas nos tecidos analisados. Embora não tenham sido observadas lesões macroscópicas no fígado e bursa das aves, foram constatadas alterações histopatológicas nessas vísceras, as quais são compatíveis com lesões causadas pela ingestão de aflatoxinas e fumonisinas. / The objective of this study was to verify the occurrence of aflatoxin and fumonisin in poultry feed and their influence on poultry productivity at company located in São Paulo State. Supplementary, were identified the main factors that cause mycotoxin production in poultry feed and determine the occurrence of aflatoxins and fumonisins residues in edible parts of poultry (breast, liver and gizzard). The total mold and yeast counting of Aspergillus ssp. and Fusarium ssp. genus and quantification of aflatoxin and fumonisin were determined in the main feed ingredients (corn and soybean meal), in finishing diets and bedding. The fungi from corn, soybean meal and feed were isolated in DG18 agar, whereas, the fungi from bedding was used PDA agar. Aflatoxins and fumonisins, were extracted using an immunoaffinity column (Neogen®) and a SAX column, respectively. Aflatoxins and fumonisins were quantified by high performance liquid chromatografy (HPLC). The corn showed the highest frequency of Aspergillus ssp. and Fusarium ssp. and also the highest positivity for aflatoxins and fumonisins, there was one corn sample that exceeded the recommendations of the Brazilian Ministry of Agriculture. The levels of aflatoxins and fumonisins in the feed did not significantly influence productivity. There were not detectable levels of aflatoxins and fumonisins on analysed tissues. Although macroscopic lesions were not observed in liver and bursa, histopathological changes were observed in these organs, which are consistent with injuries caused by the aflatoxin and fumonisin consumption.

A fumonisina B1 (FB1) é um metabólito secundário produzido principalmente por Fusarium verticilioides em diversos tipos de alimentos, principalmente o milho, o qual constitui a base para composição de rações para várias espécies de animais domésticos. A FB1 é particularmente tóxica para suínos, cujas manifestações clínicas são evidentes em animais expostos a altas concentrações de FB1 na ração (em geral, acima de 30 mg/kg). No entanto, são escassos os estudos sobre os efeitos da FB1 em suínos alimentados com rações contendo baixas concentrações de fumonisinas, as quais são mais prováveis de serem encontradas em condições de campo. O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da exposição de suínos a baixos níveis de FB1 na ração, durante 28 dias, sobre o ganho de peso, consumo de ração, peso relativo de órgãos e aspectos histológicos do baço, fígado, pulmões, rins, coração e esôfago, a resposta imune e a determinação do resíduo de FB1 em materiais biológicos como plasma, urina e fezes. Vinte e quatro suínos foram distribuídos em 4 grupos experimentais e alimentados com rações contendo 0 mg (controle), 3,0 mg, 6,0 mg ou 9,0 mg FB1/kg de ração. As diferentes dietas não afetaram (P>0,05) o ganho de peso e nem o peso relativo dos órgãos analisados. Não foram constatadas lesões macroscópicas ou histopatológicas no esôfago, rins, coração e fígado. No entanto, foram observadas lesões histopatológicas nos pulmões de todos os suínos alimentados com rações contaminadas com fumonisinas, indicando que nenhum dos níveis de FB1 usados no experimento poderia ser considerado como seguro para suínos. Ainda, a FB1 não alterou as concentrações de imunoglobulinas totais, por outro lado, diminuiu a resposta imunológica dos suínos vacinados com Stellamune®, como também reduziu a expressão de citocinas pro-inflamatórias. As concentrações plasmáticas de FB1 residual encontradas permaneceram constantes ao longo dos 28 dias de exposição, nos suínos que se alimentaram com 3,0 mg FB1/kg de ração. Por outro lado, os níveis de FB1 no plasma variaram de 400,3 ± 19,6 pg/mL a 260,6 ± 61,6 pg/mL nos animais expostos a 6,0 mg FB1/kg de ração, e de 1127 ± 494,5 pg/mL a 460,7 ± 69,5 pg/mL nos animais expostos a 9,0 mg FB1/kg de ração, entre os dias 7 e 28 dias de exposição, respectivamente. Em relação aos níveis residuais de FB1 eliminados na urina, embora com variações ao longo dos 28 dias de exposição, foram encontrados níveis que variaram de 28,53 ± 17,9 ng/mL a 16,1 ± 22 ng/ml na urina dos suínos expostos com 3,0 mg FB1/kg de ração, de 47,4 ± 26,4 ng/mL a 24,12 ± 26 ng/mL nos suínos expostos a 6,0 mg FB1/kg de ração e de 75,05 ± 55,2 ng/mL a 18,9 ± 4,4 ng/mL nos suínos expostos a 9,0 mg FB1/kg de ração. Os níveis de FB1 residual eliminados nas fezes permaneceram constantes nos animais expostos com 3,0 mg FB1/kg de ração entre 2,26 ± 1,6 mg/kg e 3,25 ± 2,26 mg/kg, variando de 5,18 ± 1,6 mg/kg a 10,6 ± 2,3 mg/kg, e de 8,16 ± 6,8 mg/kg a 13,8 ± 4,8 mg/kg, nos suínos expostos a 6,0 mg FB1/kg de ração e 9,0 mg FB1/kg de ração, respectivamente. Os resíduos de FB1 encontrados nas fezes decaíram a partir de 21 dias de exposição a FB1 em suínos expostos a 6,0 mg FB1/kg de ração, porém, estes níveis permaneceram constantes entre o dia 21 e 28 em suínos expostos 9,0 mg FB1/kg de ração, indicando uma baixa absorção da toxina em todos os tratamentos. As correlações entre a FB1 eliminada nas fezes (mg/kg) e os níveis de FB1 ingeridos por suínos (mg FB1/animal) foram significativas (P<0,05) em todos os dias. Foram observadas correlações significativas (P<0,05) entre a ingestão de FB1 nos diferentes tratamentos e as concentrações de FB1 na urina e no plasma aos 7 e 28 dias, respectivamente. Deste modo, a quantificação de FB1 na urina e plasma é adequada como biomarcador da ingestão de baixos níveis FB1 no início (7 dias) e no final (28 dias) do período de intoxicação, respectivamente. São necessários novos estudos sobre os mecanismos de ação tóxica da FB1 em suínos, sobretudo em condições de exposição prolongada a níveis baixos de contaminação na ração. / Fumonisin B1 (FB1) is a secondary metabolite produced mainly by Fusarium verticilioides in various types of foods, particularly corn, which is the basis for various feed composition for domestic animals. FB1 is particularly toxic to swine, which clinical manifestations are clearly observed in animals exposed to high concentrations of FB1 in the diet (generally above 30 mg/kg). However, there are few studies on the effects of FB1 in pigs fed diets containing low concentrations of fumonisin, which are more probable to be found in field conditions. The objective of the study was to evaluate the effects of piglets exposed to low levels of FB1 in the feed for 28 days on weight gain, feed intake, relative weight of organs and histological aspects of the spleen, liver, lungs, kidneys, heart and esophagus, immune response and the determination of FB1 residue in biological materials such as plasma, urine and feces. Twenty-four pigs were divided into 4 experimental groups and fed diets containing 0 mg (control), 3.0 mg, 6.0 mg or 9.0 mg FB1/kg diet. The different diets did not affect (P> 0.05) weight gain or the relative weight of the analyzed organs. Macroscopic and microscopic lesions were not observed in the esophagus, liver, kidneys and heart. However, histopathological lesions were observed in the lungs of all pigs fed diets contaminated with fumonisin, indicating that none of FB1 levels used in the experiment could be considered as safe for pigs. Furthermore, the dietary FB1 did not alter the concentrations of total immunoglobulins, although it decreased the immune response of pigs vaccinated with Stellamune® and also reduced the expression of pro-inflammatory cytokines. The FB1 concentrations in plasma of pigs fed 3.0 mg FB1/kg diet remained constant over the 28 days of exposure. Moreover, FB1 plasma levels ranged from 400.3 ± 19.6 pg/ mL to 260.6 ± 61.6 pg/mL in animals exposed to 6.0 mg FB1/kg of diet and 1,127 ± 494.5 pg/mL to 460.7 ± 69.5 pg/mL in animals exposed to 9.0 mg FB1/kg diet, between 7 and 28 days of exposure, respectively. In relation to residual FB1 eliminated in urine, although a variation over the 28 days of exposure was observed, the levels ranged from 17.9 ± 28.53 ng/mL to 16.1 ± 22 ng/mL in urine of pigs exposed with 3.0 mg FB1/kg, 47.4 ± 26.4 ng/mL to 24.12 ± 26 ng/mL in pigs exposed to 6.0 mg FB1/kg, and 75.05 ± 55.2 ng/mL to 18.9 ± 4.4 ng/mL in pigs exposed to 9.0 mg FB1/kg of feed. Residual FB1 levels eliminated in the feces remained constant in animals exposed to 3.0 mg FB1/kg diet, with values of 2.26 ± 1.6 mg/g to 3.25 ± 2.26 mg/kg; in pigs fed 6.0 or 9.0 mg FB1/kg feed, the levels found in feces were 5.18 ± 1.6 mg/kg to 10.6 ± 2.3 mg/kg and 8.16 ± 6.8 mg/kg to 13.8 ± 4.8 mg/kg, respectively. The FB1 residues found in feces decreased from 21 days in pigs exposed to 6.0 mg FB1/kg of feed; however, these levels remained constant between 21 and 28 in pigs exposed to 9.0 mg FB1/kg of feed, indicating a low absorption of toxin in all treatments. Significant (P<0,.05) correlations were found between the FB1 excreted in feces (mg/kg) and the FB1 ingested (mg FB1/animal). The correlations between the ingested FB1 in the different treatments and the residual FB1 levels in urine or plasma were also significant (P<0.05) on days 7 and 28 of intoxication, respectively. Thus the quantification of FB1 in urine or plasm is suitable as biomarker of ingestion of low levels of FB1 at the beginning (7 days) or at the end (28 days) of the intoxication period, respectively. Further studies are needed on the mechanisms of toxic action of FB1 in pigs especially under conditions of prolonged exposure to low levels of contamination in the feed.

A fumonisina B1 (FB1) e uma micotoxina produzida pelo metabolismo secundário de espécies de Fusarium, principalmente F. verticillioides e F. proliferatum, os quais contaminam diversos alimentos antes e apos o processamento, sobretudo o milho e derivados, gerando graves problemas para a Saúde Pública e a qualidade dos alimentos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a exposição humana a FB1 presente nos alimentos através da estimativa de ingestão da toxina na dieta e da análise de diferentes biomarcadores presentes em amostras de sangue, urina e cabelo. Além disso, foram investigados os efeitos da toxina através da avaliação de ácido fólico presentes em alimentos e em soro, e os níveis de uréia e creatinina presentes em soro. O estudo foi realizado em dois municípios dos Estados de São Paulo e Santa Catarina, cujos respectivos voluntários foram categorizados como de baixo consumo de derivados de milho (Grupo A, voluntários de Pirassununga/SP) e de alto consumo de derivados de milho (Grupo B, voluntários de Erval Velho/SC). As amostras de alimentos do Grupo A (Pirassununga/SP) foram fornecidas pelos voluntários (n=100) nos meses de Junho/2011, Setembro/2011, Dezembro/2011 e Marco/2012. Os voluntários do Grupo B (Erval Velho/SC) (n=20) forneceram amostras de alimentos no mês de Abril/2012. Em cada grupo, uma lista com 20 alimentos a base de milho foi entregue aos voluntários, para fornecimento de amostras daqueles disponíveis em suas respectivas residências em cada mês de amostragem, totalizando 122 amostras de derivados de milho no Grupo A e 17 amostras no Grupo B coletadas durante o estudo. Adicionalmente, aplicou-se um Questionário de Frequência Alimentar (QFA) e um Inquérito Recordatório de 24 horas (QIR - 24 h) no momento das coletas de amostras. Em cada mês de amostragem de alimentos, foram coletadas amostras de sangue, urina (somente Grupo A) e cabelo dos voluntários, sendo as amostras armazenadas a -20ºC (urina e cabelo) ou -80ºC (sangue) até o momento das análises. As amostras de alimentos foram submetidas a análise de FB1, sendo que as de farinha de milho foram também analisadas quanto ao teor de ácido fólico. Ambas as análises foram feitas através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Em soro, foram avaliadas a relação esfinganina/esfingosina (Sa/So), resíduos de FB1, ácido fólico, uréia e creatinina. Em urina, foram analisados os níveis de FB1, creatinina para correção do volume urinário e a relação Sa/So. Em cabelo, foram analisados os resíduos de FB1 através de CLAE acoplada a espectrometria de massas. Todos os métodos de análise foram submetidos a procedimento de otimização e validação intra--laboratorial. A incidência de FB1 nos alimentos foi, em média, 72% (n=122) nas amostras do Grupo A (Pirassununga/SP) e 35% (n=17) no Grupo B (Erval Velho/SC). Os maiores níveis foram encontrados em amostras de pipoca provenientes do Grupo B, com uma amostra excedendo o limite de tolerância estabelecido no Brasil (2,500 &micro;g kg-1). A ingestão diária provável média (IDPM) de FB1 no Grupo A foi de 63,3 ng kg-1 peso corpóreo (p.c.) dia-1, que corresponde a 3,1% da ingestão provisória máxima tolerável (IPMT) recomendada para fumonisinas (2.000 ng kg-1 p.c. dia-1). A IDPM do Grupo B apresentou uma média de 190,1 ng kg-1 p.c. dia-1 o que corresponde a 9,5% da IDMT. As concentrações de ácido fólico nas amostras de farinha de milho variaram de < 0,3 &micro;g kg-1 (limite de quantificação do método) a 1.705 &micro;g kg-1, com média de 713 &plusmn; 435 &micro;g kg-1. Somente uma amostra apresentou nível de ácido fólico acima do valor mínimo estabelecido pela ANVISA. Em urina, a incidência de FB1 foi de 33,4% (n=251), com níveis médios de 3,19 &plusmn; 3,15 ng mg-1 de creatinina. Não houve correlação (P&gt;0,05) entre as concentrações de FB1 na urina e nos alimentos. Os níveis de esfinganina foram mais elevados em mulheres, com 25,0% (n=116) de amostras positivas, em comparação à urina de homens, 10,4% (n=96). A relação Sa/So apresentou em média 0,91, 0,77 e 0,89 para urina de mulheres, homens e em combinação, respectivamente. Em soro, os níveis de esfingosina foram em média 2,48 ng mL-1 para o Grupo A e 5,01 ng mL-1 para o Grupo B. A relação Sa/So variou de 0,06 a 3,19 com média de 0,79 para o Grupo A e 0,78 para o Grupo B. Embora tenha havido correlação positiva (r=0,574, P&lt;0,05) entre a relação Sa/So no soro e os dados de consumo de milho e derivados obtidos no QIR-24 h, não foram observadas correlações (P&gt;0,05) entre a ingestão de FB1 e a relação Sa/So na urina ou soro. A concentração de ácido fólico no soro variou de 6,7 a 24,0 ng mL-1 (média de 13,4 &plusmn; 5,4 ng mL-1), com ambos os grupos (A e B) apresentando resultados dentro dos valores de referências. Não foram observados níveis detectáveis de FB1 nas amostras de soro. No entanto, FB1 foi detectada em 4 amostras de cabelo humano (7,2%) dos Grupos A e B, cuja concentração média foi de 21,3 &plusmn; 12,1 ng g-1. Em síntese, os resultados obtidos nas análises de biomarcadores de FB1 no presente trabalho estão de acordo com os valores de IDPM encontrados, indicando que a exposição a FB1 nas populações estudadas não representa um risco a saúde. / Fumonisin B1 (FB1) is a mycotoxin produced by the secondary metabolism of Fusarium species, mainly F. verticillioides and F. proliferatum, which contaminates foods before and after processing and causes serious problems to public health and food quality. The aim of this study was to evaluate the human exposure to FB1 in food by means of estimated intake of toxin in the diet, and analysis of different biomarkers in serum, urine and hair. In addition, folic acid in food and blood as well urea and creatinin in serum were investigated to evaluate the toxin effects. The study was conducted in two cities of Sao Paulo and Santa Catarina States, where the respective volunteers were categorized as low-consumers of corn products (Group A, volunteers from Pirassununga/SP) and high-consumers of corn products (Group B, volunteers from Erval Velho/SC). Food samples from Group A (Pirassununga/SP) were provided by volunteers (n=100) in June/2011, September/2011, December/2011 and March/2012. The volunteers from Group B (Erval Velho/SC) (n=20) provided food samples in April/2012. In each group, a list of 20 corn products was given to volunteers, to allow them to check and collect the food items available in their homes at each sampling time. The total number of samples of corn products provided by the volunteers were 122 and 17 in Group A and Group B, respectively. Addicionally, a Food Frequency Questionnaire (FFQ) and a 24-Hours Dietary Recall Questionnaire (24h-DRQ) were applied by the time of sample collections. In each month of food samples collection, samples of blood, urine (only Group A) and hair from the volunteers were collected and storage at -20ºC (urine and hair) or -80ºC (blood) until analysis. Food samples were submitted to determination of FB1, and corn meal samples were also evaluated for folic acid levels. Both analysis were performed by high performance liquid chromatography (HPLC). In serum, analyses included sphinganine/sphingosine ratio (Sa/So), FB1 residue, folic acid, urea and creatinine. In urine, the levels of FB1, creatinine to correct urinary volume and Sa/So ratio were evaluated. In hair, FB1 residues were analysed by HPLC coupled to mass spectrometry. All the analytical methods were submitted to optimization and intra-laboratorial validation procedures. The mean incidences of FB1 in corn products were 72% (n=122) in samples of Group A (Pirassununga/SP), and 35% (n=17) of Group B (Erval Velho/SC). The higher levels were found in popcorn from Group B, with one sample exceeding the tolerance limit established in Brazil (2,500 &micro;g kg-1). The mean probable daily intake (PDIM) of FB1 in Group A was 63.3 ng kg-1 body weigh (b.w.) day-1, which corresponds to 3.1% of provisional maximum tolerable intake (PMTDI) recommended for fumonisins (2,000 ng kg-1 b.w. day-1). PDIM of Group B was 190.1 ng kg-1 b.w. day-1, which represents 9.5% of PMTDI. Folic acid levels in corn meal ranged from &LT; 0,3 &micro;g kg-1 (quantification limit) to 1.705 &micro;g kg-1, with a mean of 713 &plusmn; 435 &micro;g kg-1. Only one sample had levels of folic acid above the minimum established by ANVISA. In urine, the incidence of FB1 was 33,4% (n=251), at mean levels of 3,19 &plusmn; 3,15 ng mg-1 of creatinine. There wasn\'t correlation (P&gt;0.05) between concentrations of FB1 in urine and foods. Sphinganine levels were higher in woman, with 25.0% (n=116) of positive samples in comparison to urine of men, 10.4% (n=96). The mean Sa/So ratios were 0.91, 0.77 and 0.89 for urine of women, men and in combination, respectively. In serum, sphingosine presented a mean of 2.48 ng mL-1 to Group A and 5.01 ng mL-1 to Group B. Sa/So ratio ranged from 0.06 to 3.19 with a mean of 0.79 to Group A and 0.78 to Group B. Although a positive correlation (r=0.574, P&lt;0.05) was found between Sa/So ratio in serum and corn consumption data obtained by 24h-DRQ, no correlation was observed (P&gt;0,05) with FB1 intake and Sa/So ratio in urine or serum. Folic acid concentration in serum ranged from 6.7 to 24.0 ng mL-1 (mean of 13.4 &plusmn; 5.4 ng mL-1), with both groups (A and B) presenting levels within the reference valuies. There were no detectable levels of FB1 in serum samples. However, FB1 was detected in 4 human hair samples (7.2%) of Groups A and B, at a mean concentration was 21.3 &plusmn; 12.1 ng g-1. In summary, the results obtained in the analyses of FB1 biomarkers in the present study are in agreement with the PDIM values found, hence indicating that FB1 exposure in the populations studied do not represent a health concern.

A fumonisina B1 (FB1) e uma micotoxina produzida pelo metabolismo secundário de espécies de Fusarium, principalmente F. verticillioides e F. proliferatum, os quais contaminam diversos alimentos antes e apos o processamento, sobretudo o milho e derivados, gerando graves problemas para a Saúde Pública e a qualidade dos alimentos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a exposição humana a FB1 presente nos alimentos através da estimativa de ingestão da toxina na dieta e da análise de diferentes biomarcadores presentes em amostras de sangue, urina e cabelo. Além disso, foram investigados os efeitos da toxina através da avaliação de ácido fólico presentes em alimentos e em soro, e os níveis de uréia e creatinina presentes em soro. O estudo foi realizado em dois municípios dos Estados de São Paulo e Santa Catarina, cujos respectivos voluntários foram categorizados como de baixo consumo de derivados de milho (Grupo A, voluntários de Pirassununga/SP) e de alto consumo de derivados de milho (Grupo B, voluntários de Erval Velho/SC). As amostras de alimentos do Grupo A (Pirassununga/SP) foram fornecidas pelos voluntários (n=100) nos meses de Junho/2011, Setembro/2011, Dezembro/2011 e Marco/2012. Os voluntários do Grupo B (Erval Velho/SC) (n=20) forneceram amostras de alimentos no mês de Abril/2012. Em cada grupo, uma lista com 20 alimentos a base de milho foi entregue aos voluntários, para fornecimento de amostras daqueles disponíveis em suas respectivas residências em cada mês de amostragem, totalizando 122 amostras de derivados de milho no Grupo A e 17 amostras no Grupo B coletadas durante o estudo. Adicionalmente, aplicou-se um Questionário de Frequência Alimentar (QFA) e um Inquérito Recordatório de 24 horas (QIR - 24 h) no momento das coletas de amostras. Em cada mês de amostragem de alimentos, foram coletadas amostras de sangue, urina (somente Grupo A) e cabelo dos voluntários, sendo as amostras armazenadas a -20ºC (urina e cabelo) ou -80ºC (sangue) até o momento das análises. As amostras de alimentos foram submetidas a análise de FB1, sendo que as de farinha de milho foram também analisadas quanto ao teor de ácido fólico. Ambas as análises foram feitas através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Em soro, foram avaliadas a relação esfinganina/esfingosina (Sa/So), resíduos de FB1, ácido fólico, uréia e creatinina. Em urina, foram analisados os níveis de FB1, creatinina para correção do volume urinário e a relação Sa/So. Em cabelo, foram analisados os resíduos de FB1 através de CLAE acoplada a espectrometria de massas. Todos os métodos de análise foram submetidos a procedimento de otimização e validação intra--laboratorial. A incidência de FB1 nos alimentos foi, em média, 72% (n=122) nas amostras do Grupo A (Pirassununga/SP) e 35% (n=17) no Grupo B (Erval Velho/SC). Os maiores níveis foram encontrados em amostras de pipoca provenientes do Grupo B, com uma amostra excedendo o limite de tolerância estabelecido no Brasil (2,500 &micro;g kg-1). A ingestão diária provável média (IDPM) de FB1 no Grupo A foi de 63,3 ng kg-1 peso corpóreo (p.c.) dia-1, que corresponde a 3,1% da ingestão provisória máxima tolerável (IPMT) recomendada para fumonisinas (2.000 ng kg-1 p.c. dia-1). A IDPM do Grupo B apresentou uma média de 190,1 ng kg-1 p.c. dia-1 o que corresponde a 9,5% da IDMT. As concentrações de ácido fólico nas amostras de farinha de milho variaram de < 0,3 &micro;g kg-1 (limite de quantificação do método) a 1.705 &micro;g kg-1, com média de 713 &plusmn; 435 &micro;g kg-1. Somente uma amostra apresentou nível de ácido fólico acima do valor mínimo estabelecido pela ANVISA. Em urina, a incidência de FB1 foi de 33,4% (n=251), com níveis médios de 3,19 &plusmn; 3,15 ng mg-1 de creatinina. Não houve correlação (P&gt;0,05) entre as concentrações de FB1 na urina e nos alimentos. Os níveis de esfinganina foram mais elevados em mulheres, com 25,0% (n=116) de amostras positivas, em comparação à urina de homens, 10,4% (n=96). A relação Sa/So apresentou em média 0,91, 0,77 e 0,89 para urina de mulheres, homens e em combinação, respectivamente. Em soro, os níveis de esfingosina foram em média 2,48 ng mL-1 para o Grupo A e 5,01 ng mL-1 para o Grupo B. A relação Sa/So variou de 0,06 a 3,19 com média de 0,79 para o Grupo A e 0,78 para o Grupo B. Embora tenha havido correlação positiva (r=0,574, P&lt;0,05) entre a relação Sa/So no soro e os dados de consumo de milho e derivados obtidos no QIR-24 h, não foram observadas correlações (P&gt;0,05) entre a ingestão de FB1 e a relação Sa/So na urina ou soro. A concentração de ácido fólico no soro variou de 6,7 a 24,0 ng mL-1 (média de 13,4 &plusmn; 5,4 ng mL-1), com ambos os grupos (A e B) apresentando resultados dentro dos valores de referências. Não foram observados níveis detectáveis de FB1 nas amostras de soro. No entanto, FB1 foi detectada em 4 amostras de cabelo humano (7,2%) dos Grupos A e B, cuja concentração média foi de 21,3 &plusmn; 12,1 ng g-1. Em síntese, os resultados obtidos nas análises de biomarcadores de FB1 no presente trabalho estão de acordo com os valores de IDPM encontrados, indicando que a exposição a FB1 nas populações estudadas não representa um risco a saúde. / Fumonisin B1 (FB1) is a mycotoxin produced by the secondary metabolism of Fusarium species, mainly F. verticillioides and F. proliferatum, which contaminates foods before and after processing and causes serious problems to public health and food quality. The aim of this study was to evaluate the human exposure to FB1 in food by means of estimated intake of toxin in the diet, and analysis of different biomarkers in serum, urine and hair. In addition, folic acid in food and blood as well urea and creatinin in serum were investigated to evaluate the toxin effects. The study was conducted in two cities of Sao Paulo and Santa Catarina States, where the respective volunteers were categorized as low-consumers of corn products (Group A, volunteers from Pirassununga/SP) and high-consumers of corn products (Group B, volunteers from Erval Velho/SC). Food samples from Group A (Pirassununga/SP) were provided by volunteers (n=100) in June/2011, September/2011, December/2011 and March/2012. The volunteers from Group B (Erval Velho/SC) (n=20) provided food samples in April/2012. In each group, a list of 20 corn products was given to volunteers, to allow them to check and collect the food items available in their homes at each sampling time. The total number of samples of corn products provided by the volunteers were 122 and 17 in Group A and Group B, respectively. Addicionally, a Food Frequency Questionnaire (FFQ) and a 24-Hours Dietary Recall Questionnaire (24h-DRQ) were applied by the time of sample collections. In each month of food samples collection, samples of blood, urine (only Group A) and hair from the volunteers were collected and storage at -20ºC (urine and hair) or -80ºC (blood) until analysis. Food samples were submitted to determination of FB1, and corn meal samples were also evaluated for folic acid levels. Both analysis were performed by high performance liquid chromatography (HPLC). In serum, analyses included sphinganine/sphingosine ratio (Sa/So), FB1 residue, folic acid, urea and creatinine. In urine, the levels of FB1, creatinine to correct urinary volume and Sa/So ratio were evaluated. In hair, FB1 residues were analysed by HPLC coupled to mass spectrometry. All the analytical methods were submitted to optimization and intra-laboratorial validation procedures. The mean incidences of FB1 in corn products were 72% (n=122) in samples of Group A (Pirassununga/SP), and 35% (n=17) of Group B (Erval Velho/SC). The higher levels were found in popcorn from Group B, with one sample exceeding the tolerance limit established in Brazil (2,500 &micro;g kg-1). The mean probable daily intake (PDIM) of FB1 in Group A was 63.3 ng kg-1 body weigh (b.w.) day-1, which corresponds to 3.1% of provisional maximum tolerable intake (PMTDI) recommended for fumonisins (2,000 ng kg-1 b.w. day-1). PDIM of Group B was 190.1 ng kg-1 b.w. day-1, which represents 9.5% of PMTDI. Folic acid levels in corn meal ranged from &LT; 0,3 &micro;g kg-1 (quantification limit) to 1.705 &micro;g kg-1, with a mean of 713 &plusmn; 435 &micro;g kg-1. Only one sample had levels of folic acid above the minimum established by ANVISA. In urine, the incidence of FB1 was 33,4% (n=251), at mean levels of 3,19 &plusmn; 3,15 ng mg-1 of creatinine. There wasn\'t correlation (P&gt;0.05) between concentrations of FB1 in urine and foods. Sphinganine levels were higher in woman, with 25.0% (n=116) of positive samples in comparison to urine of men, 10.4% (n=96). The mean Sa/So ratios were 0.91, 0.77 and 0.89 for urine of women, men and in combination, respectively. In serum, sphingosine presented a mean of 2.48 ng mL-1 to Group A and 5.01 ng mL-1 to Group B. Sa/So ratio ranged from 0.06 to 3.19 with a mean of 0.79 to Group A and 0.78 to Group B. Although a positive correlation (r=0.574, P&lt;0.05) was found between Sa/So ratio in serum and corn consumption data obtained by 24h-DRQ, no correlation was observed (P&gt;0,05) with FB1 intake and Sa/So ratio in urine or serum. Folic acid concentration in serum ranged from 6.7 to 24.0 ng mL-1 (mean of 13.4 &plusmn; 5.4 ng mL-1), with both groups (A and B) presenting levels within the reference valuies. There were no detectable levels of FB1 in serum samples. However, FB1 was detected in 4 human hair samples (7.2%) of Groups A and B, at a mean concentration was 21.3 &plusmn; 12.1 ng g-1. In summary, the results obtained in the analyses of FB1 biomarkers in the present study are in agreement with the PDIM values found, hence indicating that FB1 exposure in the populations studied do not represent a health concern.

A fumonisina B1 (FB1) é um metabólito secundário produzido principalmente por Fusarium verticilioides em diversos tipos de alimentos, principalmente o milho, o qual constitui a base para composição de rações para várias espécies de animais domésticos. A FB1 é particularmente tóxica para suínos, cujas manifestações clínicas são evidentes em animais expostos a altas concentrações de FB1 na ração (em geral, acima de 30 mg/kg). No entanto, são escassos os estudos sobre os efeitos da FB1 em suínos alimentados com rações contendo baixas concentrações de fumonisinas, as quais são mais prováveis de serem encontradas em condições de campo. O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da exposição de suínos a baixos níveis de FB1 na ração, durante 28 dias, sobre o ganho de peso, consumo de ração, peso relativo de órgãos e aspectos histológicos do baço, fígado, pulmões, rins, coração e esôfago, a resposta imune e a determinação do resíduo de FB1 em materiais biológicos como plasma, urina e fezes. Vinte e quatro suínos foram distribuídos em 4 grupos experimentais e alimentados com rações contendo 0 mg (controle), 3,0 mg, 6,0 mg ou 9,0 mg FB1/kg de ração. As diferentes dietas não afetaram (P>0,05) o ganho de peso e nem o peso relativo dos órgãos analisados. Não foram constatadas lesões macroscópicas ou histopatológicas no esôfago, rins, coração e fígado. No entanto, foram observadas lesões histopatológicas nos pulmões de todos os suínos alimentados com rações contaminadas com fumonisinas, indicando que nenhum dos níveis de FB1 usados no experimento poderia ser considerado como seguro para suínos. Ainda, a FB1 não alterou as concentrações de imunoglobulinas totais, por outro lado, diminuiu a resposta imunológica dos suínos vacinados com Stellamune®, como também reduziu a expressão de citocinas pro-inflamatórias. As concentrações plasmáticas de FB1 residual encontradas permaneceram constantes ao longo dos 28 dias de exposição, nos suínos que se alimentaram com 3,0 mg FB1/kg de ração. Por outro lado, os níveis de FB1 no plasma variaram de 400,3 ± 19,6 pg/mL a 260,6 ± 61,6 pg/mL nos animais expostos a 6,0 mg FB1/kg de ração, e de 1127 ± 494,5 pg/mL a 460,7 ± 69,5 pg/mL nos animais expostos a 9,0 mg FB1/kg de ração, entre os dias 7 e 28 dias de exposição, respectivamente. Em relação aos níveis residuais de FB1 eliminados na urina, embora com variações ao longo dos 28 dias de exposição, foram encontrados níveis que variaram de 28,53 ± 17,9 ng/mL a 16,1 ± 22 ng/ml na urina dos suínos expostos com 3,0 mg FB1/kg de ração, de 47,4 ± 26,4 ng/mL a 24,12 ± 26 ng/mL nos suínos expostos a 6,0 mg FB1/kg de ração e de 75,05 ± 55,2 ng/mL a 18,9 ± 4,4 ng/mL nos suínos expostos a 9,0 mg FB1/kg de ração. Os níveis de FB1 residual eliminados nas fezes permaneceram constantes nos animais expostos com 3,0 mg FB1/kg de ração entre 2,26 ± 1,6 mg/kg e 3,25 ± 2,26 mg/kg, variando de 5,18 ± 1,6 mg/kg a 10,6 ± 2,3 mg/kg, e de 8,16 ± 6,8 mg/kg a 13,8 ± 4,8 mg/kg, nos suínos expostos a 6,0 mg FB1/kg de ração e 9,0 mg FB1/kg de ração, respectivamente. Os resíduos de FB1 encontrados nas fezes decaíram a partir de 21 dias de exposição a FB1 em suínos expostos a 6,0 mg FB1/kg de ração, porém, estes níveis permaneceram constantes entre o dia 21 e 28 em suínos expostos 9,0 mg FB1/kg de ração, indicando uma baixa absorção da toxina em todos os tratamentos. As correlações entre a FB1 eliminada nas fezes (mg/kg) e os níveis de FB1 ingeridos por suínos (mg FB1/animal) foram significativas (P<0,05) em todos os dias. Foram observadas correlações significativas (P<0,05) entre a ingestão de FB1 nos diferentes tratamentos e as concentrações de FB1 na urina e no plasma aos 7 e 28 dias, respectivamente. Deste modo, a quantificação de FB1 na urina e plasma é adequada como biomarcador da ingestão de baixos níveis FB1 no início (7 dias) e no final (28 dias) do período de intoxicação, respectivamente. São necessários novos estudos sobre os mecanismos de ação tóxica da FB1 em suínos, sobretudo em condições de exposição prolongada a níveis baixos de contaminação na ração. / Fumonisin B1 (FB1) is a secondary metabolite produced mainly by Fusarium verticilioides in various types of foods, particularly corn, which is the basis for various feed composition for domestic animals. FB1 is particularly toxic to swine, which clinical manifestations are clearly observed in animals exposed to high concentrations of FB1 in the diet (generally above 30 mg/kg). However, there are few studies on the effects of FB1 in pigs fed diets containing low concentrations of fumonisin, which are more probable to be found in field conditions. The objective of the study was to evaluate the effects of piglets exposed to low levels of FB1 in the feed for 28 days on weight gain, feed intake, relative weight of organs and histological aspects of the spleen, liver, lungs, kidneys, heart and esophagus, immune response and the determination of FB1 residue in biological materials such as plasma, urine and feces. Twenty-four pigs were divided into 4 experimental groups and fed diets containing 0 mg (control), 3.0 mg, 6.0 mg or 9.0 mg FB1/kg diet. The different diets did not affect (P> 0.05) weight gain or the relative weight of the analyzed organs. Macroscopic and microscopic lesions were not observed in the esophagus, liver, kidneys and heart. However, histopathological lesions were observed in the lungs of all pigs fed diets contaminated with fumonisin, indicating that none of FB1 levels used in the experiment could be considered as safe for pigs. Furthermore, the dietary FB1 did not alter the concentrations of total immunoglobulins, although it decreased the immune response of pigs vaccinated with Stellamune® and also reduced the expression of pro-inflammatory cytokines. The FB1 concentrations in plasma of pigs fed 3.0 mg FB1/kg diet remained constant over the 28 days of exposure. Moreover, FB1 plasma levels ranged from 400.3 ± 19.6 pg/ mL to 260.6 ± 61.6 pg/mL in animals exposed to 6.0 mg FB1/kg of diet and 1,127 ± 494.5 pg/mL to 460.7 ± 69.5 pg/mL in animals exposed to 9.0 mg FB1/kg diet, between 7 and 28 days of exposure, respectively. In relation to residual FB1 eliminated in urine, although a variation over the 28 days of exposure was observed, the levels ranged from 17.9 ± 28.53 ng/mL to 16.1 ± 22 ng/mL in urine of pigs exposed with 3.0 mg FB1/kg, 47.4 ± 26.4 ng/mL to 24.12 ± 26 ng/mL in pigs exposed to 6.0 mg FB1/kg, and 75.05 ± 55.2 ng/mL to 18.9 ± 4.4 ng/mL in pigs exposed to 9.0 mg FB1/kg of feed. Residual FB1 levels eliminated in the feces remained constant in animals exposed to 3.0 mg FB1/kg diet, with values of 2.26 ± 1.6 mg/g to 3.25 ± 2.26 mg/kg; in pigs fed 6.0 or 9.0 mg FB1/kg feed, the levels found in feces were 5.18 ± 1.6 mg/kg to 10.6 ± 2.3 mg/kg and 8.16 ± 6.8 mg/kg to 13.8 ± 4.8 mg/kg, respectively. The FB1 residues found in feces decreased from 21 days in pigs exposed to 6.0 mg FB1/kg of feed; however, these levels remained constant between 21 and 28 in pigs exposed to 9.0 mg FB1/kg of feed, indicating a low absorption of toxin in all treatments. Significant (P<0,.05) correlations were found between the FB1 excreted in feces (mg/kg) and the FB1 ingested (mg FB1/animal). The correlations between the ingested FB1 in the different treatments and the residual FB1 levels in urine or plasma were also significant (P<0.05) on days 7 and 28 of intoxication, respectively. Thus the quantification of FB1 in urine or plasm is suitable as biomarker of ingestion of low levels of FB1 at the beginning (7 days) or at the end (28 days) of the intoxication period, respectively. Further studies are needed on the mechanisms of toxic action of FB1 in pigs especially under conditions of prolonged exposure to low levels of contamination in the feed.

O objetivo deste estudo foi verificar a ocorrência de aflatoxina e fumonisina no sistema de produção de frango de corte e o impacto destas micotoxinas nos índices produtivos em uma empresa integradora localizada no Estado de São Paulo. Adicionalmente, foram identificados os principais fatores para a produção de micotoxinas em rações e a ocorrência de resíduos de aflatoxinas e fumonisinas em tecidos comestíveis de frango (músculo peitoral, fígado e moela). Foram realizadas as contagens de fungos e leveduras totais, de fungos dos gêneros Aspergillus ssp. e Fusarium ssp. e quantificação de aflatoxina e fumonisina nas principais matérias-primas da ração (milho e farelo de soja), na ração de abate e na cama de frango. O isolamento de fungos nas amostras de milho, farelo de soja e ração foi realizado em ágar DG18, enquanto que, para as amostras de cama de frango, utilizou-se o ágar PDA. Para a extração de aflatoxinas e fumonisinas, foram utilizadas colunas de imunoafinidade (Neogen®) e colunas SAX de troca iônica, respectivamente. A quantificação das aflatoxinas e fumonisinas foi realizada através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O milho foi o alimento onde foi observada a maior frequência de Aspergillus ssp. e Fusarium ssp., e também maior positividade para aflatoxinas e fumonisinas, sendo que uma das amostras ultrapassou o limite de aflatoxinas recomendado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). As quantidades de aflatoxinas e fumonisinas encontradas na ração não influenciaram significativamente os índices produtivos. Não foram encontrados níveis detectáveis de resíduos de aflatoxinas e fumonisinas nos tecidos analisados. Embora não tenham sido observadas lesões macroscópicas no fígado e bursa das aves, foram constatadas alterações histopatológicas nessas vísceras, as quais são compatíveis com lesões causadas pela ingestão de aflatoxinas e fumonisinas. / The objective of this study was to verify the occurrence of aflatoxin and fumonisin in poultry feed and their influence on poultry productivity at company located in São Paulo State. Supplementary, were identified the main factors that cause mycotoxin production in poultry feed and determine the occurrence of aflatoxins and fumonisins residues in edible parts of poultry (breast, liver and gizzard). The total mold and yeast counting of Aspergillus ssp. and Fusarium ssp. genus and quantification of aflatoxin and fumonisin were determined in the main feed ingredients (corn and soybean meal), in finishing diets and bedding. The fungi from corn, soybean meal and feed were isolated in DG18 agar, whereas, the fungi from bedding was used PDA agar. Aflatoxins and fumonisins, were extracted using an immunoaffinity column (Neogen®) and a SAX column, respectively. Aflatoxins and fumonisins were quantified by high performance liquid chromatografy (HPLC). The corn showed the highest frequency of Aspergillus ssp. and Fusarium ssp. and also the highest positivity for aflatoxins and fumonisins, there was one corn sample that exceeded the recommendations of the Brazilian Ministry of Agriculture. The levels of aflatoxins and fumonisins in the feed did not significantly influence productivity. There were not detectable levels of aflatoxins and fumonisins on analysed tissues. Although macroscopic lesions were not observed in liver and bursa, histopathological changes were observed in these organs, which are consistent with injuries caused by the aflatoxin and fumonisin consumption.

A survey involving 71 farmers from rural communities in Mpumalanga, South Africa was conducted to gather information regarding the importance and utilisation of cowpea. Cowpea was rated third most important in contributing to household security, preceded by maize and vegetable production. Cowpea was mainly produced for own consumption, as a source of income and as fodder for livestock to a lesser extent. The crop was used by 8.5% of the farmers for medicinal purposes. Results indicated that 20% of the farmers encountered problems with mouldiness during storage, with insect infestation to a lesser degree. Cowpea seed samples from South Africa and Benin, West Africa were analysed for seed mycoflora and various fungal genera, particularly Aspergillus, Phoma and Lasiodiplodia were recorded. The results indicated an array of Fusarium spp. including F. equiseti, F. chlamydosporum, F. graminearum, F. proliferatum, F. sambucinum, F. scirpi, F. semitectum and F. subglutinans. The seed samples and the F. proliferatum isolates, cultured on maize patty media, were analysed for fumonisin production. Samples were extracted with methanol/water (70:30) and cleaned-up on strong anion exchange solid phase extraction cartridges. High-performance liquid chromatography with pre-column derivatisation using o-phthaldialdehyde was used for the detection and quantification of FB1, FB2 and FB3. The cowpea cultivars from South Africa had levels of FB1 ranging between 0.12 – 0.61 µg/g. All the F. proliferatum isolates produced FB1, FB2 and FB3 with total fumonisin concentration levels between 0.80 - 25.30 µg/g. The highest level of FB1 detected was 16.86 µg/g. Surface-disinfected seeds were imbibed in sterile distilled water amended with FB1 to yield final concentrations of 10, 25, 50 and 100 ppm. Percentage germination was determined in paper towels according to the International Seed Testing Association (ISTA) rules. Root and shoot length was measured after 9 days. All the toxin concentrations significantly decreased seed germination whilst root and shoot elongation was inhibited by the 50 and 100 ppm concentrations. Embryonic seed tissue treated with FB1 indicated compaction of the protoplasm and separation of the plasma membrane from the cell wall. Lipid bodies accumulated and seemed to line the cell wall. Acetone and ethanol extracts of the leaves of two cowpea cultivars exhibited significant inhibition of the growth of fungal plant pathogens at 5.0 mg/ml, with the exception of Fusarium equiseti. The growth of some fungi, in particular Alternaria alternate, was also reduced by lower concentrations of certain extracts. Acetone extracts of the Bechwana White cultivar inhibited growth of Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis at 2.5 mg/ml and Bacillus cereus, B. subtilis and Enterobacter cloacae at 5.0 mg/ml. Ethanol extracts of the same cultivar showed antibacterial activity against E. faecalis and E. cloacae at 5.0 mg/ml. This study represents the first report on the natural occurrence of fumonisins on cowpea seed and the potential of F. proliferatum isolates from cowpea seed to produce fumonisins. The phytotoxic effects of FB1 on cowpea seeds as well as the antimicrobial potential of cowpea leaf extracts were demonstrated for the first time. / Thesis (PhD)--University of Pretoria, 2006. / Microbiology and Plant Pathology / unrestricted