Le xylème secondaire (appelé bois chez les arbres), est un tissu vasculaire caractérisé par la présence d'un composé phénolique caractéristique, la lignine qui confère hydrophobicité et résistance mécanique aux parois. La différenciation du xylème est un processus complexe qui fait intervenir plusieurs centaines de gènes dont l'expression doit être strictement régulée dans l'espace et dans le temps. Cette coordination spatiotemporelle très fine est assurée au niveau transcriptionnel par, des facteurs de transcription. Certains membres de la famille MYB sont par exemple connus pour réguler l' èxpression des gènes de la voie de biosynthèse des phénylpropanoides, incluant la lignine. Le but de mes travaux était de caractériser fonctionnellement deux facteurs de transcription MYB, EgMYBl et EgMYB2, isolés à partir d'une banque d'ADNe de xylème d'Eucalyptus gunnii. La majeure partie de mes résultats concerne la caractérisation d'EgMYBl qui phyl 0 génétiquement, fait partie du sous-groupe 4 des MYB R2R3. Ce sous-groupe comprend plusieurs répresseurs des gènes du métabolisme phénolique. Des expériences de co-expression in vivo dans le tabac appuient l'hypothèse qu'EgMYBl pourrait agir en tant que régulateur négatif de l'expression des gènes de la voie de biosynthèse de la lignine. Ce rôle potentiel en accord avec l'expression préférentielle d' EgMYB 1 dans le xylème de racines et de tiges d'Eucalyptus a été vérifié in planta chez des peupliers transgéniques. En réponse à la surexpression d'EgMYB1, le contenu en lignine du xylème secondaire des tiges est réduit. On note également une diminution ~u nombre de fibres de phloème, et des taux de ' transcrits des gènes de la biosynthèse de la lignine. De plus, des analyses transcriptomiques réalisées à partir d'ARNs de xylème et d'écorce de tiges de peupliers surexprimant EgMYBl met en évidence des classes de gènes sous-exprimés ou surexprimés. De nombreuses similitudes sont retrouvées avec les classes de gènes dérégulées chez les mutants affectés dans une des étapes de la voie de biosynthèse de la lignine, renforçant le rôle initialement proposé pour EgMYB1. Les peupliers surexprimant EgMYBl montrent également d'intéressants phénotypes foliaires qui ont été étudiés. La caractérisation fonctionnelle d'EgMYB2 réalisée chez des tabacs transgéniques surexpresseurs, nous a amenés à proposer un rôle d'activateur transcriptionnel de la voie de biosynthèse des lignines. Les résultats- 1 - présentés dans cette thèse, apportent des indications claires quant aux rôles opposés des facteurs de transcription EgMYBl et EgMYB2 dans la lignification lors de la fonnation du bois.- 11

Chez les arbres, la formation du bois dépend de la différenciation d'un tissu vasculaire appelé xylème secondaire. Les parois cellulaires du xylème sont riches en lignines, ce qui leur confère rigidité et imperméabilité indispensables au transport de la sève brute et au maintien du port dressé. La xylogénèse requiert la coordination de l'expression de plusieurs centaines de gènes dans le temps et dans l'espace. Cette coordination est assurée au niveau transcriptionnel par différents médiateurs protéiques, parmi lesquels il y a des facteurs de transcription de la famille MYB-R2R3. Peu de gènes de cette sous famille ont été préalablement caractérisés chez les conifères. Mon travail de thèse a consisté dans un premier temps à identifier plusieurs gènes MYBR2R3 potentiellement impliqués dans la formation du xylème chez les conifères, en particulier chez le pin loblolly (Pinus taeda) et l'épinette blanche (Picea glauca), et à réaliser leur caractérisation moléculaire. Différentes analyses phylogénétiques ont permis de mettre en évidence des similarités et des différences significatives dans la structure de cette famille entre les gymnospermes et les angiospermes. L'expression de ces mêmes gènes a été quantifiée par RT-QPCR, ce qui a révélé que PgMYB2, 4 et 8 sont préférentiellement exprimés dans le xylème secondaire de l'épinette et que leurs transcrits s'accumulent dans le bois de compression. La deuxième partie de mon travail a visé la caractérisation fonctionnelle de deux MYB-R2R3 de pin (PtMYBl et 8) réalisée via leur surexpression constitutive chez des transformants stables d'épinette. Ces deux facteurs MYB induisent une lignification ectopique cependant plus intense avec PfMYB8, qui bloque le développement normal des racines et conduit à la mort des plantules in vitro. L'analyse du transcriptome des plantules transgéniques par biopuces à ADN a dévoilé entre autres, l'augmentation de l'expression des gènes de la synthèse des lignines. La dernière partie de ma thèse est consacrée à la caractérisation fonctionnelle de PtMYBM placé en parallèle sous le contrôle d'un promoteur constitutif et d'un promoteur préférentiel du xylème (gène codant l'alcool cinnamylique deshydrogénase). Les plantules transgéniques ont une synthèse accrue de plusieurs terpènes et produisent de nombreux transcrits potentiellement associés aux mécanismes de défense. / In trees, wood formation depends on the differentiation of a vascular tissue refered to as secondary xylem. Xylem cell walls are rich in lignins, which confer stiffness and impermeability, properties essential for the mechanical support of the tree and for the transport of water and minerals. Xylogenesis requires the coordinated expression of several hundred genes in time and space. The regulation of gene expression is controled at the transcriptional level by different protein mediators, including transcription factors of the R2R3-MYB family. Hitherto, very few genes of this sub-family have been characterized, specially in conifers. The first part of my thesis consists in the identification and molecular characterization of several genes belonging to this family and potentially involved in xylem formation in conifers, particularly in loblolly pine (Pinus taeda) and white spruce (Picea glauca). Phylogenetic analyses highlight the major similarities as well as significant differences in the MYB family structure between gymnosperms (trees) and angiosperms (herbaceous plants and trees). I used qRT-PCR to determine transcript levels of these genes and assess their expression profiles in spruce. The data showed that the spruce transcripts for PgMYB2, 4 and 8 accumulate preferentially in secondary xylem and are upregulated in compression wood. The second part of my work aimed the functional characterization of two pine R2R3-MYB (PtMYBl and 8) via their constitutive overexpression in stable spruce transformants. The overexpression of both of these MYB transcription factors led to ectopic lignification. However, the overexpression of PtMYB8 led to a more intense lignification; it also prevented normal root development leading to the death of the in vitro plantlets. Microarrays analyses of the transgenic plantlets showed that there was a significant upregulation of many lignin biosynthesis genes, among others. The final section of my thesis describes the functional characterization of PtMYB14 based on its overexpression with either a constitutive promoter or a xylem-preferential promoter (gene coding for the cinnanyl alcohol dehydrogenase). Both types of transgenics plantlets accumulated several terpenes compounds and produced numerous transcripts potentially involved in defence mechanisms.

Lors d’une blessure chez l’épinette blanche, le facteur de transcription MYB14 et certains gènes de la voie de biosynthèse des isoprénoïdes (voie MVA) sont surexprimés. De plus, des plantules d’épinette blanche transgéniques surexprimant le gène PtMYB14 accumulent elles aussi des transcrits de gènes faisant partie de la voie MVA. Ainsi, MYB14 pourrait être un régulateur transcriptionnel potentiel de cette voie métabolique (Bedon et al. 2010). Ce mémoire cible la régulation potentielle du gène de la 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthétase (HMGS), une enzyme de la voie MVA, par MYB14. Nous avons 1) isolé et caractérisé la région promotrice de Hmgs, 2) testé si MYB14 se lie directement au site découvert dans ce promoteur et 3) vérifié si MYB14 peut influencer positivement la transcription de Hmgs. Ce projet de maîtrise a permis de découvrir une nouvelle fonction pour un facteur de transcription de la famille des R2R3-MYB soit la régulation de la voie de biosynthèse des isoprénoïdes.

Notre objectif était de mieux comprendre la régulation de la biosynthèse des parois secondaires lors de la formation du bois chez l'Eucalyptus, le feuillu le plus planté au monde et le deuxième dont le génome est séquencé. Nous avons caractérisé trois facteurs de transcription de la famille MYB-R2R3 et montré que EgMYB137 était un nouveau régulateur de la biosynthèse des parois secondaires. Nous avons aussi démontré que l'activité transcriptionnelle de EgMYB1, un répresseur de la biosynthèse des lignines, était régulée par une interaction protéine-protéine impliquant une histone linker (EgH1.3). Enfin, nous avons mis au point une méthode de transformation homologue chez l'Eucalyptus via A. rhizogenes. Les " hairy roots " transgéniques sont adaptées à la caractérisation fonctionnelle de gènes reliés à la formation du xylème. Nos résultats ont permis de découvrir de nouveaux acteurs impliqués dans la régulation des parois secondaires, mettant en lumière la complexité de ce processus mais aussi offrant de nouvelles perspectives pour l'amélioration du bois pour des applications industrielles comme la production de bioéthanol de deuxième génération. / Our objective was to better understand the regulation of the biosynthesis of the lignified secondary cell walls during wood formation in Eucalyptus, the most planted hardwood tree, and the second whose genome has been sequenced. We functionally characterized three Eucalyptus transcription factors of the R2R3-MYB family and identified EgMYB137 as a new regulator of secondary cell wall deposition. We also showed that the transcriptional activity of EgMYB1, a repressor of lignin biosynthesis was modulated by protein-protein interactions involving a linker histone (EgH1.3). Finally, we set up a homologous transformation system for Eucalyptus using Agrobacterium rhizogenes. The transgenic hairy roots are suitable for high throughput functional characterization of cell wall-related genes. Our findings not only allowed getting new insights into the complexity of the network regulating secondary cell walls but also open new avenues to improve wood quality for industrial applications such as second-generation bioethanol.