Aktivator Protein-1 (AP-1) ist ein kollektiver Terminus für dimerische Transkriptionsfaktoren, die sich aus Fos- und Jun- Proteinen zusammensetzen. Diese Untereinheiten binden an eine gemeinsame, spezifische DNA-Sequenz, die AP-1 Bindungsstelle. Zusätzlich zu der gut dokumentierten Rolle des c-Fos Proteins in der Tumorgenese, wo dieses Gen als ein Aktivator beschrieben ist, übt AP-1 einen Einfluss auf mesenchymale Stromazellen und Immunzellen aus. Mesenchymale Knochenmarkszellen sind die Vorläuferzellen für Adipozyten, Osteoblasten, Chondrozyten, Myozyten und Fibroblasten. Die molekularen Mechanismen, welche die Differenzierungen regeln, sind noch weitgehend unerforscht. Der heterodimere Transkriptionsfaktor AP-1 übt eine wichtige Rolle in der Kontrolle der Zelldifferenzierung aus. Verschieden genetisch veränderte Mausmodelle untermauerten dies. Mäuse, welche das Fos-related antigen-1 (Fra1) oder eine kürzere Protein-Isoform von FosB (deltaFosB) überexpremieren, entwickelten, durch eine beschleunigte Differenzierung der Osteoblasten, eine Osteosklerose. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass die transgenen deltaFosB Mäuse weniger Fett haben. Die Stabilität und Aktivität von Fos Proteinen kann durch post-transkriptionale Modifizierungen geregelt werden. Basierend auf knockout Mausmodellen, wurde eine tragende Rolle für das wachstumsregulierende Enzym Rsk2 postuliert. Rsk2 spielt eine mögliche Rolle bei der Ausdifferenzierung von mesenchymalen Vorläuferzellen zu Osteoblasten und Adipozyten. Das Ziel dieser Arbeit war es molekulare Mechanismen zu finden, welche die unterschiedlichen Phänotypen (wild typ, fra1-tg, rsk2-defizient und fra1-tg/rsk2-defizient) charakterisieren. Die Knochenuntersuchungen der verschiedenen Genotypen zeigten, dass Fra1 und Rsk2, unabhängig voneinander, tragende Rollen im Knochenmetabolismus spielen. Quantitative Analysen von Adipozytenmarker, wie PPARgamma und C/EBPalpha zeigten, dass das Protein Fra1 die Adipozytenreifung in vivo und in vitro reguliert. Zusätzlich entwickelten die „doppel-mutierten“ fra1-tg/rsk2-/y Mäuse einen Lipodystrophy. Ein milderer Phänotyp wurde in den fra1-tg Tieren beobachtet, jedoch nicht in den Rsk2-knockout Mäusen. Zusätzlich wurde beobachtet, dass mesenchymale Zellen, welche Fra1 überexprimieren, gegen Glucocorticoid-induzierte Wachstumshemmung resistent waren. Diese Wirkung kann am wahrscheinlichsten durch die Fra1-vermittelte Suppression des Glucocorticoidrezeptors erklärt werden. Außerdem beeinflusste die Überexpression von Fra1 die Milzentwicklung. Leber und Herzanalysen zeigten, dass Fra1 kollagenhaltiges Gewebe induziert. Krankheiten wie Cholangitis und Fibrosen waren die Folge. / AP-1 transcription factor is a general name for multiple dimers formed by the association of Fos (or ATF) and Jun proteins. AP-1 acts as a sensor of changes in the cellular environment and thus, it is implicated in the modulation of cell proliferation, differentiation, transformation and cell death. Besides the well-documented role of c-Fos protein in oncogenesis, where this gene can function as a tumor promoter, AP-1 proteins are being recognized as regulators for mesenchymal stromal cell development and as regulators of immune cells. The mesenchymal stromal cells are the common progenitors for various mesenchymal lineages such as adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, myocytes and fibroblasts. AP-1 seems to play a key role in the control of mesenchymal cell fate decision and differentiation. This is suggested by phenotypes of mice with a genetic modifications in either the Jun or the Fos component of AP-1. In particular, mice overexpressing the Fos-related antigen-1 (Fra1) or the short isoform of FosB (deltaFosB) have been found to develop osteosclerosis due to an accelerated differentiation of osteoblasts. Interestingly, mice overexpressing deltaFosB also developed less fat tissue. The activity of Fos proteins can be regulated by post-transcriptional modification. Based on knockout mouse model, a role for the growth factor regulated kinase Rsk2 was proposed in the differentiation of mesenchymal stromal cells to osteoblasts as well as in fat tissue development. Goal in this study was to identify the molecular mechanisms explaining the differences between the wild type, fra1-tg, rsk2-deficient and fra1-tg/rsk2-deficient phenotypes. The comparison of the bones of the different mice genotypes revealed, that Fra1 and Rsk2 were independently regulating bone metabolism. Quantitative analysis of adipocyte markers expressions, like PPARgamma and C/EBPalpha revealed, that Fra1 overexpression was blocking adipocyte maturation in vivo and in vitro. Moreover, the in vivo results show that the fra1-tg/rsk2-/y mice develop a severe lipodystrophy. A milder phenotype was observed in the parental fra1-tg strain but not in the Rsk2 knockout strain. Additionally, it was been observed, that mesenchymal cells overexpressing Fra1 were resistant to glucocorticoid-induced growth inhibition. This effect can most likely be explained by Fra1-mediated downregulation of the glucocorticoid receptor. Furthermore, Fra1 overexpression influenced spleen development. Liver and heart analyses showed that Fra1 overexpression induced collagen tissue. Diseases like cholangitis and fibrosis were the outcome.

Transkriptionelle Netzwerke (Transkriptionsfaktoren, epigenetische Modulatoren und spezifische Zielgene) stellen die unterste Ebene der zellinternen Signalübertragung dar. Eingebettet in verschiedene stimulusabhängige Signalwege bedienen sich ihre Komponenten genetischer und epigenetischer Mechanismen, um Zielgene transkrip-tionell zu regulieren und Veränderungen der Chromatinstruktur hervorzurufen. In der vorliegenden Arbeit wurde die hierarchische Organisation und Zusam-mensetzung des MEK-ERK-abhängig gesteuerten transkriptionellen Netzwerks und seine Veränderung im Zuge der HRAS-vermittelten onkogenen Transformation von HA1-Zellen untersucht. Viele Arbeiten haben sich bereits eingehend mit der Charak-terisierung einzelner Komponenten und Zielgene beschäftigt (Wagner et al. 2005, Reddy et al. 2002, Sun et al. 2006, Kapitel 1). Im Unterschied zu den zitierten Studien wurde in der vorliegenden Arbeit ein umfassendes Protokoll zur genomweiten De-chiffrierung transkriptioneller Netzwerke unter Kombination von experimentellen und bioinformatischen Methoden entwickelt und durchgeführt. Die Analyse ge-nomweiter Expressionsprofile un- und U0126-behandelter immortaler und HRASV12-transformierter humaner Nierenepithelzellen (HA1EB, HA1ER) erlaubte die Identifi-zierung von 138 auf- und 103 abregulierten genspezifischen IDs der RAS-ERK-abhängig gesteuerten Signalkaskade. Regulierte Transkriptionsfaktoren wurden i-dentifiziert und im Westernblot, sowie zum Teil mittels Durchflusszytometrie und RT-PCR validiert und nachfolgend transienten siRNA-Experimenten unterzogen. Für die Transkriptionsfaktoren ELK3, SRF und den hierarisch darunter liegenden Faktor FRA1 wurden Expressionsprofile der spezifischen siRNA-vermittelten Hemmung in beiden Zelllinien erstell und mit bioinformatischen Methoden (TRAP, GSEA-GO) a-nalysiert um direkte und indirekte sowie gemeinsame Zielgene zu ermitteln. Zusätz-lich wurde der Effekt auf phänotypischer Ebene (Softagar, MTT) überprüft. In der vorliegenden Arbeit ließ sich keine direkte Hierarchie der drei Transkrip-tionsfaktoren SRF, FRA1 und ELK3 bestätigen. Allerdings konnte zum ersten Mal eine gemeinsam regulierte Gruppe von Genen identifiziert werden, die darauf schließen lässt, dass die drei Transkriptionsfaktoren sowohl in HA1EB, als auch in HA1ER Teile eines gemeinsam regulierenden Netzwerks sind. Aus den Proliferationsexperimenten wurde zudem bestätigt, dass jeder Transkriptionsfaktor individuell eine essentielle Rolle bei der Promotion maligner Eigenschaften spielt. Für alle drei Transkriptionsfak-toren konnte eine RAS-abhängige starke Verschiebung der spezifisch angesteuerten Gene nachgewiesen werden. Diese Verschiebung wurde mittels TRAP und GSEA auch für alternative Regulatoren der spezifischen Zielgene festgestellt. Die nähere Analyse der FRA1-abhängigen Zielgene führte zu neuen Erkenntnis-sen zur Umordnung des Transkriptoms im Zuge der onkogenen Transformation. Die FRA1-spezifischen Zielgene in HA1EB und HA1ER weisen unterschiedliche Funktio-nalitäten auf. So wurden in HA1EB viele Gene identifiziert, die im Rahmen der Im-munantwort eine Rolle spielen und in HA1ER nicht reguliert werden. In den RAS-transformierten HA1ER konnten dagegen Gene identifiziert werden, die in der Tu-morprogression eine Rolle spielen (FRA1, STAT3, MTA1, TCFL5). Die Verifizierungen mittels qPCR und ChIP bestätigten 5 der 38 möglichen FRA1-Zielgene. Von diesen, FRA1, AEBP1, FRA1, TCFL5, NPAS2 und YWHAZ ist lediglich FRA1 bereits als FRA1-Zielgen beschrieben. Die Funktionen der neu identifizierten RAS-abhängigen FRA1-Zielgene untermauerten bereits bekannte Funktionen der FRA1-vermittelten Transkription (Differenzierung, Proliferation, zirkadiane Rhythmen, Apoptose) und erweitern sie um verschiedene Aspekte wie Metabolismus und Rückkopplungen in die Signaltransduktion, die noch nicht für die RAS-abhängige FRA1-vermittelte Transktiption beschrieben worden sind. Dazu gehören unter anderem Interaktionen mit TGFbeta, WNT, JAK/STAT und JNK. Daneben sind in den HA1ER eine Vielzahl von Regulatoren des RHO-Signalwegs identifiziert worden, was für FRA1 auf bisher unbekannte Interaktionen mit RAC/RHO-Signalwegen schließen lässt. / Transcriptional networks represent the final level of internal signal transmission. They are embedded in different signalling pathways and use genetic as well as epi-genetic mechanisms to regulate their according target genes. During oncogenic trans-formation they are undergoing massive rearrangements in composition, regulation and interaction. This leads to radical changes in the transcriptome and drives the on-cogenic phenotype of the according cells. My thesis employs the composition of the MEK-ERK-dependent transcriptional net-work and its alteration during the HRAS-oncogene-mediated transformation in HA1-cells. By commencing from already known components: SRF, Ternary Complex Fac-tors (TCF: SAP1, SAP2/ELK3, ELK1) and members of the AP1-complex (JUN, FOS-proteins) I analyzed the alteration in expression of secondary targets and their inter-action as well as their relation to the superior factors. Therefore I compared genome wide expression profiles (Affymetrix, HG-U133A) of immortal HA1EB and HRASV12-oncogene-transformed HA1ER-cells with and without U0126-induced MEK/ERK-inhibition and extracted several MEK/ERK-dependent transcription factors. Among them where FRA1 and ELK3, two transcription factors already known to be involved in oncogenesis and proliferation associated processes. ELK3 needs SRF as crucial binding partner to function. Therefor I also included SRF into the subsequent analysis. The three transcription factors function in different time-dependent hierarchy states so we supposed a putative hierachical network be-tween them. I established transient knockdown cells deriving from HA1EB and HA1ER for all three transcription factors and generated further expression profiles from them. Additionally I verified the importance of these transcription factors on survival and proliferation via MTT and Softagar experiments. Using different statis-tically and bioinformatical methods (GSEA, TRAP) in collaboration with the Max-Planck-Institute for molecular Genetics Berlin, several direct and indirect targets of these transcription factors were predicted. These were partially overlapping in all transcription factors. Also, in comparison of the immortal and the transformed cell line, a shift of functionalities and composition of the different target gene populations and collaborating factors could be detected for all three transcription factors. It was found that in HA1EB FRA1 seems more likely to regulate immunresponsive genes as well as genes associated with the cytoskeleton and nucleus organisation whereas in HA1ER FRA1 regulates a large group of transcription- and signalling-associated genes. Additionally it could be shown that in both cell lines FRA1 regulates genes in-volved in epigenetic processes as well as circadian rhythms which are known to be important aspects in oncogenic transformation. I verified 37 different putative target genes of FRA1 using qRT-PCR (Taqman) and partially also ChIP-analysis. Of these 37genes, 5 were fully validated as directly regu-lated targets of FRA1: FRA1, AEBP1, YWHAZ, NPAS2 and TCFL5. They imply functionalities connected to proliferation and differentiation (AEBP1, FRA1, TCFL5) as well as apoptosis (YWHAZ) cell cycle control and circadian rhythm (NPAS2, AEBP1), feedbacks into the signalling (YWHAZ, AEBP1) and metabolism (NPAS2, AEBP1). Summarised the work of this thesis contributes to the decipherment of the direct and indirect targets of the according transcription factors and strengthens the argument of a general and massive shift of the transcriptional network during oncogenic trans-formation of cells. The importance of all three transcription factors on the survival of genes could be proved via proliferation assays. Additionally the functionality of their according targets could be integrated into processes connected to oncogenic trans-formation.